溶瘤病毒的制作方法

本发明涉及癌症治疗。特别地，本发明涉及用于癌症治疗的溶瘤性痘苗病毒和病毒载体。

背景技术：

尽管微创手术、超分割放疗和化疗药物新组合方面取得了进展，但是许多类型的实体瘤患者的存活率仍保持不变。溶瘤病毒是治疗对常规治疗有抗性的癌症的一种有吸引力的治疗剂。溶瘤病毒是能够特异性靶向并杀死癌细胞的病毒。此外，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号。

痘苗病毒是双链DNA病毒，其具有许多使其具有溶瘤治疗吸引力的候选项的特征。其能够快速复制，有效扩散到肿瘤以及强溶解能力。此外，痘苗已经得到广泛研究，并且具有被清楚理解的分子生物学，具有高克隆能力和多种商业可用的天然和合成启动子，使其成为携带异源核酸序列的载体的理想选择。痘苗具有良好的安全性，并且容易获得对不受控制的感染的治疗。此外，通常在实体瘤中发现的缺氧微环境，不利于许多类型的溶瘤病毒的复制和发挥功效，但不会对痘苗病毒的复制和功效不利。

已报道了溶瘤痘苗病毒的几种菌株，例如Western Reserve，Wyeth和Lister菌株。已经创建了每一种所述菌株的各种缺失突变体。McCart等人(Cancer Res.2001,61；8751-8757)描述了一种在胸苷激酶(TK)基因和病毒生长因子(VGF)基因中具有缺失的Western Reserve(WR)株。这些缺失突变体能够有效地交叉触发针对肿瘤抗原的免疫系统。然而，生物分布研究表明，其在正常卵巢组织中具有显著病毒滴度而在骨髓中则较小，提高了痘苗病毒治疗后发生不育和骨髓抑制的预期。Hung等人(Gene Therapy,2007,14；20–29)描述了一种TK缺陷型痘苗Lister菌株。然而，观察到该菌株还在卵巢肿瘤之外的正常卵巢中定位。

将异源基因例如细胞因子编码基因插入病毒中，可以进一步驱动免疫应答。然而，细胞因子的插入可以通过早期病毒清除来降低病毒复制功效。这确实已用”武装”有一些免疫调节基因如IL-2，IL-15，TNF和CD40配体的痘苗病毒在体内观察到。

尽管溶瘤病毒领域已经取得了进展，但是市场上尚无基于痘苗的治疗产品。因此，需要更有效的溶瘤性痘苗来治疗癌症。

技术实现要素：

本发明提供改进的溶瘤性痘苗病毒。本申请的发明人惊奇地发现，在肿瘤组织中，具有失活的N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒株显示出比现有技术更强的选择性和抗肿瘤功效。本发明还提供了痘苗病毒载体。

具体实施方式

本发明的第一方面提供了包含至少三种痘苗病毒启动子的核酸序列，其中所述至少三种启动子以相同取向位于核酸序列中。

线性DNA具有两种可能取向：5'至3'方向和3'至5'方向。例如，如果一个启动子位于5'至3'方向，并且如果第二启动子也位于相同多核苷酸分子/链内的5'至3'方向，则两个启动子的位置具有相同取向。

核酸序列可以是天然的、合成的或重组的。它可以是例如cDNA、PCR产物或基因组序列。其可以是分离的，或作为质粒、载体或宿主细胞的一部分。质粒是具有独立于染色体DNA复制的能力的环状染色体外DNA分子。

质粒可用于将表达盒导入宿主细胞。质粒也可以用于在宿主细胞中表达多肽。例如，可以用能够编码特定多肽的质粒转染细菌宿主细胞，以便表达该多肽。该术语还包括能够容纳DNA更长部分的酵母人工染色体和细菌人工染色体。

启动子是具有可启动特定基因转录的特异性序列的DNA区域。用于在痘苗中表达异源基因的启动子，包括控制早期和晚期转录活性的启动子，例如mH5、H5、P7.5和PE/L。本申请所述的异源基因，是病毒中通常不存在的基因。修饰的H5启动子(mH5)主要具有早期活性，且具有比天然存在的H5更高的稳定性。优选地，所述至少三个启动子是mH5。

在本发明的优选实施例中，启动子包含与图1所示序列基本上同源的核苷酸序列。具有大于20％一致性(例如25％，30％，40％，50％60％，70％，80％，90％，95％或99％)则认为是同源序列。如本申请所述，基本上同源是指表现出至少60％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，96％，97％，98％，99％％或更高的一致性。在本发明的一个实施例中，所述序列与如图1中所示的序列集具有至少80％或更高(例如，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％等)的一致性。

如本申请所使用的术语同源性和一致性是可互换的。

用于确定同源性的序列比较，可以使用容易获得的序列比较软件来进行。示例包括但不限于BLAST(参见Ausubel et al.,1999Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed-第18章)和FASTA((Altschul et al.,1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubel et al.,1999,Short Protocols in Molecular Biology，第7-58至7-60页)。

在第一方面的一个实施例中，核酸序列存在于载体中。如本申请所述的载体是指，用于将核酸序列引入细胞或病毒中以进行表达或复制的构建体。其是指重组构建体，例如质粒、病毒或能够在引入细胞或病毒后表达或复制核酸序列的任何其它构建体。

第一方面的核酸序列可以是表达盒的一部分。表达盒是载体的一部分。其包含启动子、开放阅读框和3'非翻译区。

在本发明的一个实施例中，痘苗病毒载体包含与图2所示序列具有至少80％或更高(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同源性的核苷酸序列。

在本发明的另一个实施例中，核酸序列编码异源多肽。

本申请所述的多肽，是指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。其可与蛋白质、肽、寡肽互换使用，并且包括糖蛋白及其衍生物。术语“多肽”还旨在涵盖保有与原始多肽相同生物学功能或活性的多肽类似物和衍生物。

如本申请所述的异源多肽是指，通常不由天然病毒表达的任何多肽。异源多肽可以是生物活性的。如本申请所述的生物活性多肽，是指具有生物学功能或活性的多肽。

在本发明的一个实施例中，生物活性多肽是治疗性的。治疗性多肽是已经或正在开发的用于治疗用途的多肽。治疗性多肽的示例包括但不限于细胞因子，趋化因子和生长因子。

细胞因子可以是免疫调节剂，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36)、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ和INF-ω)、肿瘤坏死因子(TNF)和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在本发明的一个实施例中，多肽是白细胞介素。在本发明的优选实施例中，多肽是IL-12。IL-12可以来自任何动物，例如人(hIL-12)、小鼠(mIL-12)、马、牛、猪等。它可以是天然的或重组的。优选地，编码IL-12的核苷酸序列是全长IL-12基因。在其它实施例中，核苷酸序列编码全长基因的30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％基因。在本发明的另一个实施例中，该多肽是GM-CSF，或该多肽可以是IL-21。如上所述的涉及IL-12的所有特征应比照适用于GM-CSF和IL-21。

本申请所称的IL-12，包括IL-12A(例如GenBank索引号AF404773.1GI:15128214)和/或IL-12B(例如GenBank索引号AY008847.1GI:11192034)。两个亚基均包括在成熟IL-12蛋白中。本申请所称的IL-21包括同种型1(例如GenBank索引号NP_068575.1GI:11141875)和/或同种型2(GenBank索引号NP_001193935.1GI:333033767)。本申请中所称的GM-CSF包括GenBank索引号AF373868.2GI:14278709。通常，所述序列是人序列。

异源多肽也可以是报告子多肽。如本申请所述的报告子多肽是指其表达可指示宿主细胞或病毒中所存在的核酸序列、表达盒或载体的多肽。报告子多肽的示例包括但不限于荧光多肽、化学发光多肽、生物发光多肽、磷光多肽以及酶。

在本发明的一个实施例中，报告子多肽是荧光多肽。荧光多肽包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白及其衍生物。

限制性位点是由限制酶识别和切割的特异性核苷酸序列。限制酶的示例为SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI。BamHI限制性位点是由BamHI识别的限制性位点。其他酶的限制性位点亦类似命名。

在本发明的一个实施例中，核酸序列或载体包含一个或多个限制性位点。本发明的优选实施例是包含SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI限制性位点的核酸序列或载体。

在本发明的一个实施例中，核酸序列或载体包含在痘苗病毒中。在本发明的一个具体实施例中，核酸序列具有图3所示的通式。

痘苗已经进化出了许多策略来回避宿主免疫系统。例如，病毒分泌许多蛋白质来抑制参与宿主抗病毒反应的细胞因子和趋化因子。这样的蛋白质之一是N1基因产物N1L，其被认为抑制感染细胞的凋亡以及NF-kB活化。NF-kB是控制参与病毒清除的许多细胞因子的产生的转录因子。已发现N1L基因缺失会导致由NF-kB控制的促炎抗病毒细胞因子(例如IL1β、TNFα和IFNα/β)的增加。还发现N1L能调节自然杀伤(NK)细胞反应。NK细胞通常是病毒感染的宿主防御第一前线。已发现N1L缺失会诱导NK细胞局部活性提高。与这些发现一致，Bartlett等人(J General Virology,2002,83:1965-1976)发现，与野生型VV毒株相比，N1L缺失的Western Reserve痘苗病毒株通过宿主免疫应答更快速地清除。如本申请所述的免疫应答是指免疫系统对外来物质的反应。

本发明的第二方面，提供了包含第一方面的核酸序列或载体的痘苗病毒，其中所述核酸序列插入到N1L基因中。

将核酸序列插入靶序列可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如，描述于Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,by J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis(2003),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Virology Methods Manual,edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro(1996)Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors.Current Protocols in Molecular Biology,published by John Wiley and Son(1998),Chapter 16中的方法。在本发明的一个实施例中，通过同源重组将核酸序列插入N1L基因中。

本发明的第三方面，提供了包含失活N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒。

存在多种痘苗菌株，对人和动物具有不同的毒力水平。作为50年代天花根除计划的一部分，在世界各地曾使用过多种病毒株。在世界不同地区使用过不同的菌株，例如，纽约市健康委员会(NYCBOH)菌株及其衍生物Wyeth在美国广为应用，而哥本哈根(CPN)和Lister菌株则在欧洲占主要地位。在第三方面的一个优选实施例中，所述痘苗病毒株是Lister。

如本申请所述的TK缺陷型痘苗病毒是指具有缺乏内源性胸苷激酶(TK)的表型的痘苗病毒。TK缺陷型痘苗病毒依赖于宿主细胞产生的胸苷激酶。胸苷激酶在肿瘤细胞中组成型产生，但在正常细胞中不产生。因此，缺乏TK的痘苗病毒可以在肿瘤细胞中选择性存活，特别是在EGFR/Ras/ERK途径激活的情况下下。宿主细胞是病毒可以感染的任何细胞。

在本发明的一个实施例中，缺乏TK的痘苗病毒包含失活的N1L基因。如本申请所述的失活，是指在转录水平或转录后水平上的基因沉默，基因缺失，基因中的突变，通过插入核酸序列或任何使得病毒不能产生功能完全的基因产物的其它方法来破坏基因。基因的失活可以是部分或完全的。在本发明的一个实施例中，N1L的失活是通过插入核酸序列。可以通过同源重组进行插入。

插入的核酸序列可以包含在载体或表达盒中。

在本发明的一个实施例中，核酸序列编码异源多肽。异源多肽可以是生物活性的。在本发明的一个实施例中，生物活性多肽是治疗性的。

在本发明的一个实施例中，核酸序列编码RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化性DNA等。在另一个实施例中，核酸序列编码了辐射和/或化疗敏化剂。

在第四方面，本发明提供了包含如本发明第三方面所述的TK缺陷型痘苗病毒的组合物。在如第四方面所述的本发明的一个实施例中，所述组合物任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

所述组合物可以适于通过任何合适的途径给药，例如通过口服(包括口腔或舌下)、局部(包括口腔、舌下或经皮)或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、胸膜内、眼内、心内、腹膜内或皮内)途径。

适于肠胃外给药的药物组合物包括：水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液基本等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。

可用于注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以以冷冻干燥(冻干)条件储存，使用前只需要立即加入所携带的无菌液体例如注射用水即可。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、香料、盐(本发明的物质本身可以提供为药学上可接受的盐的形式)、缓冲剂或抗氧化剂。除了本发明的物质之外，它们还可以含有治疗活性剂。

在第五方面中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括向对象以治疗有效量施用包含编码异源多肽的载体或核酸序列的缺乏TK的痘苗病毒，其中所述病毒还包含失活的N1L基因。

如本申请所述，对象是指动物，包括人。动物可包括小鼠、大鼠、家禽例如鸡、反刍动物例如牛、山羊、鹿、绵羊和其它动物，例如猪、猫、狗，和灵长类例如人、黑猩猩、大猩猩和猴。

治疗有效量是足以诱导溶瘤作用的剂量。用于递送和施用的剂量可以是基于当前现有的方案、根据经验确定、使用动物疾病模型或可选地在人类临床试验。初始研究剂量可以基于本申请所述的动物研究，例如小鼠。剂量可以变化并且取决于治疗是预防性还是治疗性、治疗所针对疾病的类型、发作、进展、严重性、频率、持续时间或概率，期望的临床终点、先前或同时的治疗，总体健康、年龄、性别、对象的种族或免疫能力，和本领域技术人员理解的其它因素。根据治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其它风险因素和对象的状态，可以按比例增加或减少剂量、数量、频率或持续时间。本领域技术人员将理解可能影响提供足以提供治疗或预防效用的量所需的剂量和时间的因素。

在第五方面的一个实施例中，所述方法还包括对对象施用另外的癌症治疗。本申请所述的癌症治疗是指通过任何医学或物理手段治疗癌症的疗法。额外的癌症治疗可以是化疗、生物治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、抗血管治疗、冷冻治疗、毒素治疗和/或手术，包括其组合。

本申请公开的本发明的方法和用途，可以在对象已经被鉴定为作为需要治疗的目标疾病之后立即或数天、数月或数年进行。

所述方法包括以不同的时间安排施用所述病毒。可以在1、2、5、10、15、20或24小时的时间段内向对象或肿瘤施用单剂量的病毒。病毒可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或数周内施用。注射之间的间隔可以是1、2、3、4、5、6、7天或数周。通常，将多个剂量施用于相同的一般目标区域，例如在肿瘤附近，或在静脉内施用的情况下，在对象的血流或淋巴系统中的特定入口点。痘苗病毒载体可以施用2、3、4、5或更多次。痘苗病毒载体可以在以不同的时间安排和剂量，在切除肿瘤之前给予。

所述方法包括施用不同病毒浓度的病毒。在某些方面，给予对象至少5x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²或更多病毒颗粒或噬菌斑形成单位(pfu)，包括各值及其之间的范围。施用的病毒剂量可以是0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL或更多，包括所有值及其之间的范围。剂量可以随时间扩散或通过单独注射。

在某些实施例中，对象是患有癌症和/或肿瘤的人。癌症可以是胃肠癌，呼吸道癌，泌尿生殖道癌，造血癌，肉瘤，腺癌，鳞状细胞癌或非恶性肿瘤/增生。肿瘤可以是在治疗之前不可切除，而在治疗后可切除的。肿瘤可以是复发性、原发性、转移性和/或多重耐药性肿瘤。在某些方面，肿瘤位于胰腺上或胰腺中。在其它方面，肿瘤可以是神经内分泌肿瘤、内分泌肿瘤、外周中枢神经系统肿瘤、脑癌肿瘤、头颈癌肿瘤、食管癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝肿瘤、胸腺肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、膀胱肿瘤、直肠癌肿瘤、黑素瘤或乳腺癌肿瘤。

本发明公开的组合物和方法可用于不同类型的基因治疗，例如肿瘤抑制基因治疗、自杀基因治疗、病毒载体免疫策略、抗血管生成治疗、促凋亡基因治疗和基因替代治疗。“Oncolytic Viruses for Cancer Therapy：Overcoming the Obstacles”(Wong et al，Viruses 2010,2,78-106)通过引用全文并入本申请。

本发明中公开的组合物和方法可以与其它治疗手段或方法联合用于治疗癌症，例如手术、化学疗法、放射疗法、分子癌症治疗或另外的基因治疗，其可以用于施用与本申请所述的本发明核酸不同的基因。

本发明的第二和随后方面的优选方面如对于第一方面加以必要的变更

细胞系：使用的所有肿瘤细胞系均储存在发明人的实验室中，其来自ATCC或英国癌症研究细胞系服务单位(CancerResearchUKCelllineServiceUnit)或由合作者友好提供。通过STR测定法对所有人癌细胞系进行基因分型。在本研究中使用的鼠肿瘤细胞系包括：结肠直肠癌细胞系CT26，衍生自BALB/c毒株，而CMT93(结肠直肠)、LLC(Lewis肺癌)和B16-F10(转移性黑素瘤)则来源于C57BL/6菌株。SCC7是来自C3H/HeN小鼠的头颈癌衍生的鳞状细胞癌，并由OsamMazda博士(日本京都府立医科大学微生物系)捐赠，MOSEC是一种鼠卵巢癌细胞系。Panc02是化学诱导的鼠胰腺癌细胞系；DT6606(胰腺肿瘤)源自于C57BL/6株转基因小鼠，其在K-Ras条件下在胰腺中具有突变。这是DavidTuveson教授(CRUK，剑桥研究所，英国剑桥)的赠与。此外，我们的研究组此前用含有鸡卵白蛋白基因(DT6606-ova)的质粒稳定转染了DT6606细胞系。最后，CV1是从ATCC、VA、USA获得的非洲绿猴“正常”肾细胞系，并且用作促进病毒大量生产的储备细胞系以及所有病毒滴定测定。用于本发明的人癌细胞系包括：人胰腺癌细胞系SUIT-2、MIAPaCa2、PANC1、PT-45和Capan-2；人结肠直肠癌细胞系HT29、HCT116和SW620，胃腺癌MKN45和人卵巢癌细胞系A2780。

病毒：通过分别在合成的早期/晚期p7.5启动子的控制下，使用先前描述于Timiryasova TM et al.Biotechniques.2001；31:534,6,8-40中的体外细胞内重组技术，将lacZ报道子和萤火虫荧光素酶基因插入到痘苗病毒Lister菌株的TK区中，来构建VVL15。VVL15是TK缺陷的。WRLuc、TK缺失和WRDD，双缺失(TK和VGF)病毒，分别由Steve Thorne博士(美国匹兹堡大学)和A.McCart博士(加拿大多伦多大学)友情提供。

大规模病毒生产：将上述初级病毒扩增物迅速冻融两次，并稀释到感染含有CV1细胞(80-90％汇合度)的36-40个T175烧瓶所需的5％FCS CM中。48小时后，收获感染的CV1细胞，并通过以2000rpm的速度重复离心5分钟(在4℃)，收集为单一沉淀物。将沉淀物在PBS中洗涤，重悬于12ml的10mM Tris-HCl(pH9)缓冲液中，并储存在-80℃下以便稍后进行纯化。

病毒纯化：将浓缩的上述病毒裂解物悬浮液冻融两次，并转移至Dounce匀浆器(Thermofisher)并通过60次冲程匀浆。然后将其进行超声处理30秒。在4℃以2000rpm离心5分钟后，收集上清液(含有释放的病毒颗粒)并用10mM Tris-HCl缓冲液稀释至总体积为30ml。将溶液分成四等份；各在36ml Beckman超速离心管中轻轻地分层到17ml的36％葡萄糖溶液中，并在4℃下以13500rpm离心80分钟。将所得的沉淀重悬于总共16ml的10mM Tris-HCl中，再次分成四份，并小心地分层到另外四个葡萄糖梯度上，本次梯度为从各管表面附近的25％w/m到底部的40％。进行第二轮超速离心。必须如此才能进一步去除颗粒细胞碎片，所述碎片当静脉内施用到小鼠中时可能是毒性的。将最终沉淀重悬于1至4ml的病毒重悬浮缓冲液(PBS；10％甘油；138mM NaCl；pH 7.4)中。如下所述，通过TCID50测定法滴定纯化的病毒样品。

病毒复制：在具有10％FCS培养基的6孔板的三个孔中，根据生长速率，以2至4×10⁵个细胞/孔接种细胞，并且在16-18小时后，用1PFU/细胞的痘苗病毒感染。以24小时为间隔，一式三份地收获样品直至72小时。如Wang et al(J Clin Invest,2009,119:1604-1615)所述，通过TCID 50(50％组织培养感染剂量)检测病毒复制。

统计分析：除非另有说明，使用Graphpad Prism 5进行比较统计分析。使用未配对student t检验进行双重条件比较。对于多于一个条件或诸如时间的附加变量，分别进行单或双因素方差分析。用事后检验(对单因素ANOVA为Knewman-Keuls和对于双因素ANOVA为Bonferroni)比较实验内的特定条件对。存活数据表示为具有对数秩分析的Kaplan-Meier图，以描绘各组之间的任何差异是否具有统计学显著性。

现在将通过参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例仅用于参考目的，而不应解释为对本发明的限制。

参考多个附图，其中：

图1显示了修饰的痘苗启动子mH5序列。

图2显示了包含三个mH5启动子的表达盒序列。

图3显示包含根据本发明所述核酸序列的载体的通式。

图4显示了用于产生新VVL15N1L载体的VVL15N1L载体和N1L pShuttle质粒的示意图。载体命名如所示。长水平条描绘VV的双链DNA基因组。L024、N1L(L025)、L026和TK指代转录单位。

图5显示了VVL15N1L载体中N1L缺失的确认。

图6显示了VVL15和VVL15N1L载体在肿瘤组织(图6a)和位点外位置(图6b和6c)中的生物分布。

图7显示了VVL15N1L在不同细胞系中的复制。左图表示VVL15(实线)与VVL15-N1L(虚线)相比的复制曲线；而右图对应于VVL15-RFP(实线)与VVL15-N1L(虚线)的比较。

图8显示了与VVL15-RFP(实线)不同细胞系相比，VVL15N1L(阴影线)的细胞毒性效力。

图9显示了”武装”有mIL-12或mGM-CSF的VVL15N1L和VVL15N1L的细胞毒性效力。

图10显示了与生长停滞的SCC7细胞(图10a)和热灭活的VVL15(图10b)共培养并用VVL15，VVL15N1L或PBS处理的脾细胞中IFN-γ的产生。

图11显示了与DT6606-ova细胞(图11a)、卵白蛋白抗原(图11b)和B8R肽(图11c)共培养，并用VVL15、VVL15N1L或PBS处理的脾细胞中的IFN-γ产生。

图12显示在用VVL15，VVL15N1L或PBS处理后与生长停滞的LLC细胞(图12a)和B8R肽(图12b)共培养的脾细胞中IFN-γ的产生。

图13显示VVL15N1L在胰腺癌小鼠模型中的功效-用VVL15、VVL15N1L或PBS处理后的DT6606(图13a)和CMT-93(图13c)中的肿瘤生长速率，和在用VVL15，VVL15N1L或PBS处理后的DT6606(图13b)和CMT-93(图13d)侧翼肿瘤模型中的存活率。

图14显示了VVL15N1L在原位肺癌小鼠模型中的功效。图14a展示了PBS处理小鼠的个体重量分布，图14b展示了每组中小鼠的平均体重作为时间的函数、图14c和14d分别展示了相应的Kaplan-Meier存活曲线和存活中位值曲线。

图15显示了经VVL15RFP、VVL15N1L或PBS(图15a)的IT给药后的LLC肿瘤模型中的肿瘤体积，和处死时各处理组中的转移(图15b)。

图16显示DT6606侧翼模型中，用VVL15N1L、VVL15N1L-mIL-12、VVL15N1L-mGM-CSF或PBS(图16a)处理后的肿瘤生长和相应的Kaplan Meir存活曲线(图16b)。

图17显示了以IL-21”武装”的VV的体外评估。

图18显示了VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和对照病毒VV-ΔTkΔN1L的抗肿瘤功效。

图19显示了人IL-12A、IL-12B、IL-21同种型1，IL-21同种型2和GM-CSF的序列。

实施例

实施例1：pUC19-N1L穿梭载体的构建和

本发明人构建了如图3所示的pUC19-N1L穿梭载体，其包含侧翼为含有L024和31bp的L025片段(左臂)、含有22bp的L025以及L026的片段(右臂)的特异性表达盒。所述表达盒具有以下特征：(1)存在三个痘苗病毒mH5启动子，并且在每个启动子下有用于容易插入任何目的基因的克隆限制酶位点；(2)报告基因RFP由一个mH5启动子驱动，用于重组病毒的阳性选择；(3)mH5启动子仅驱动插入基因从左到右的表达。本发明中使用的同源重组策略设计为，代替L025(N1L)基因座的几乎整个编码序列。在L024/25和L025/26的连接处的序列分析，证实了L025的上游(22bp)和下游(31bp)的ORF保持完整。

使用标准技术将m-GM-CSF、h-GM-CSF、m-IL12和h-IL12的cDNA克隆到载体中，用于在mH5启动子的控制下表达，使用合适的限制酶来合成pUC19超级穿梭载体。

实施例2：VVL15N1L的构建

图4描述了本发明人制备的痘苗病毒Lister菌株和各种痘苗病毒构建体。将每个pUC19超穿梭载体转染(使用基于Effectene的方案Qiagen)到已经用VVL15(每个细胞0.1PFU)预感染(2小时前)的CV1细胞中。48小时后，荧光显微镜下红色荧光的存在证实了相关盒的表达，其来自胞质质粒或来自相对少的已经成功同源重组的病毒。后者如下选择。通过从培养皿刮取细胞并冷冻-融化两次来收获细胞和上清液。将1μl该裂解物用于感染含有生长至80-90％汇合度的CV1细胞的6孔板的所有6个孔。这种低病毒载量将确保产生分离良好的斑块。

再过48小时后，在荧光显微镜下仔细检查每个孔，寻找发出红色荧光的病毒诱导噬菌斑。在鉴定阳性集落时，用细尖的永久性标记物在板的下表面上标记其位置。从孔中吸出培养基后，用填充有5ul 5％FCS CM的20μl尖端小心挑取菌落。然后将尖端浸入含有250μl 5％FCS CM的冷冻管中。在进一步的冻融循环后，如前所述将5-20μl该病毒溶液加入到含有CV1细胞的新6孔板的每个孔中。重复该过程，直到每个噬菌斑发出红色荧光，即所有病毒菌落都是源于重组病毒。一般来说，需要4-8轮噬菌斑纯化以获得一批纯净的重组病毒。此时，刮取收集病毒裂解物，并通过基于柱的系统(即来自Qiagen的Blood Mini Kit)提取病毒DNA。还通过ELISA测试了上清液样品中相关细胞因子的存在。病毒的纯度通过来自提取病毒DNA的N1L基因的PCR扩增来确认。其存在将表明亲本病毒VVL15的污染。

一旦初步研究证实可能产生表达相关转基因的纯重组病毒，将50μl病毒裂解物加入到含有CV1细胞的T175烧瓶中，再次在约30ml 5％FCS CM中生长至80-90％汇合。48小时后刮取细胞和培养基，并将其作为“初次病毒扩增物”保存。

实施例3：确认重组VVL中N1L的缺失：

所有新型VVL重组体中缺失N1L基因(图5a)。使用正义和反义N1L基因引物，通过PCR扩增提取自感染的CV1细胞的病毒DNA。只有VVL15病毒含有该基因。预期含有跨越引物对的区段的N1L基因测量为约750bp。A52R基因存在于所有VVL重组体中。使用正义和反义A52R基因引物，从提取自感染的CV1细胞的DNA中，经PCR扩增该基因座。跨越引物对的A52R基因区段预期测量为大约880bp(图5b)。

实施例4：验证来自N1L基因缺失的重组VVL的转基因表达：

根据厂商方案(ebioscience，Biolegend)，使用相关细胞因子特异性ELISA试剂盒，分析来自每个转基因”武装”的重组病毒的最终噬斑纯化循环的上清液样品。为了评估每种细胞因子转基因在肿瘤细胞感染时是否由相关重组病毒表达，进行与上述病毒复制测定相同的实验装置。在病毒感染后24、48和72小时内，从每组重复的孔收集上清液，并根据制造商的说明书通过ELISA测定细胞因子的浓度。对照样品是从VVL15-N1L感染的孔收集的上清液。

实施例5：评估VVL15N1L载体的病毒生物分布

将含2x10⁶CT26细胞的100μl无血清DMEM皮下注射到7周龄雌性BALB/c小鼠的剃毛右胁腹中。当肿瘤约100mm³时，将其随机分成两组。通过尾静脉注射1×10⁸PFU IV剂量的VVL15或VVL15-N1L。在病毒注射后的第1、3、7和10天，通过吸入CO₂处死来自每组的3只小鼠。通过心脏穿刺将血液收集到预先肝素化的1.5ml Eppendorf管中。将这些与收获的肿瘤、脑、肺、肝、脾、肾和卵巢一起快速冷冻在漂浮在预冷(至-80℃)异戊烷的培养皿上。稍后，将它们解冻、称重并在无血清DMEM中匀浆(或在血液的情况下涡旋)。用5μl/mg(或5μl/μl血液)的体积稀释样品。在进一步的冻融循环后，随后使用TCID50测定法滴定组织匀浆，用于后续的活病毒PFUs。

进行生物分布实验以确定IV递送的病毒是否扩散到肿瘤，并测定任何脱靶复制(即，确定肿瘤的选择性程度，从而确定安全性)。如方法部分所述，将CT26皮下侧腹模型用于该切片。在尾静脉注射后，可以从肿瘤组织中回收这两种病毒，直到注射后至少10天。峰滴度在3至7天之间。出乎意料地，与VVL15相比，肿瘤组织中的VVL15N1L病毒回收没有降低(图6a)。

关于脱靶复制，除了肺组织之外，在注射后24小时内，没有从任何其他器官或血液中回收病毒。24小时后，VVL15-N1L病毒回收显著小于来自肝和脾组织的VVL15，并且完全不存在于肾组织中。在该实验的任何时间点，都没有从脑、心脏、卵巢或循环系统中回收到可检测水平的病毒(图6b)。相反，病毒存留在肺中直到至少3天。即使在该器官中，VVL15-N1L的回收与VVL15相比显著更少。因此，新型骨架VVL15N1L似乎对肿瘤组织具有比VVL15更大的选择性。

实施例6：VVL15N1L在不同细胞系中的复制

存在以痘苗病毒杀死肿瘤细胞的多种机制。其中包括天然宿主防御触发凋亡，因病毒介导的细胞爆发和宿主免疫防御机制而引起的凋亡。如果病毒对细胞而言细胞毒性过高，则其可能无法产生足以在整个肿瘤中自我繁殖的足够后代。此外，可以预期其复制能力与其治疗性转基因的表达正相关，因为存在更多的病毒拷贝。

所有细胞系都容许用VVL15和VVL15N1L感染。最能容许的肿瘤细胞系是SCC7，其在最初用1PFU/每细胞感染后三天，得到超过1000PFU/每细胞的病毒滴度。该结果与来自细胞细胞毒性测定(MTS)的结果形成对比，其中SCC7是最具抗性的细胞系。最难容许复制的细胞系是CMT93。CMT93和DT6606细胞系中的病毒滴度在第3天达到稳定。这可能反映了病毒复制相对于未感染细胞复制(病毒体有效地耗尽可感染细胞)的性能表现，结合从裂解细胞释放的蛋白酶的可能病毒降解。仅在CMT-93中观察到VVL15N1L复制的统计学显著性衰减(图7)。

实施例7：VVL15N1L的细胞毒性效力

在一系列鼠癌细胞系中将VVL15-N1L与VVL15-RFP的细胞毒性进行体外比较。根据生长速率，在96孔板中以1x10³或1x10⁴个细胞/孔接种细胞，并在16-18小时后用病毒感染。通过MTS分析确定病毒感染后第6天的细胞存活，并如Wang et al(J Clin Invest,2009,119:1604-1615)所述计算EC 50值(杀死50％肿瘤细胞的病毒剂量)。所有测定进行至少三次。基于EC 50值(即杀死50％细胞所需的PFU)，在CT26和DT6606细胞中的两种病毒之间的细胞毒性没有显著差异。相比之下，在杀死CMT93、LLC和SCC7细胞时，VVL15-N1L与VVL15相比显著更有效(图8)。

还比较了“武装”VVL15N1L的细胞毒性效力。在除了LLC和CMT93之外的所有细胞系中，EC 50值显著高于VVL15-N1L(即，其在杀死相关细胞系方面不如VVL15-N1L有效)。在所有细胞系中，VVL15-N1L-mIL12重组体似乎比VVL15-N1L-mGMCSF更有效，该特征在SCC7和DT6606细胞中达到了统计学显著性(图9)。

实施例8：VVL15N1L诱导针对肿瘤抗原的更高水平宿主免疫应答

使用了三种同基因体内肿瘤模型：C3H/HeN系小鼠中的SCC7细胞；C57BL/6系小鼠中的DT6606-ova细胞；和C57BL/6系小鼠中的LLC细胞。

建立了皮下侧腹肿瘤模型，并用单剂量的病毒或PBS处理，如表2所示。为了确保及时产生病毒和肿瘤特异性T细胞，在感染后14天收获脾脏。对随后产生的脾细胞悬液进行IFN-γ释放测定。

(1)从收获的脾制备脾细胞的单细胞悬液

对于相关肿瘤细胞系，如下所述建立同基因皮下侧腹肿瘤(也参见表2)。当肿瘤体积为约100mm³时，将小鼠随机分成三组。使用连接到29号针头的1ml胰岛素注射器，以含1x10⁸PFUVVL15或VL15-N1L病毒的50μlPBS进行瘤内(IT)注射。在病毒部署期间，用针在整个肿瘤的不同方向上穿过数次以便广泛传播。第三组注射等体积载体缓冲液，即50μl PBS。感染后第14天，通过吸入CO₂使动物安乐死。在无菌条件下收获脾，使用2ml注射器的柱塞平端通过70μm细胞过滤器(Becton Dickinson Falcon)捣碎，并用T细胞培养基(TCM)(RPMI-1640,10％FCS，1％链霉素/青霉素，1％丙酮酸钠)冲洗到50ml锥形瓶中。在1200rpm离心后，将沉淀的脾细胞重悬浮于5ml RBC裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)中，并在冰上放置5分钟。在洗涤-离心循环后，将其用TCM再悬浮至5x10⁶个细胞/ml的终浓度。(2)生长停滞的全肿瘤刺激细胞的制备：

在50ml锥形瓶中，在细胞培养基(CM)中制备5x10⁶/ml刺激细胞(即相关靶或对照肿瘤细胞系-SCC7、LLC或DT6606-ova)的单细胞悬浮液。将1mg/ml丝裂霉素C(MMC)(Roche)溶液加入到该悬浮液中，至达到100μg/ml的最终浓度，并在加湿培养箱中在37℃、5％CO₂的空气中培养1小时。随后，用40ml PBS洗涤细胞两次，重悬于40ml CM中，培养直到准备接种(在30-60分钟内)。将此时生长停滞的刺激细胞重悬于TCM中，达到5x10⁵个细胞/ml的终浓度。

(3)IFN-γ释放测定作为肿瘤/抗原特异性T细胞活化的替代标记：

该测定是基于当记忆T细胞被其同源表位-MHC复合物激活时的IFNγ释放。脾细胞库应含有刺激CD8+T细胞所必需的所有细胞类型(例如APCs、Th细胞)。将来自(1)的每种脾细胞悬浮液各100μl与上述靶-肿瘤刺激细胞悬浮液100μl一起在圆底96孔板(即具有5x10⁴个生长停滞的肿瘤细胞的5x10⁵个脾细胞)的三个孔中共培养。仅脾细胞对照孔含有200μlTCM中的5x10⁵个脾细胞。在合适的情况下，也将脾细胞与含100μl ova-肽(H-2Kb/SIINFEKL，Proimmune)的TCM(以达到终浓度5μg/ml)或100μl含有5x10⁴个MHC-相容的生长停滞对照肿瘤细胞(当使用C56BL/6小鼠衍生的肿瘤模型时为B16-F10)的TCM共培养。

此外，为了证明已经施用病毒，且重要的是，动物本身能够产生免疫应答，另将脾细胞如上所述地与热灭活VVL15(100PFU/细胞，加热至56℃2小时)或VV B8R肽(H-2Kb/TSYKFESV，ProImmune，强抗原性痘苗病毒表位)(以达到5μg/ml的终浓度)。该实验也将用作测定本身的阳性对照。

将板在37℃、5％CO₂的空气中培养1小时中培养三天，随后将其在1200rpm下离心5分钟。使用鼠特异性IFN-γELISA试剂盒(Biolegend)确定取自各孔的上清液中的IFN-γ浓度。在扣除来自仅含脾细胞的孔的相应值后，IFN-γ的终浓度确定为重复试样的孔的平均值。

SCC模型是一种侵略性小鼠头颈部鳞状癌模型，与类似的人类头颈部癌症一样，具有很差的免疫原性。如图10a-b所示，来自VVL15-N1L处理组的脾细胞响应于与生长停滞的SCC7细胞共培养而产生的IFN-γ水平显著高于VVL15组。来自PBS处理的脾细胞的IFN-γ产量低但水平显著。这可能反映了宿主对肿瘤的天然免疫应答。如所预期地，脾细胞没有响应于与PBS组中的热灭活VVL15共培养而产生IFN-γ。令人惊奇的是，其他两组在与灭活病毒共培养时，IFN-γ水平没有显著差异(图10b)。应当注意，与灭活VVL15共培养后的IFN-γ绝对水平，其量值低于与生长停滞的肿瘤细胞共培养后的绝对水平。这可能是起因于呈递的免疫原性肿瘤或病毒表位的变化。在随后的实验中，为了确保表位标准化，使用免疫原性VVB8R表位代替失活的VVL15。

还研究了胰腺癌模型中由VV诱导的宿主免疫。由于尚未定义DT6606细胞系的肿瘤相关抗原(TAA)谱，遂建立了稳定表达外源抗原卵清蛋白的细胞系DT6606-ova，以证明抗原特异性免疫应答(在此例中为抗卵白蛋白反应)的推定产生。该细胞系用于产生如表2所述的同基因皮下侧腹模型。在IT注射病毒后第14天，相对于与生长停滞的DT6606-ova细胞共培养的VVL15或PBS处理组，VVL-N1L处理组显示来自收获的脾细胞的IFN-γ应答显著更高(图11a)。在PBS组中存在相对高水平的IFN-γ产量，实际上与VVL15处理组没有不同。卵清蛋白是外来抗原，具有刺激强大抗ova反应的倾向，因此这个结果是不令人惊讶的。当脾细胞与卵白蛋白抗原共培养时(虽然没有达到统计学显著性)，N1L处理组也产生了最高水平的IFN-γ(图11b)。

此外，与B8R表位共培养后，病毒组之间的脾细胞IFN-γ应答没有统计学差异，尽管与肿瘤/肿瘤抗原共培养测定相比，其应答幅度高了接近10倍。

外源选择标记如RFP可能是免疫原性的，并且可以证明已经导致迄今获得的体内结果。为了控制这种可能性，在皮下同基因LLC侧翼模型(参见表2)中使用VVL15-RFP作为对照病毒(代替VVL15)。实验设置同样与SSCVII和DT6606实验相同。

在该模型中重复了先前的结果，其中与生长停滞的LLC细胞共培养的VVL15-N1L治疗组的脾细胞展示了最高的IFN-γ产量(图12a)。这与VVL15-RFP和PBS组相比是统计学显著的。在脾细胞与B8R肽共培养时，病毒处理组之间没有显著差异(图12b)。对于VVL15-N1L组，相对于与生长抑制的LLC细胞共培养，脾细胞与生长停滞的B16-F10细胞(作为MHC单倍型特异性对照刺激细胞群体)的共培养导致了较低但统计学上不显著的IFNγ水平(p＝0.0594)。很可能这些实体瘤细胞系和其他实体瘤细胞系之间共享许多肿瘤表位。针对其而产生的CTL可以解释在B16-F10组中获得的IFN-γ水平。

实施例9：VVL15N1L在胰腺癌模型中的功效

如上所述将5x10⁶个CMT93细胞或3x10⁶个DT6606细胞皮下植入C57BL/6雄性小鼠的剃毛右侧。一旦肿瘤体积达到约1100mm³，即将它们随机分成三组，并按照表3(时间表1和2)中所述的治疗时间表，注射一剂含1x10⁸PFU病毒的50μl PBS或50μl PBS载体缓冲液对照。通过每周两次的卡尺测量来监测肿瘤体积，并每周称重小鼠。每周两次跟踪肿瘤生长，并且当肿瘤体积接近1000mm³时，按照内政部(Home Office)指导方针对动物实施安乐死。在DT6606侧翼肿瘤模型治疗时，肿瘤生长速率的统计学显著减少和延长的存活说明了VVL15-N1L剂的优势(图13a-b)，而在CMT93模型中，在IT施用任一种病毒剂后的肿瘤生长速率之间没有差异，尽管两者的生长均比PBS组显著更慢(图13c-c)。

实施例10：施用VVL15N1L后的原位肺癌存活率

为了评估当静脉内施用时病毒是否有效，使用了原位肺癌模型。将含5x10⁶个LLC细胞的100μl PBS注射到7周龄雌性C57BL/6小鼠的尾静脉中。

使用肺部非造影增强CT扫描来评估三周时间内个体小鼠的肺容积，以及用于外推肿瘤负荷的任何减少。一次，通过在CT上确定肿瘤的初始存在，如表3(方案5)中所述施用三剂IV病毒/PBS。每周称重小鼠两次，如果其显示出痛苦迹象或如果体重减轻超过其最大重量的20％，则处死小鼠。

所有小鼠均发展了肿瘤，死亡发生在14至21天之间，此时通过开胸手术确认了大范围肺肿瘤。肿瘤最初在注射LLC细胞后第4至7天之间在CT上显现，因此选择注射后5天作为治疗的开始时间。

向21只小鼠尾静脉注射含0.5x10⁶LLC细胞的100μl无血清DMEM。将它们随机分成三组，并且从第5天开始治疗(参见表3，方案5)。在注射LLC细胞10天后，通过体重减轻证实PBS处理组中的所有小鼠都具有症状，并且所有小鼠都死于第21天(图14)。与PBS组相比，VVL15病毒处理将存活中位值延长了而VVL15-N1L病毒处理将存活中位值延长了6.5天，尽管在病毒组之间存活没有统计学显著差异。

实施例11：施用VVL15N1L后肺癌模型中的转移传播

LLC是非常具有侵袭性的肿瘤模型，在皮下侧面注射后具有转移到肺的倾向。事实上，已经报道手术切除皮下生长的LLC肿瘤令肺转移速率提高，可能是因为除去了原发性分泌的血管生成抑制剂。

为了研究VV重组体的IT注射是否可以降低该转移速率，将1x10⁶个LLC细胞皮下注射到7周龄雌性C57BL/6小鼠的胁腹中。当肿瘤体积为约100mm³时，将它们随机分成三组。根据表3(时间表3)中的治疗时间表，施用IT注射病毒/PBS。通过卡尺测量来监测肿瘤，直到一组达到需要处死的终点(植入后约17-20天)。所有动物同时安乐死，收获它们的肺并记录任何大体肿瘤沉积物。分离肺叶，在4％福尔马林中固定，包埋在石蜡中，用苏木精和曙红染色，并通过最大横截面尺寸切片。对于每个叶，也在最大横截面上方和下方进行切片。所有三个切片由对治疗时间表不知情的病理学家来仔细检查肿瘤沉积物。

处死时的肿瘤体积在各组之间没有显著差异(图15a)。然而，在实验结束时，N1L、VVL15和PBS组中具有肺转移的小鼠百分比分别是14、43和57％(图15b)。这些数字在统计上彼此不同。然而，很难用每组(n＝7)如此少量的小鼠得出推论，需要用更大样本量来重复实验。然而，该结果确实表明即使VVL15N1L对侵袭性原发性肿瘤的生长可能没有影响，病毒治疗可使传播最小化。因此，可以证明其是一种良好的辅助治疗。

实施例12：IL-12和GM-CSF”武装”的VV15N1L的功效

为了增强VVL15N1L的抗肿瘤功效，将GM-CSF和IL-12插入VVL15N1L载体的N1L区域。针对同基因DT6606皮下侧腹模型(见表3，时间表1)测试各个重组体在体内的效力。当肿瘤体积达到平均100mm³时，以1x10⁸PFU病毒(VVL15-N1L、VVL15-N1L-mGMCSF或VVL15-N1L-mIL12)或等量载体缓冲液对照(50μl PBS)作为每日剂量(每组n＝7)进行IT注射。通过每周两次卡尺测量来跟踪肿瘤生长(图16a)。相应的Kaplan Meir存活曲线(图16b)是基于当肿瘤体积超过1000mm³时动物人道处死必要性。图16a-b证明了单独的携带GMCSF转基因的病毒并未显著优于VVL15-N1L，然而携带IL12的病毒则显示出显著的效力，得到了实验结束时的6/7小鼠治愈率和100％存活。这些”武装”病毒将在其他模式中进行测试，以确定这一结果的普遍性。

实施例13和14：IL-21构建体

材料和方法：

小鼠胰腺癌模型：在雄性C57BL/6小鼠中建立DT6606皮下同基因肿瘤。当肿瘤直径达到5-6mm时，肿瘤内施用PBS(5×10⁷pfu/注射)的VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21或对照病毒VV-ΔTkΔN1L)。在第1,3,7,9和11天测量肿瘤生长。每周测量肿瘤生长两次，并监测动物存活。使用(GraphPad Software，CA，USA)比较存活数据，并使用对数秩(Mantel Cox)测试来确定存活差异的显著性。使用未配对的学生T检验确定显著性(*p<0.05；**p>0.01；***p<0.001)。

叙利亚仓鼠癌模型：携带HPD-1NR肿瘤的叙利亚仓鼠-通过皮下注射将1x10⁶个HPD-1NR细胞接种到携带HPD-1NR肿瘤的叙利亚仓鼠的右侧。当肿瘤达到313mm³时，在第一天给予肿瘤内(5×10⁷pfu/注射)的PBS，VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21或对照病毒VV-ΔTkΔN1L每周测量肿瘤两次，并监测动物存活。使用(GraphPad Software，CA，USA)比较存活数据，并使用对数秩(Mantel Cox)测试来确定存活差异的显著性。使用未配对的学生T检验确定显著性(*p<0.05；**p>0.01；***p<0.001)。叙利亚仓鼠腹膜腔播散性胰腺癌模型-将1×10⁷个SHPC6细胞接种到叙利亚仓鼠的右下腹腔中。四天后，在第4,6和8天，每组10只仓鼠各自腹膜内(IP)注射500μlPBS，2x10⁷PFU的不同VV。监测仓鼠的存活率。使用(GraphPad Software，CA，USA)比较存活数据，并使用对数秩(Mantel Cox)测试来确定存活差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

实施例13：体外的IL-21”武装”VV产生和抗肿瘤效力评估

将人和小鼠IL-21cDNA序列插入puc19N1L穿梭载体(如图3所示)。通过将所得质粒pShuttleN1L-mIL-21或pShuttleN1L-hIL-21共转染到以0.05PFU/细胞的VVL15预感染的CV-1(非洲绿猴肾)细胞中，在Lister氏菌痘苗病毒(VVL15)的TK缺失主链中进行标准同源重组。对转染后的CV-1细胞裂解物进行噬菌斑测定。进行五轮噬菌斑纯化以繁殖单一克隆病毒，并且通过PCR再次证实修饰中缺失N1L基因。所得病毒命名为VV-ΔTkΔN1L-mIL-21和VV-ΔTkΔN1L-hIL-21。为了测试所述病毒的效力，使用细胞死亡分析(MTS分析)来检测来源于突变型Ras-p53转基因胰腺癌模型的鼠胰腺癌细胞系(DT6606)中的三种痘苗病毒的细胞毒性。

图17展示了对IL-21”武装”VV的体外评估。图17A和B展示了不同溶瘤痘苗病毒在鼠胰腺癌细胞系中的细胞毒性。用不同病毒感染来自Ras-p53转基因胰腺癌小鼠的鼠胰腺癌细胞系DT6606培养物，并在病毒感染后6天通过MTS分析检测细胞杀伤。病毒诱导的细胞死亡曲线显示在图17A；计算EC 50值(杀死50％癌细胞的病毒剂量)(图17B)。较高的EC 50值意味着病毒具有较低的效力。图17C&D展示了体外胰腺癌细胞中检测到的新一代痘苗病毒的不同突变体的IL-21表达和病毒复制。用不同病毒感染来自Ras-p53转基因胰腺癌小鼠的鼠胰腺癌细胞系DT6606的培养物，并在病毒感染后24小时通过ELISA测定来检测IL-21表达(图17C)。通过TCID50测定检测到病毒复制，如图17D所示。实验重复三次。如图17A和B所示，新一代溶瘤痘苗病毒(VV-ΔTkΔN1L)在杀死癌细胞方面仍然非常有效；用细胞因子IL-21”武装”病毒不会减弱病毒，而是通过(至今)未知机制增加对癌细胞的细胞毒性(p<0.01)。

为了检查治疗基因IL-21在病毒感染的癌细胞中是否可表达以及表达水平，使用ELISA来检测来自VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和对照病毒VV-ΔTkΔN1L感染的胰腺癌细胞(DT6606)的IL-21蛋白的表达。如图17C所示，IL-21在用VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21感染后的细胞中以非常高的水平表达，但对照病毒VV-ΔTkΔN1L感染不产生任何IL-21蛋白。与主链病毒相比，IL-21”武装”病毒的复制没有减弱(图17D)。

实施例14：IL-21”武装”的VV15N1L的抗肿瘤功效

为了测试IL21是否可以增强VV-ΔTkΔN1L的抗肿瘤功效，针对同基因DT6606皮下侧腹模型测试每种所述病毒(小鼠IL21或人IL21)的体内效力。

图18展示了VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和对照病毒VV-ΔTkΔN1L的抗肿瘤功效。鼠胰腺癌模型——用不同药剂处理的小鼠的肿瘤生长曲线(图18A)和存活(图18B)如图所示(n＝7/组)。携带HPD-1NR肿瘤的叙利亚仓鼠——用不同药剂治疗的小鼠的肿瘤生长曲线(图18C)和存活(图18D)如图所示(n＝7/组)。在每种情况下，均展示了平均肿瘤大小±SEM，直到每组中的第一只仓鼠死亡，并通过单因素ANOVA和事后Bonferroni测试进行比较。(图18E)显示了病毒株在免疫活性叙利亚仓鼠腹膜腔弥漫性胰腺癌模型中的抗肿瘤功效。

携带IL21的病毒表现出显著的效力、肿瘤生长退行(图18A)和携带胰腺癌的小鼠显著延长的存活(图18B)。考虑到人细胞因子可能在叙利亚仓鼠中比小鼠中作用更好，使用皮下叙利亚仓鼠胰腺癌模型来评价IL21-装载的病毒的抗肿瘤功效。引人注目的是，IL21“武装”的病毒显示出显著的效力，是的7只动物中有6只治愈，并且在实验结束时存活为86％(图18C和D)。基于在皮下模型中的抗肿瘤功效，与对照病毒相比，IL12或IL21”武装”的VV展示了具有潜力的功效。

改善胰腺癌患者存活的主要障碍，是缺乏用于晚期胰腺癌的有效治疗剂。为此，使用良好表征的叙利亚仓鼠腹膜扩散胰腺癌模型来评估IL12和IL21”武装”的VV的可行性、功效和安全性。IL-12”武装”的VVLΔTKΔN1L在全身给药后显示为诱导了严重毒性(图18E)。引人注目的是，VVLΔTKΔN1L-IL21具有治疗腹膜扩散性胰腺癌的最高治疗指数，70％的叙利亚仓鼠得到了治愈。