用于生成戊二酸和戊二酸甲酯的方法与流程
本申请要求于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,722和于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,586的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及提高具有羧酸还原酶活性的多肽对二羧酸的活性的方法，其通过使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将二羧酸酶促转化为甲酯进行。本发明还涉及用于使用一种或多种具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，酯酶，脱水酶，水合酶，脱氢酶，硫酯酶，可逆的CoA连接酶，CoA-转移酶，羧酸还原酶，或ω-转氨酶活性的多肽生物合成戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，或1,5-戊二醇(下文为“C5构件块”)的方法，和生成此类C5构件块的重组宿主。
背景技术：
尼龙是聚酰胺，其一般通过二胺与二羧酸的缩合聚合(condensation polymerization)合成。类似地，可以通过内酰胺的缩合聚合生成尼龙。一种普遍存在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的缩合聚合生成。可以通过己内酰胺的开环聚合生成尼龙6(Anton&Baird,Polyamides Fibers,Encyclopedia of Polymer Science and Technology,2001)。
尼龙5，尼龙5,5和包括C5单体的其它变体代表在许多应用中与尼龙6和尼龙6,6相比具有增值特性的新型聚酰胺。通过5-氨基戊酸的聚合生成尼龙5，而通过戊二酸和尸胺的缩合聚合生成尼龙5,5。不存在经济可行的石油化学路线以生产尼龙5和尼龙5,5的单体。
鉴于没有经济上可行的石油化学单体原料，生物技术通过生物催化提供了备选方法。生物催化是使用生物催化剂，如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。
生物来源的原料和石油化学原料两者都是用于生物催化过程的可行的起始材料。
因而，针对此背景，清楚的是需要用于生产戊二酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺和1,5-戊二醇(下文称为“C5构件块”)中的一种或多种的可持续的方法，其中所述方法是基于生物催化的。
然而，野生型的原核生物或真核生物不过度生成C5构件块到细胞外环境。但是，戊二酸，5-氨基戊酸和尸胺的代谢已有报道。
许多细菌和酵母经由β-氧化将二羧酸己二酸作为碳源高效转化为中心代谢产物。辅酶A(CoA)活化的戊二酸至巴豆酰基-CoA的脱羧促进经由β-氧化的进一步分解代谢。
已经对厌氧细菌，如Clostridium viride报道了5-氨基戊酸的代谢(Buckel et al.,2004,Arch.Microbiol.,162,387-394)。类似地，可以将尸胺降解成乙酸和丁酸(Roeder and Schink,2009,Appl.Environ.Microbiol.,75(14),4821–4828)。
最优性原理叙述，微生物调节它们的生物化学网络来支持最大生物质(biomass)生长。超出在宿主生物体中表达异源途径的需要，将碳通量引导到充当碳源的C5结构单元而非生物质生长组分与最优性原理矛盾。例如，将1-丁醇途径从梭菌属(Clostridium)物种转移至其它生产菌株与天然生产者的生产性能相比经常相差一个数量级(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
5碳脂肪族主链前体的有效合成是在C5脂肪族主链上形成末端官能团，如羧基，胺或羟基基团前合成一个或多个C5构件块的关键考虑。
发明概述
本文件至少部分基于下述发现：可以构建用于从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA生成5碳链主链前体，诸如戊二酰基-[acp]，戊二酰基-CoA或戊二酸甲酯的生物化学途径，其中可以形成一个或两个官能团，即羧基、胺或羟基，导致下列一项或多项的合成：戊二酸、5-羟基戊酸、5-氨基戊酸、尸胺(又称为1,5戊二胺)，和1,5-戊二醇(下文为“C5构件块”)。戊二酸半醛(又称为5-氧代戊酸)可以作为其它产物的中间体生成。戊二酸和戊二酸盐、5-羟基戊酸和5-羟基戊酸盐、5-氧代戊酸和5-氧代戊酸盐、和5-氨基戊酸和5-氨基戊酸盐可互换使用，指任何其中性或离子化形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员理解，特定的形式将取决于pH。
在一些实施方案中，可以经由转化为戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯，接着(i)分别将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯脱酯化(de-esterification)为戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA，或(ii)将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯水解为戊二酸甲酯，从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA形成用于转化为C5构件块的C5脂肪族主链。参见图1-3。
在一些实施方案中，产生C5脂肪族主链的途径中的酶有目的地含有不可逆的酶步骤。
在一些实施方案中，可以使用酯酶、硫酯酶、可逆的CoA连接酶、CoA转移酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或5-氧代戊酸脱氢酶酶促形成末端羧基基团。参见图4。
在一些实施方案中，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰基酶酶促形成末端胺基团。参见图5–7。
在一些实施方案中，可以使用醇脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶和6-羟基己酸脱氢酶酶促形成末端羟基基团。参见图8和图9。
硫酯酶可以与SEQ ID NO.22-23，SEQ ID NO:17-18中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。
ω-转氨酶可以与SEQ ID NO.8-13中列出的氨基酸序列的任一项具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。
羧酸还原酶(例如与磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶组合)可以在形成产物中形成末端醛基团作为中间体。羧酸还原酶可以与SEQ ID NO.2-7中列出的氨基酸序列的任一项具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。
在一个方面中，本文件特征在于在重组宿主中生物合成戊二酸半醛甲酯的方法。方法包括使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化为戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]酶促转化为丙二酰基-[acp]甲酯。可以使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]甲酯：合酶活性，脱氢酶活性，脱水酶活性，和还原酶活性。可以使用至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-CoA酶促转化为丙二酰基-CoA甲酯。
在一些实施方案中，使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性，β-酮硫解酶活性，脱氢酶活性，水合酶活性，和还原酶活性。权利要求7的方法，其中使用至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。
具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，方法进一步包括在宿主中使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化为戊二酸半醛甲酯。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。
在一些实施方案中，方法进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-氨基戊酸：ω-转氨酶活性和酯酶活性。方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，ω-转氨酶活性，N-乙酰基转移酶活性，醇脱氢酶活性，和脱乙酰基酶活性。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。
在一些实施方案中，方法进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化为5-氧代戊酸：羧酸还原酶活性和酯酶活性。方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-氧代戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，和ω-转氨酶活性活性。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。
在一些实施方案中，方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。方法可以进一步包括使用至少一种具有脱氢酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，ω-转氨酶活性，和醇脱氢酶活性。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化为1,5-戊二醇：羧酸还原酶活性和醇脱氢酶活性。与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。方法可以进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将1,5-戊二醇酶促转化为尸胺：ω-转氨酶活性和醇脱氢酶活性。
在一些实施方案中，方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化为戊二酸。方法可以进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有ω-转氨酶活性的多肽将戊二酸酶促转化为5-氨基戊酸。在一些实施方案中，方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有EC 1.1.1.-下分类的脱氢酶活性的多肽将戊二酸酶促转化为5-羟基戊酸。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。
具有酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有羧酸还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:2-7中任一项中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:17或18中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽可以与SEQ ID NO:14或15中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有ω-转氨酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:8-13中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在另一个方面中，本文件特征在于生成戊二酸的方法，所述方法包括(i)使用具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]或将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA，并且(ii)使用至少一种具有硫酯酶活性，可逆的CoA连接酶活性，CoA转移酶活性，酰化脱氢酶活性，醛脱氢酶活性，戊二酸半醛脱氢酶活性，或琥珀酸半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。在一些实施方案中，使用具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。在一些实施方案中，使用具有可逆的CoA连接酶活性或CoA转移酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。在一些实施方案中，使用具有酰化脱氢酶活性，醛脱氢酶活性，戊二酸半醛脱氢酶活性，或琥珀酸半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。
在一些实施方案中，具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在另一个方面中，本文件特征在于重组宿主细胞。重组宿主细胞包含至少一种编码具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽和具有硫酯酶活性的多肽的外源核酸，所述宿主生成戊二酸甲酯。宿主可以进一步包含具有羧酸还原酶活性的外源多肽，所述宿主进一步生成戊二酸半醛甲酯。可以与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽组合使用具有羧酸还原酶活性的多肽。
在一些实施方案中，宿主进一步包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽：合酶活性，脱氢酶活性，脱水酶活性，和还原酶活性。
在一些实施方案中，宿主进一步包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽：合酶活性，β-酮硫解酶活性，脱氢酶活性，水合酶活性，和还原酶活性。
具有丙二酰基-CoA O-甲基转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
所述具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:17-18中任一项中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有还原酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在一些实施方案中，宿主进一步包含具有酯酶活性的外源多肽，所述宿主进一步生成戊二酸或5-氧代戊酸。宿主还可以包含具有ω-转氨酶活性的外源多肽，所述宿主生成5-氨基戊酸。
在一些实施方案中，宿主还包含具有选自下组的活性的一种或多种外源多肽：ω-转氨酶活性，羧酸还原酶活性和酯酶活性，所述宿主生成5-氨基戊酸。
在一些实施方案中，宿主还包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽：羧酸还原酶活性，N-乙酰基转移酶活性和脱乙酰基酶活性，所述宿主从5-氨基戊酸生成尸胺。
在一些实施方案中，宿主还包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽：羧酸还原酶活性和ω-转氨酶活性，所述宿主从5-氧代戊酸生成尸胺。
在一些实施方案中，宿主还包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽：酯酶活性，6-羟基己酸脱氢酶活性，4-羟基丁酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，和醇脱氢酶活性，所述宿主生成5-羟基戊酸。包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽的宿主可以从5-羟基戊酸生成1,5-戊二醇：羧酸还原酶活性和醇脱氢酶活性。包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽的宿主可以从1,5-戊二醇生成尸胺：醇脱氢酶活性和ω-转氨酶活性。包含一种或多种具有选自下组的活性的外源多肽的宿主可以从5-羟基戊酸生成尸胺：羧酸还原酶活性，醇脱氢酶活性和ω-转氨酶活性。
在一些实施方案中，在宿主包含具有羧酸还原酶活性的外源多肽时，它与具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的外源多肽组合使用。
具有羧酸还原酶的多肽可以与SEQ ID NO:2-7中任一项列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有ω-转氨酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:8-13中任一项列出的氨基酸具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
具有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂活性的多肽可以与SEQ ID NO:14或15中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在另一个方面中，本文件特征在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽，和至少一种具有选自下组的活性的多肽：硫酯酶活性，可逆的CoA连接酶活性，CoA转移酶活性，酰化脱氢酶活性，醛脱氢酶活性，戊二酸半醛脱氢酶活性，和琥珀酸半醛脱氢酶活性。在一些实施方案中，具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％).
在另一个方面中，本文件特征在于用于生成生物衍生的5碳化合物的方法。用于生成生物衍生的5碳化合物的方法可以包括在一定的条件下将如本文中描述的宿主培养或生长足够的时间段以生成所述生物衍生的5碳化合物，其中任选地，所述生物衍生的5碳化合物选自下组：5-氧代戊酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺，1,5-戊二醇，及其组合。
在一个方面中，本文件特征在于组合物，其包含如本文中描述的生物衍生的5碳化合物和与所述生物衍生的5碳化合物不同的化合物，其中所述生物衍生的5碳化合物选自下组：5-氧代戊酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺，1,5-戊二醇，及其组合。例如，生物衍生的5碳化合物是宿主细胞或生物体的细胞部分。
本文件特征还在于基于生物(biobased polymer)的聚合物，其包含生物衍生的5-氧代戊酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺，1,5-戊二醇，及其组合。
本文件特征还在于包含生物衍生的5-氧代戊酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺，1,5-戊二醇，及其组合的基于生物的树脂以及通过模制基于生物的树脂获得的模制产物。
在另一个方面中，本文件特征在于用于生成基于生物的树脂的方法，其包括在聚合物生成反应中使所述生物衍生的5-氧代戊酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺，1,5-戊二醇与自身或另一种化合物起化学反应。
在另一个方面中，本文件特征在于生物衍生的产物(bio-derived product)、基于生物的产物(bio-based product)或发酵衍生的产物(fermentation-derived product)，其中所述产物包含：(i.)组合物，所述组合物包含如本文中描述的至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，或其任何组合；(ii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物，或其任何组合；(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或其任何组合或ii.的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或其任何组合；(iv.)模制物质，其通过使(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或(iii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或其任何组合模制获得；(v.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或(iv.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或其任何组合；或(vi.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体流(stream)，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，(v.)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的配制剂，或iv的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或其任何组合。
本文件特征还在于提高具有羧酸还原酶活性的多肽对取代的或未取代的C4-C8二羧酸诸如戊二酸或己二酸的活性的方法。方法包括使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将所述C4-C8二羧酸酶促转化为HOC(＝O)(C2-C6烃基(alkyl))-C(＝O)OCH3酯，之后使用具有羧酸还原酶活性的多肽将HOC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化为HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。方法进一步可以包括使用具有脱氢酶活性的多肽将所述HC(＝O)(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3转化为HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3。在一些实施方案中，方法进一步包括使用具有酯酶活性的多肽将HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OCH3酶促转化为HOCH2(C2-C6烃基)-C(＝O)OH。
本文中还描述了生物化学网络，其包含丙二酰基-CoA O-甲基转移酶和丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种，其中丙二酰基-CoA O-甲基转移酶将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化为戊二酸甲酯。生物化学网络进一步包含羧酸还原酶，其中羧酸还原酶将戊二酸甲酯酶促转化为戊二酸半醛甲酯。
在一些实施方案中，生物化学网络包含丙二酰基-CoA O-甲基转移酶和丙二酰基-[acp]，其中丙二酰基-CoA O-甲基转移酶将丙二酰基-[acp]酶促转化为丙二酰基-[acp]甲酯。生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶：合酶，脱氢酶，脱水酶，和还原酶，其中合酶，脱氢酶，脱水酶，或还原酶将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]甲酯。生物化学网络进一步包含硫酯酶，其中硫酯酶将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，生物化学网络包含丙二酰基-CoA O-甲基转移酶和丙二酰基-CoA，其中丙二酰基-CoA O-甲基转移酶将丙二酰基-CoA酶促转化为丙二酰基-CoA甲酯。生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶：合酶，β-酮硫解酶，脱氢酶，水合酶，和还原酶，其中合酶，β-酮硫解酶，脱氢酶，水合酶，和还原酶将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA甲酯。生物化学网络可以进一步包含硫酯酶，其中硫酯酶将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。
在一些实施方案中，生物化学网络进一步包含酯酶和戊二酸半醛甲酯，其中酯酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-氧代戊酸。生物化学网络可以进一步包含ω-转氨酶，其中ω-转氨酶将5-氧代戊酸酶促转化为5-氨基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络进一步包含ω-转氨酶和戊二酸半醛甲酯，其中ω-转氨酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-氨基戊酸甲酯。生物化学网络可以进一步包含酯酶，其中酯酶将5-氨基戊酸甲酯酶促转化为5-氨基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶：羧酸还原酶和ω-转氨酶和5-氨基戊酸，其中羧酸还原酶和ω-转氨酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶和5-氨基戊酸：N-乙酰基转移酶，羧酸还原酶，ω-转氨酶，和脱乙酰基酶，其中N-乙酰基转移酶，羧酸还原酶，ω-转氨酶，和脱乙酰基酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶和5-氧代戊酸：羧酸还原酶和ω-转氨酶，其中羧酸还原酶和ω-转氨酶将5-氧代戊酸酶促转化为尸胺。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶和戊二酸半醛甲酯：酯酶和6-羟基己酸脱氢酶，其中酯酶和6-羟基己酸脱氢酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶和戊二酸半醛甲酯：酯酶和醇脱氢酶，其中酯酶和醇脱氢酶将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含醇脱氢酶，和5-羟基戊酸，其中羧酸还原酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸酶促转化为1,5-戊二醇。生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶：ω-转氨酶和醇脱氢酶，其中ω-转氨酶和醇脱氢酶将1,5-戊二醇酶促转化为尸胺。
在一些实施方案中，生物化学网络可以进一步包含至少一种选自下组的酶和5-羟基戊酸：羧酸还原酶，ω-转氨酶和醇脱氢酶，其中羧酸还原酶，ω-转氨酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸酶促转化为尸胺。
本文件特征还在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码(i)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，(ii)庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶和(iii)硫酯酶，并且生成戊二酸甲酯，戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA。
生成戊二酸甲酯的此类重组宿主进一步可以包含酯酶，并且进一步生成戊二酸。
生成戊二酰基-[acp]的此类重组宿主进一步可以包含硫酯酶并且生成戊二酸。
生成戊二酰基-CoA的此类重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)硫酯酶，(ii)可逆的CoA连接酶，(iii)CoA-转移酶，或(iv)酰化脱氢酶，和(v)醛脱氢酶，诸如7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶或5-氧代戊酸脱氢酶并且进一步生成戊二酸或5-氧代戊酸。
生成5-氧代戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含以下一种或多种：(i)ω-转氨酶或(ii)羧酸还原酶，并且进一步生成5-氨基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)ω-转氨酶或(ii)羧酸还原酶和(iii)酯酶并且进一步生成5-氨基戊酸。
生成5-氧代戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含以下一种或多种：(i)醇脱氢酶或(ii)羧酸还原酶，并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)醇脱氢酶，(ii)酯酶或(iii)羧酸还原酶并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成5-羟基戊酸的重组宿主可以进一步包含以下一种或多种：(i)羧化酶还原酶和(ii)醇脱氢酶，所述宿主进一步生成1,5-戊二醇。
生成5-羟基戊酸的重组宿主可以进一步包含以下一种或多种：(i)羧化酶还原酶，(ii)一种或多种ω-转氨酶和(iii)醇脱氢酶，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氨基戊酸的重组宿主可以进一步包含以下一种或多种：(i)羧化酶还原酶和(ii)ω-转氨酶，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氧代戊酸的重组宿主可以进一步包含以下一种或多种：(i)羧化酶还原酶和(ii)一种或多种ω-转氨酶，所述宿主进一步生成尸胺。
生成1,5-戊二醇的重组宿主可以进一步包含(i)一种或多种醇脱氢酶和(ii)一种或多种ω-转氨酶，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氨基戊酸的重组宿主可以进一步包含以下一种或多种：(i)N-乙酰基转移酶，(ii)羧酸还原酶，(iii)ω-转氨酶和(iv)乙酰基转移酶，所述宿主进一步生成尸胺。
在本文中描述的任何实施方案中，重组宿主可以是原核生物，例如来自埃希氏菌属(Escherichia)诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)诸如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)诸如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)诸如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)诸如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)，来自芽孢杆菌属(Bacilluss)诸如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)诸如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；来自乳球菌属(Lactococcus)诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或来自红球菌属(Rhodococcus)诸如马红球菌(Rhodococcus equi)。
在本文中描述的任何实施方案中，重组宿主可以是真核生物，例如来自曲霉属(Aspergillus)诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母属(Saccharomyces)诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤氏酵属(Pichia)诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶罗维亚酵母属(Yarrowia)诸如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)，来自伊萨酵母属(Issatchenkia)诸如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)，来自德巴利酵母属(Debaryomyces)诸如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，来自Arxula属诸如Arxula adenoinivorans，或来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)诸如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)的真核生物。
在一些实施方案中，减弱或提升宿主的内源生物化学网络以(1)确保乙酰基-CoA的胞内利用度，(2)创建辅因子(即NADH或NADPH)不平衡，其可以经由C5构件块的形成平衡，(3)阻止导致并且包含C5构件块的中心代谢物，中心前体的降解并且(4)确保从细胞的有效流出。
可以通过发酵在重组宿主中进行任何方法。在一些实施方案中，宿主经受需氧或微需氧培养条件下的培养策略。宿主可以经受需氧，厌氧或微需氧培养条件下的培养策略。可以在营养限制，诸如磷酸盐、氧或氮限制的条件下培养宿主。可以使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。
在一些实施方案中，生物原料可以是用作发酵的主要碳源。例如，生物原料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condensed distillers'solubles)或城市废物。
在一些实施方案中，非生物原料可以用作发酵的主要碳源。非生物原料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐(酯)、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)废物流、对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
在一些实施方案中，宿主展现出对高浓度的C5构件块的耐受性。在一些实施方案中，经由在选择性环境中的连续培养改善对高浓度的C5构件块的耐受性。
在一些实施方案中，宿主包含具有选自下组的活性的一种或多种多肽的减弱：聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、乙酰基-CoA特异性β-酮硫解酶、乙酰乙酰基-CoA还原酶、形成乙酸的磷酸乙酸转移酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、menaquinol-延胡索酸氧化还原酶、产生异丁醇的2-酮酸(oxoacid)脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散辅因子不平衡的转氢酶、对创建不平衡的辅因子特异性的谷氨酸脱氢酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C5构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰基-CoA脱氢酶；和庚二酰-CoA合成酶。
本文中描述的任何重组宿主进一步可以过表达一种或多种编码多肽的基因，所述多肽具有：乙酰基-CoA合成酶。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；反馈抗性苏氨酸脱氨酶；吡啶核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；丙酰基-CoA合成酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；L-谷氨酰胺合成酶；赖氨酸转运蛋白；二羧酸转运蛋白；和/或多药物转运蛋白活性。
本文中所述的途径的反应可在一种或多种细胞(例如宿主细胞)菌株中进行，所述菌株(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经基因工程化改造以表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶并且遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶。或者，可以从上述类型的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可以任选地固定在合适的反应容器的底部和/或壁上。此外，这些提取物包括可用作相关酶来源的裂解物(例如细胞裂解物)。在文献提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主细胞)中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或者一些步骤可以在细胞中进行，而其它步骤可以使用提取的酶进行。
本领域技术人员理解，当存在于亲本化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子替代；或与有机碱配位时，含有羧酸基团的化合物(包括但不限于有机一元酸，羟基酸，氨基酸和二羧酸)形成或转化成其离子盐形式。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。将本发明的盐分离为盐或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化成游离酸。
本领域技术人员理解，含有胺基团的化合物(包括但不限于有机胺，氨基酸和二胺)形成或转化为它们的离子盐形式，例如通过向胺中加入酸性质子形成铵盐，与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或与有机酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐以盐的形式分离或通过经由添加碱或用碱性离子交换树脂处理将pH至高于pKb转化成游离胺。
本领域技术人员理解，含有胺基团和羧酸基团两者的化合物(包括但不限于氨基酸)通过以下形成或转化成它们的离子盐形式：通过1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸包括但不限于盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等，或2)当存在于亲本化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子置换时；或与有机碱配位。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐可以作为盐分离或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化为游离酸。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献，包括具有登录号的GenBank和NCBI提交物通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料，该方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。
在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征，目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。根据专利法中的标准实践，权利要求书中的词语“包括”可以被“基本上由...组成”或由“由...组成”替代。
附图简述
图1是从丙二酰基-[acp]导致戊二酸甲酯或戊二酰基-[acp]的示例性生物化学途径的示意图。
图2是使用NADPH作为还原当量从丙二酰基-CoA导致戊二酸甲酯或戊二酰基-CoA的示例性生物化学途径的示意图。
图3是使用NADH作为还原当量从丙二酰基-CoA导致戊二酸甲酯或戊二酰基-CoA的示例性生物化学途径的示意图。
图4是使用戊二酸甲酯，戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA作为中心前体导致戊二酸的示例性生物化学途径的示意图。
图5是使用戊二酸甲酯或戊二酸作为中心前体导致5-氨基戊酸的示例性生物化学途径的示意图。
图6是使用5-氨基戊酸，5-羟基戊酸，或1,5-戊二醇作为中心前体导致尸胺的示例性生物化学途径的示意图。
图7是使用戊二酸半醛或5-氨基戊酸作为中心前体导致尸胺的示例性生物化学途径的示意图。
图8是使用戊二酸甲酯或戊二酸作为中心前体导致5-羟基戊酸的示例性生物化学途径的示意图。
图9是使用5-羟基戊酸作为中心前体导致1,5戊二醇的示例性生物化学途径的示意图。
图10含有大肠杆菌庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶(参见Genbank登录号AAC76437.1,SEQ ID NO:1)，海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)羧酸还原酶(参见Genbank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)羧酸还原酶(参见Genbank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus羧酸还原酶(参见Genbank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:4)，耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见Genbank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:5)，马赛分枝杆菌(Mycobacterium massiliense)羧酸还原酶(参见Genbank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:6)，Segniliparus rotundus羧酸还原酶(参见Genbank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:7)，青紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶(参见Genbank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ω-转氨酶(参见Genbank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)ω-转氨酶(参见Genbank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)ω-转氨酶(参见Genbank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:11)，大肠杆菌ω-转氨酶(参见Genbank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:12)，河流弧菌(Vibrio fluvialis)ω-转氨酶(参见Genbank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:13)，枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见Genbank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:14)，诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见Genbank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:15)，荧光假单胞菌酯酶(参见Genbank登录号AAC60471.2,SEQ ID NO:16)，短乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:17)，植物乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:18)，齿垢密螺旋体(Treponema denticola)烯酰基-CoA还原酶(参见例如Genbank登录号AAS11092.1,SEQ ID Nos:19)，纤细眼虫(Euglena gracilis)烯酰基-CoA还原酶(参见例如Genbank登录号AAW66853.1,SEQ ID No:20)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶(参见例如Genbank登录号AAP11034.1,SEQ ID Nos:21)，大肠杆菌硫酯酶(see e.g.,Genbank登录号AAB59067.1SEQ ID NO:22)，和大肠杆菌硫酯酶(Genbank登录号AAA24665.1,SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
图11是丙酮酸至L-丙氨酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将尸胺转化为5-氨基戊醛的4种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性测量。
图12是柱状图，其汇总了20分钟后340nm处的吸光度变化，其是仅酶的对照(无底物)中的NADPH消耗和5种羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图13是丙酮酸至L-丙氨酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将5-氨基戊醇转化为5-氧代戊醇的6种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性测量。
图14是20分钟后340nm处的吸光度变化的柱状图，其是相对于空载体对照，NADPH消耗和用于将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛的5种羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图15是丙酮酸至L-丙氨酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷转化为N5-乙酰基-5-氨基戊醛的5种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性测量。
图16是20分钟后的340nm处的吸光度的变化的柱状图，其是相对于空载体对照，NADPH的消耗和用于将戊二酸半醛转化为戊二醛的羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图17是柱状图，其汇总了作为仅酶的对照(无底物)的ω-转氨酶活性的测量的丙酮酸至L-丙氨酸的百分比转化(mol/mol)。
图18是丙酮酸至L-丙氨酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将5-氨基戊酸转化为戊二酸半醛的1种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性的测量。
图19是L-丙氨酸至丙酮酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将戊二酸半醛转化为5-氨基戊酸的1种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性的测量。
图20是20分钟后的340nm处的吸光度的变化的柱状图，其是相对于空载体对照，NADPH的消耗和用于将戊二酸甲酯转化为戊二酸半醛甲酯的羧酸还原酶制备物的活性的测量。
图21是L-丙氨酸至丙酮酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将1-氨基戊烷转化为戊醛的1种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性的测量。
图22是L-丙氨酸至丙酮酸的4小时后的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为相对于空载体对照，用于将1-氨基庚烷转化为庚醛的1种ω-转氨酶制备物的ω-转氨酶活性的测量。
图23是通过庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶将戊二酰基-CoA甲酯转化为戊二酰基-CoA的1小时后的表。
发明详述
本文件提供了酶、非天然途径、培养策略、原料、宿主微生物和对宿主的生物化学网络的减弱，其从中心代谢物产生5碳链主链，诸如戊二酰-CoA或5-氧代戊酸(又称为戊二酸半醛)，其中可以形成一个或多个末端官能团，导致戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺(又称为1,5戊二胺)，5-羟基戊酸，或1,5-戊二醇(下文中为“C5构件块”)的一种或多种的合成。可以生成戊二酸半醛(又称为5-氧代戊酸)作为其它产物的中间体。如本文中使用，术语“中心前体”用于意指导致C5构件块合成的本文中显示的任何代谢途径中的任何代谢物。术语“中心代谢物”用于意指所有微生物中生成以支持生长的代谢物。
本文中描述的宿主微生物可以包含内源途径，该内源途径可以通过操作，使得可以生成一种或多种C5构件块。在内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经经过工程化改造，使得在宿主中表达途径内的所有酶。
如本文中提及核酸(或蛋白质)和宿主使用的，术语“外源”指不像其在自然界中被发现一样存在于特定类型细胞中(并且不能从特定类型细胞获得)的核酸或由所述核酸编码的蛋白质。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即视为对于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸亚序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主中对于宿主细胞而言是外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此得出结论通过PCR或限制内切性核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。由此还得出结论任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对于特定宿主微生物而言外源的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中就酵母y细胞而言是外源核酸。
比较而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白质)和宿主使用的，术语“内源的”指就像其在自然界中被发现一样的确存在于特定宿主中(并且可以从特定宿主获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源表达”核酸(或蛋白质)的细胞就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样表达所述核酸(或蛋白质)。此外，“内源生成”核酸、蛋白质、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样生成所述核酸、蛋白质、或化合物。
在一些实施方案中，根据宿主和由宿主生成的化合物，可以在宿主中表达具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽。在一些实施方案中，根据宿主和由宿主生成的化合物，可以在宿主中表达具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽和具有羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，根据宿主和由宿主生成的化合物，可以在宿主中表达下列一种或多种多肽，包括具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽，具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽，具有酯酶活性的多肽，具有可逆的CoA连接酶活性的多肽，具有CoA-转移酶活性的多肽，具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的多肽，具有5-羟基戊酸脱氢酶活性的多肽，具有6-羟基己酸脱氢酶活性的多肽，具有醇脱氢酶活性的多肽，具有5-氧代戊酸脱氢酶活性的多肽，具有6-氧代己酸脱氢酶活性的多肽，7-氧代庚酸脱氢酶活性，具有醛脱氢酶活性的多肽，具有ω-转氨酶活性的多肽，和/或具有羧酸还原酶活性的多肽。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，也可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，因为它增强羧酸还原酶的活性。
例如，本文件特征在于重组宿主，其包含至少一种外源核酸，所述外源核酸编码(i)丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，(ii)庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶和(iii)硫酯酶，并且生成戊二酸甲酯，戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA。
生成戊二酸甲酯的此类重组宿主进一步可以包含具有酯酶活性的多肽，并且进一步生成戊二酸。
生成戊二酰基-[acp]的此类重组宿主进一步可以包含具有硫酯酶活性的多肽，并且生成戊二酸。
生成戊二酰基-CoA的此类重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆的CoA连接酶活性的多肽，(iii)具有CoA-转移酶活性的多肽或(iv)具有酰化脱氢酶活性的多肽，和(v)具有醛脱氢酶活性，如7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶或5-氧代戊酸脱氢酶活性的多肽，并且进一步生成戊二酸或5-氧代戊酸。
生成5-氧代戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)具有ω-转氨酶活性的多肽或(ii)具有羧酸还原酶活性的多肽，并且进一步生成5-氨基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)具有ω-转氨酶活性的多肽或(ii)具有羧酸还原酶活性的多肽和(iii)具有酯酶活性的多肽并且进一步生成5-氨基戊酸。
生成5-氧代戊酸或戊二酸的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)具有醇脱氢酶活性的多肽或(ii)具有羧酸还原酶活性的多肽并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成戊二酸甲酯的重组宿主进一步可以包含下列一种或多种：(i)具有醇脱氢酶活性的多肽，(ii)具有酯酶活性的多肽或(iii)具有羧酸还原酶活性的多肽并且进一步生成5-羟基戊酸。
生成5-羟基戊酸的重组宿主可以进一步包含下列一种或多种：(i)具有羧化酶还原酶活性的多肽和(ii)具有醇脱氢酶活性的多肽，所述宿主进一步生成1,5-戊二醇。
生成5-羟基戊酸的重组宿主可以进一步包含下列一种或多种：(i)具有羧酸还原酶活性的多肽，(ii)一种或多种具有ω-转氨酶活性的多肽和(iii)具有醇脱氢酶活性的多肽，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氨基戊酸的重组宿主可以进一步包含下列一种或多种：(i)具有羧酸还原酶活性的多肽，和(ii)具有ω-转氨酶活性的多肽，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氧代戊酸的重组宿主可以进一步包含下列一种或多种：(i)具有羧酸还原酶活性的多肽和(ii)一种或多种具有ω-转氨酶活性的多肽，所述宿主进一步生成尸胺.
生成1,5-戊二醇的重组宿主可以进一步包含(i)一种或多种具有醇脱氢酶活性的多肽和(ii)一种或多种具有ω-转氨酶活性的多肽，所述宿主进一步生成尸胺。
生成5-氨基戊酸的重组宿主可以进一步包含下列一种或多种：(i)具有N-乙酰基转移酶活性的多肽，(ii)具有羧酸还原酶活性的多肽，(iii)具有ω-转氨酶活性的多肽和(iv)脱乙酰基酶活性的多肽，所述宿主进一步生成尸胺。
在工程化途径内，酶可以来自单一来源，即来自一种物种或属，或者可以来自多种来源，即不同物种或属。编码本文中描述的酶的核酸已经自各种生物体鉴定，并且在公众可用的数据库(诸如GenBank或EMBL)中容易地可得到。
可用于生成一种或多种C5构件块的本文中描述的任何酶可以与相应野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％、或100％)。应当理解，可以基于成熟酶(例如除去任何信号序列)或基于未成熟的酶(例如包括任何信号序列)测定序列同一性。还应当理解，初始甲硫氨酸残基可以或可以不存在于本文中描述的任何酶序列上。
例如，本文中描述的具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以与大肠杆菌(参见Genbank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:1)庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图1-3。
例如，本文中描述的具有羧酸还原酶活性的多肽可以与海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus(参见Genbank登录号EFV11917.1,SEQ ID NO:4)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK75684.1,SEQ ID NO:5)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)羧酸还原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。参见图6，图8和图9。
例如，本文中描述的具有ω-转氨酶活性的多肽与青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(参见Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)，或河流弧菌(参见Genbank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:13)ω-转氨酶的氨基酸序列可以具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。这些ω-转氨酶中的一些是二胺ω-转氨酶。参见图5-7。
例如，本文中描述的具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽可以与枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)或诺卡氏菌属物种NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图4和图9。
例如，本文中描述的具有酯酶活性的多肽可以与荧光假单胞菌酯酶的氨基酸序列(参见Genbank登录号AAC60471.2,SEQ ID NO:16)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图4，5，8。
例如，本文中描述的具有硫酯酶活性的多肽可以与短乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:17)，植物乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(参见Genbank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:18)，或大肠杆菌硫酯酶(参见Genbank登录号AAB59067.1或AAA24665.1，SEQ ID NO:22-23)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图4。
例如，本文中描述的具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶活性的多肽可以与蜡状芽孢杆菌丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶(参见Genbank登录号AAC76437.1,SEQ ID NO:21)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图1-3。
例如，本文中描述的具有烯酰基-CoA还原酶活性的多肽可以与齿垢密螺旋体(参见Genbank登录号AAS11092.1,SEQ ID NO:19)或纤细眼虫(参见Genbank登录号AAW66853.1,SEQ ID NO:20)烯酰基-CoA还原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。参见图1-3。
可以如下测定两种氨基酸序列间的百分比同一性(同源性)。首先，使用来自含有BLASTP第2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2Sequences(Bl2seq)程序比对氨基酸序列。此单机版BLASTZ可以获自Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或美国政府国立生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用Bl2seq程序的用法说明可以参见伴随BLASTZ的自述文件。Bl2seq使用BLASTP算法实施两种氨基酸序列之间的比较。为了比较两种氨基酸序列，如下设置Bl2seq的选项：-i设置为含有要比较的第一氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何期望的文件名称(例如C:\output.txt)；并且所有其它选项保持为其缺省设置。例如，可以使用以下命令来产生含有两种氨基酸序列间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两种比较序列共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件会呈现那些同源性区作为比对序列。如果两种比较序列不共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件不会呈现比对序列。可以对核酸序列遵循相似的规程，只是使用blastn。
一旦比对，通过计算相同氨基酸残基在这两种序列中呈现的位置的数目确定匹配数目。通过用匹配数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，接着将所得的数值乘以100来确定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。还注意到长度值会总是整数。
应当领会，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域中公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一种充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例如，可以修饰给定酶的编码序列中的密码子，从而获得特定物种(例如细菌或真菌)中的最佳表达，这使用适合于所述物种的密码子偏好表进行。
也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，术语“功能性片段”指具有至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的相应的成熟、全长、野生型蛋白质活性的蛋白质的肽片段。功能性片段一般但不总是可以由蛋白质的连续区构成，其中该区具有功能性活性。
此文件还提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性变体和(ii)上文描述的功能性片段的功能性变体。相对于相应的野生型序列，酶和功能性片段的功能性变体可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般会具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)处氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似特征的另一种。保守取代包括下列组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸、和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸、和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上文提及的极性、碱性或酸性组的一种成员被相同组的另一种成员的任何取代可以视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一种氨基酸取代具有不同特征的另一种。
缺失变体可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的区段(具有两种或更多种氨基酸)或非连续的单一氨基酸。添加(添加变体)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的背景中，术语“异源氨基酸序列”指与(a)不同的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸)、凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是可用作可检测标志物的蛋白质，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可以经由使用异源信号序列提高靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体(例如KLH)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可以是不同长度的，并且在一些情况中可以是比与异源序列附接的全长靶蛋白质更长的序列。
工程化宿主可以天然表达本文中描述的途径的酶中的无一或一些(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种)。如此，工程化宿主内的途径可以包含所有外源酶，或者可以包含内源和外源酶两者。也可以破坏工程化宿主的内源基因以阻止不想要的代谢物的形成或阻止经由对中间体起作用的其它酶引起的途径中此类中间体的损失。工程化宿主可以称为重组宿主或重组宿主细胞。如本文中描述的，重组宿主可以包含编码一种或多种多肽的核酸，所述多肽具有如本文中描述的还原酶，脱乙酰基酶，N-乙酰基转移酶，丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，酯酶，硫酯酶，水合酶，脱氢酶，或ω-转氨酶，CoA连接酶，CoA转移酶的活性。
另外，可以使用本文中描述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)作为酶来源，或者使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶来源体外进行一种或多种C5构件块的产生。
在C5构件块的生物合成中产生末端羧基基团的酶
如图4中描绘，可以使用i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆的CoA连接酶活性的多肽，(iii)具有CoA转移酶活性的多肽，(iv)具有酰化脱氢酶活性的多肽，或(v)具有醛脱氢酶活性，诸如7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶活性，或5-氧代戊酸脱氢酶活性的的多肽，或(vi)具有酯酶活性的多肽酶促形成末端羧基基团。
在一些实施方案中，通过在EC 3.1.2.-下分类的硫酯酶，诸如YciA(SEQ ID NO:22)、tesB(Genbank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO:23)或Acot13(参见例如，Cantu et al.,Protein Science,2010,19,1281–1295；Zhuang et al.,Biochemistry,2008,47(9),2789–2796；或Naggert et al.,J.Biol.Chem.,1991,266(17),11044–11050)的基因产物酶促形成导致戊二酸合成的末端羧基基团。
在一些实施方案中，通过CoA-转移酶诸如戊烯二酸CoA-转移酶(例如，在EC 2.8.3.12下分类，诸如来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans))酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见例如，Buckel et al.,1981,Eur.J.Biochem.,118:315–321。图4。
在一些实施方案中，通过可逆的CoA-连接酶诸如琥珀酸-CoA连接酶(例如，在EC 6.2.1.5下分类，诸如来自Thermococcus kodakaraensis))酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见例如，Shikata et al.,2007,J.Biol.Chem.,282(37):26963–26970。
在一些实施方案中，通过在EC 3.1.2.-分类的酰基-[acp]硫酯酶，诸如来自短乳杆菌(GenBank登录号ABJ63754.1,SEQ ID NO:4)或来自植物乳杆菌(GenBank登录号CCC78182.1,SEQ ID NO:5)的酰基-[acp]硫酯酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。此类酰基-[acp]硫酯酶具有C6–C8链长度特异性(参见例如，Jing et al.,2011,BMC Biochemistry,12(44))。参见例如图4。
在一些实施方案中，通过醛脱氢酶，例如，在EC 1.2.1.3下分类的醛脱氢酶(参见Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。参见图4。
在一些实施方案中，通过在EC 1.2.1.-下分类的醛脱氢酶，诸如戊二酸半醛脱氢酶(例如，在EC 1.2.1.20下分类)，琥珀酸-半醛脱氢酶(例如，在EC1.2.1.16或EC 1.2.1.79下分类)，或EC 1.2.1.3下分类的醛脱氢酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。例如，EC 1.2.1.-下分类的醛脱氢酶可以是5-氧代戊酸脱氢酶诸如CpnE的基因产物、6-氧代己酸脱氢酶(例如来自不动细菌属物种(Acinetobacter sp.)的ChnE的基因产物)，或7-氧代庚酸脱氢酶(例如，来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物)(Iwaki et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158–5162；López-Sánchez et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(1),110-118)。例如，6-氧代己酸脱氢酶可以在EC 1.2.1.63下分类，诸如ChnE的基因产物。例如，7-氧代庚酸脱氢酶可以在EC 1.2.1.-下分类。
在一些实施方案中，通过具有酯酶活性的多肽诸如在EC 3.1.1.-，诸如EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.6下分类的酯酶酶促形成导致戊二酸合成的第二末端羧基基团。
在C5构件块的生物合成中生成末端胺基团的酶
如图5-7中描绘，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰基酶酶促形成末端胺基团。
在一些实施方案中，通过5-氨基戊酸转氨酶(例如在EC 2.6.1.48下分类，诸如获自Clostridium viride)形成第一个末端羧基基团。来自Clostridium viride的可逆的5-氨基戊酸转氨酶已经表明用于将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的类似的活性(Barker et al.,J.Biol.Chem.,1987,262(19),8994–9003)。
在一些实施方案中，可以通过ω-转氨酶(例如在EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如获自青紫色杆菌(Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(Genbank登录号AEA39183.1,SEQ ID NO:12)，河流弧菌(Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:13)，或灰色链霉菌(Streptomyces griseus))酶促形成一个末端胺基团，导致5-氨基戊醇或5-氨基戊醛的合成。在例如EC2.6.1.29或EC 2.6.1.82下分类的一些ω-转氨酶是二胺ω-转氨酶(例如SEQ ID NO:11)。参见图5和图6。
来自青紫色杆菌的可逆ω-转氨酶(Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)已经表明类似的活性，其接受6-氨基己酸作为氨基供体，在己二酸半醛中形成第一个末端胺基团(Kaulmann et al.,Enzyme and Microbial Technology,2007,41,628–637)。
来自灰色链霉菌的可逆4-氨基丁酸:2-氧代戊二酸转氨酶已经表明用于将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的类似的活性(Yonaha et al.,Eur.J.Biochem.,1985,146,101-106)。
在一些实施方案中，通过二胺转氨酶酶促形成导致尸胺合成的第二个末端胺基团。例如，可以通过二胺转氨酶(在例如EC 2.6.1.29下分类或在例如EC2.6.1.82下分类，诸如来自大肠杆菌的YgjG的基因产物(Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12))酶促形成第二个末端胺基团。
ygjG的基因产物接受一大批二胺碳链长度底物，诸如腐胺、尸胺和亚精胺(Samsonova et al.,BMC Microbiology,2003,3:2)。
来自大肠杆菌菌株B的二胺转氨酶已经证明了用于1,5二氨基戊烷的活性(Kim,The Journal of Chemistry,1964,239(3),783–786)。
在一些实施方案中，通过脱乙酰基酶诸如在例如EC 3.5.1.17下分类的酰基-赖氨酸脱酰酶，或诸如在例如EC 3.5.1.62下分类的乙酰基腐胺脱乙酰基酶酶促形成第二个末端胺基团，导致尸胺的合成。来自藤黄微球菌(Micrococcus luteus)K-11的乙酰基腐胺脱乙酰基酶接受广泛的碳链长度底物，诸如乙酰基腐胺，乙酰基尸胺和N8-乙酰基亚精胺(参见例如Suzuki et al.,1986,BBA–General Subjects,882(1):140–142)。见，图7。
在C5构件块的生物合成中生成末端羟基基团的酶
如图8和9中描绘，可以使用具有醇脱氢酶活性诸如6-羟基己酸脱氢酶活性、5-羟基戊酸脱氢酶活性、或4-羟基丁酸脱氢酶活性的多肽酶促形成末端羟基基团。
例如，可以通过脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类的脱氢酶，诸如6-羟基己酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.258下分类(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶，例如，在EC 1.1.1.-下分类，诸如CpnD的基因产物(参见例如，Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，来自Clostridium viride的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶诸如gabD(参加例如，Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS Microbiology Letters,181(1):63-71)酶促形成导致5-羟基戊酸的末端羟基基团。参见图8。
可以通过具有EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1，1.1.1.2，1.1.1.21，或1.1.1.184)下分类的醇脱氢酶活性的多肽酶促形成末端羟基基团，其导致1,5戊二醇的合成。参见图9。
生物化学途径
从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA到戊二酸甲酯，戊二酰基-CoA或戊二酰基-[acp]的途径
如图1中显示，可以如下从丙二酰基-[acp]合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，在例如EC 2.1.1.197下分类，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-[acp]转化为丙二酰基-[acp]甲酯；接着通过与丙二酰基-[acp]缩合和β-酮脂酰基-[acp]合酶，在例如EC 2.3.1.-，诸如EC 2.3.1.41，EC 2.3.1.179或EC 2.3.1.180下分类(例如fabB，fabF或fabH的基因产物)转化为3-氧代戊二酰基-[acp]甲酯；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-，诸如EC 1.1.1.100下分类(例如fabG的基因产物)转化为3-羟基-戊二酰基-[acp]甲酯；接着通过3-羟基酰基-[acp]脱水酶，在例如EC 4.2.1.59下分类，诸如fabZ的基因产物转化为2,3-脱氢戊二酰基-[acp]甲酯；接着通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶，在例如EC 1.3.1.-诸如EC 1.3.1.10下分类，诸如fabI的基因产物转化为戊二酰基-[acp]甲酯；接着(i)通过硫酯酶，在例如EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:23)，YciA(SEQ ID NO:22)或Acot13，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化为戊二酸甲酯或(ii)通过庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶，在例如EC 3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ ID NO:1)转化为戊二酰基-[acp]。
如图2中显示，可以如下从丙二酰基-CoA合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，在例如EC 2.1.1.197下分类，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-CoA转化为丙二酰基-CoA甲酯；接着通过β-酮硫解酶，在例如EC 2.3.1.16下分类，诸如bktB的基因产物与乙酰基-CoA缩合或者通过β-酮脂酰基-[acp]合酶，在例如EC 2.3.1.180下分类，诸如fabH的基因产物与丙二酰基-CoA缩合转化为3-氧代戊二酰基-CoA甲酯；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-诸如EC 1.1.1.100(例如fabG的基因产物)或EC 1.1.1.36(例如phaB的基因产物)下分类转化为3-羟基-戊二酰基-CoA甲酯；接着通过烯酰基-CoA水合酶，在例如EC 4.2.1.119下分类，诸如phaJ的基因产物(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；Fukui et al.,Journal of Bacteriology,1998,180(3),667–673)转化为2,3-脱氢戊二酰基-CoA甲酯；接着通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶，在例如EC 1.3.1.-诸如EC 1.3.1.38，EC1.3.1.8，EC 1.3.1.10或EC 1.3.1.44下分类转化为戊二酰基-CoA甲酯；接着(i)通过硫酯酶，在例如EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:23)，YciA(SEQ ID NO:22)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化为戊二酸甲酯或(ii)通过庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶，在例如EC 3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ ID NO:1)转化为戊二酰基-CoA。
如图3中显示，可以如下从丙二酰基-CoA合成戊二酸甲酯：通过丙二酰基-CoA O-甲基转移酶，在例如EC 2.1.1.197下分类，诸如bioC的基因产物将丙二酰基-CoA转化为丙二酰基-CoA甲酯；接着通过β-酮硫解酶，在例如EC 2.3.1.16下分类，诸如bktB的基因产物与乙酰基-CoA缩合或者通过β-酮脂酰基-[acp]合酶，在例如EC 2.3.1.180下分类，诸如fabH的基因产物与丙二酰基-CoA缩合转化为3-氧代戊二酰基-CoA甲酯；接着通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-，诸如EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.157下分类(例如fadB或hbd的基因产物)转化为3-羟基-戊二酰基-CoA甲酯；接着通过烯酰基-CoA水合酶，在例如EC 4.2.1.17下分类，诸如crt的基因产物转化为2,3-脱氢戊二酰基-CoA甲酯；接着通过反式-2-烯酰基-CoA还原酶，在例如EC 1.3.1.44下分类，诸如ter或tdter的基因产物转化为戊二酰基-CoA甲酯；接着(i)通过硫酯酶，在例如EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:23)，YciA(SEQ ID NO:22)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)转化为戊二酸甲酯或(ii)通过庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶，在例如EC 3.1.1.85下分类，诸如bioH(SEQ ID NO:1)转化为戊二酰基-CoA。
使用戊二酸甲酯，戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA作为中心前体到戊二酸或5-氧代戊酸的途径
如图4中描绘，可以通过酯酶，在例如EC 3.1.1.-，诸如EC 3.1.1.1或EC3.1.1.6，诸如estC(SEQ ID NO:16)下分类将戊二酸甲酯转化为戊二酸。
如图4中描绘，可以通过下列各项将戊二酰基-CoA转化为戊二酸：(i)硫酯酶，在例如EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:23)，YciA(SEQ ID NO:22)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)(ii)可逆的CoA连接酶，在例如EC 6.2.1.5下分类，(iii)CoA转移酶，在例如EC 2.8.3.-诸如EC 2.8.3.12下分类，或(iv)酰化脱氢酶，在例如EC 1.2.1.10或EC 1.2.1.76下分类，诸如由PduB或PduP编码和醛脱氢酶，在EC 1.2.1.-下分类，诸如戊二酸半醛脱氢酶，在例如EC 1.2.1.20下分类，琥珀酸半醛脱氢酶，在例如EC 1.2.1.16或EC 1.2.1.79下分类，或EC 1.2.1.3下分类的醛脱氢酶。例如，可以使用5-氧代戊酸脱氢酶，诸如CpnE的基因产物，6-氧代己酸脱氢酶诸如ChnE的基因产物，或7-氧代庚酸脱氢酶(例如来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物)将5-氧代戊酸转化为戊二酸。
如图4中描绘，可以通过硫酯酶，在例如EC 3.1.2.-下分类，诸如tesB(SEQ ID NO:23)，YciA(SEQ ID NO:22)或Acot13，多形拟杆菌酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAO77182)或植物乳杆菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1)将戊二酰基-[acp]转化为戊二酸。
使用5-氧代戊酸，戊二酸作为中心前体到5-氨基戊酸的途径
在一些实施方案中，如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-氨基戊酸：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸甲酯转化为戊二酸半醛甲酯；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-诸如2.6.1.18,EC 2.6.1.19,EC 2.6.1.29,EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8),铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)(参见Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)，或河流弧菌(Vibrio fluvialis)(参见Genbank登录号AEA39183.1,SEQ ID NO:13)将戊二酸半醛甲酯转化为5-氨基戊酸甲酯；接着通过在EC 3.1.1.-下分类的酯酶，诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶转化为5-氨基戊酸。例如，酯酶可以是estC的基因产物。参见图5。
在一些实施方案中，如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-氨基戊酸：通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶将戊二酸甲酯转化为戊二酸；接着通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如car的基因产物，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸转化为5-氧代戊酸；接着通过ω-转氨酶(例如EC 2.6.1.18,EC 2.6.1.19,EC 2.6.1.48,EC 2.6.1.29,EC 2.6.1.82诸如SEQ ID NOs:8,10或11)转化为5-氨基戊酸。参见图5。
在一些实施方案中，如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-氨基戊酸：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸甲酯转化为戊二酸半醛甲酯；接着通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶将戊二酸半醛甲酯转化为5-氧代戊酸；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)或丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)转化为5-氨基戊酸。参见图5。
使用戊二酸甲酯作为中心前体到5-羟基戊酸的途径
如图8中描绘，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶将戊二酸甲酯转化为戊二酸；接着通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如car的基因产物，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸转化为戊二酸半醛；接着通过脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-下分类，诸如6-羟基己酸脱氢酶，在例如EC1.1.1.258下分类(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-下分类，诸如CpnD的基因产物(参见例如Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，或4-羟基丁酸脱氢酶诸如gabD转化为5-羟基戊酸(参见例如Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS Microbiology Letters,181(1):63–71)。参见图7。
如图8中描绘，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸甲酯转化为戊二酸半醛甲酯；接着通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶转化为戊二酸半醛；接着通过脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-下分类，诸如6-羟基己酸脱氢酶，在例如EC 1.1.1.258下分类(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-下分类，诸如CpnD的基因产物，或者4-羟基丁酸脱氢酶，诸如gabD转化为5-羟基戊酸。
如图8中描绘，可以如下从中心前体戊二酸甲酯合成5-羟基戊酸：羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)或GriC和GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸甲酯转化为戊二酸半醛甲酯；接着通过醇脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1,EC 1.1.1.2,EC 1.1.1.21或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C,YqhD的基因产物，或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白质转化为5-羟基戊酸甲酯；接着通过EC 3.1.1.-下分类的酯酶(例如estC的基因产物)诸如EC 3.1.1.1下分类的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分类的乙酰基酯酶转化为5-羟基戊酸。
使用5-氨基戊酸，5-羟基戊酸，或戊二酸半醛作为中心前体到尸胺的途径
如图4中描绘，如下从中心前体5-氨基戊酸合成尸胺：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如car的基因产物与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自诺卡尔菌属的npt基因编码)或来自灰色链霉菌的GriC和GriD的基因产物的组合将5-氨基戊酸转化为5-氨基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-，诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，或大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)将5-氨基戊醛转化为尸胺。
由car的基因产物编码的羧酸还原酶和增强剂npt或sfp具有广泛的底物特异性，包括末端双功能性C4和C5羧酸(Venkitasubramanian et al.,Enzyme and Microbial Technology,2008,42,130–137)。
在一些实施方案中，如下从中心前体5-羟基戊酸(其可以如图8中所述生成)合成尸胺：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus(参见Genbank登录号EFV11917.1,SEQ ID NO:4)，Mycobacterium massiliense(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)，或GriC&GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(参见Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)，或河流弧菌(参见Genbank登录号AEA39183.1,SEQ ID NO:13)将5-氧代戊醇转化为5-氨基戊醇；接着通过醇脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1,EC 1.1.1.2,EC 1.1.1.21,或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C(Genbank登录号CAA90836.1)或YqhD(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)的基因产物(Liu et al.,Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy et al.,2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或具有Genbank登录号CAA81612.1的蛋白质转化为5-氨基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-，诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，或大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)转化为尸胺。参见图6。
在一些实施方案中，如下从中心前体5-氨基戊酸合成尸胺：通过N-乙酰基转移酶诸如赖氨酸N-乙酰基转移酶，在例如EC 2.3.1.32下分类将5-氨基戊酸转化为N5-乙酰基-5-氨基戊酸；接着通过羧酸还原酶诸如car的基因产物与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因或来自诺卡尔菌属的npt基因编码)，或来自灰色链霉菌的GriC和GriD的基因产物的组合转化为N5-乙酰基-5-氨基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-，诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(参见Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)，或河流弧菌(参见Genbank登录号AEA39183.1,SEQ ID NO:13)转化为N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷；接着通过乙酰基腐胺脱乙酰基酶(在例如EC 3.5.1.17或EC 3.5.1.62下分类)转化为尸胺。参见图7.
在一些实施方案中，如下从中心前体戊二酸半醛合成尸胺：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:21)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:22)基因编码)，或GriC&GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将戊二酸半醛转化为戊二醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC2.6.1.-诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，转化为5-氨基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，或大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)转化为尸胺。参见图7。
在一些实施方案中，如下从中心前体1,5-戊二醇合成尸胺：通过醇脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C(Genbank登录号CAA90836.1)或YqhD(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)的基因产物(Liu et al.,Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy et al.,2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或具有Genbank登录号CAA81612.1的蛋白质将1,5-戊二醇转化为5-羟基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，球形红杆菌(参见Genbank登录号ABA81135.1,SEQ ID NO:11)，大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)，或河流弧菌(参见Genbank登录号AEA39183.1,SEQ ID NO:13)将5-氧代戊醛转化为5-氨基戊醇；接着通过醇脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C(Genbank登录号CAA90836.1)或YqhD(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)的基因产物(Liu et al.,Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy et al.,2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或具有Genbank登录号CAA81612.1的蛋白质转化为5-氨基戊醛；接着通过ω-转氨酶，在例如EC 2.6.1.-，诸如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下分类，诸如来自青紫色杆菌(参见Genbank登录号AAQ59697.1,SEQ ID NO:8)，铜绿假单胞菌(参见Genbank登录号AAG08191.1,SEQ ID NO:9)，丁香假单胞菌(参见Genbank登录号AAY39893.1,SEQ ID NO:10)，或大肠杆菌(参见Genbank登录号AAA57874.1,SEQ ID NO:12)转化为尸胺。参见图6。
使用5-羟基戊酸作为中心前体到1,5-戊二醇的途径
如图9中描绘，如下从中心前体5-羟基戊酸合成1,5戊二醇：通过羧酸还原酶，在例如EC 1.2.99.6下分类，诸如来自海分枝杆菌(参见Genbank登录号ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus(参见Genbank登录号EFV11917.1,SEQ ID NO:4)，马赛分枝杆菌(参见Genbank登录号EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(参见Genbank登录号ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp(Genbank登录号CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或来自诺卡尔菌属的npt(Genbank登录号ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因编码)，或GriC&GriD的基因产物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)的组合将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛；接着通过醇脱氢酶，在例如EC 1.1.1.-诸如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下分类，诸如YMR318C(Genbank登录号CAA90836.1)或YqhD(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)的基因产物(参见例如Liu et al.,Microbiology,2009,155,2078–2085；Larroy et al.,2002,Biochem J.,361(Pt 1),163–172；或Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechnol.,89(2),249-257)或具有Genbank登录号CAA81612.1的蛋白质(来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))将5-羟基戊醛转化为1,5戊二醇。参见图9。
培养策略
在一些实施方案中，培养策略需要实现需氧、厌氧、微需氧、或混合氧/反硝化培养条件。体外表征为氧敏感性的酶需要维持极低溶解氧浓度的微需氧培养策略(参见例如，Chayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),493 0 498；Wilson and Bouwer,1997,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,18(2-3),116-130)。
在一些实施方案中，循环培养策略需要在实现厌氧培养条件和实现有氧培养条件之间交替。
在一些实施方案中，培养策略需要营养限制，如氮，磷酸盐或氧限制。
在一些实施方案中，可以利用除了氧外的最终电子受体诸如硝酸盐。在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷膜的细胞保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。
在一些实施方案中，在一种或多种C5构件块合成中对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物原料。
在一些实施方案中，所述生物原料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condensed distillers'solubles)或城市废物。
已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢(Lee et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang et al.,Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。
已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中证明了在经由前体丙酰基-CoA的3-羟基戊酸的合成中对木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko and Yu,2011,见上文；Martin and Prather,J.Biotechnol.,2009,139:61–67)。
已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg et al.,Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja et al.,FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。
已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou et al.,Bioresour.Technol.,2008,99(7):2419-2428).
已经针对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见，例如Hermann et al,J.Biotechnol.,2003,104:155–172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2):163–172；Ohashi et al.,J.Bioscience and Bioengineering,1999,87(5):647-654)。
已经针对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Li et al.,Biodegradation,2011,22:1215–1225).
在一些实施方案中，所述非生物原料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。
已经针对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。
已经针对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133).
已经针对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski et al.,Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。
已经针对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢( et al.,Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15):5467–5475)。
已经针对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌)证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay et al.,Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1):152–156)。
在一些实施方案中，所述宿主微生物是原核生物。例如，所述原核生物可以是细菌，来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或者耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或者食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)，如食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或者来自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。该原核生物还可以是基因的来源以构建本文中所述的能够生成一种或多种C5构件块的重组宿主细胞。
在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物。例如，真核生物可以丝状真菌，例如来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)。或者，真核生物可以是酵母，例如来自酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤氏酵属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶罗维亚酵母属(Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)。该真核生物还可以是基因的来源以构建本文中所述的能够生成一种或多种C5构件块的重组宿主。
代谢工程
本文件提供方法，所述方法涉及少于针对所有上述途径描述的所有步骤的步骤。这种方法可涉及例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多个。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一个，且在一些实施方案中唯一的步骤可为所列步骤中的任何步骤。
此外，本文中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可以在重组宿主内实施。本文件提供所列出的和遗传工程化以表达本文件中列举的任何酶的一种或者多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多种)重组形式的任何属和种的宿主细胞。如此，例如，宿主细胞可含有外源核酸，其编码催化本文中描述的任何途径的一个或者多个步骤的酶。
另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。
本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。
在一些实施方案中，本文中概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。
在一些实施方案中，可以经由附加型或者染色体整合方法将本文概述的途径中的酶基因投入(gene dose)至所得的遗传修饰的生物体中(即，过表达)。
在一些实施方案中，可以利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析(Flux Balance Analysis)来设计用于将碳流量引导至C5构件块的基因组级别的减弱或者敲除策略。
减弱策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰。
在一些实施方案中，可以利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向C5构件块的过程中设计基因组级别的减弱或者敲除策略。
在一些实施方案中，可以经由在选择性环境中的连续培养改善宿主微生物对高浓度的C5构件块的耐受性。
在一些实施方案中，减弱或提升宿主微生物的内源生物化学网络以(1)确保乙酰基-CoA和丙二酰-CoA的胞内利用度，(2)创建NADH或NADPH不平衡，其可以经由一种或多种C5构件块的形成平衡，(3)阻止导致并且包含C5构件块的中心代谢物，中心前体的降解和/或(4)确保从细胞的有效流出。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以在宿主生物体中减弱催化乙酰基-CoA的水解的内源酶，诸如短链长度硫酯酶。
在需要乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA的缩合以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱一种或多种催化仅乙酰基-CoA缩合为乙酰乙酰基-CoA的内源β-酮硫解酶，诸如AtoB或phaA的内源基因产物。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱产生乙酸的内源磷酸乙酸转移酶，诸如pta(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱乙酸合成途径中的编码乙酸激酶的内源基因，诸如ack。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱催化丙酮酸降解成乳酸的酶的内源基因，诸如由ldhA编码的乳酸脱氢酶(Shen et al.,2011,见上文)。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱编码催化将磷酸烯醇式丙酮酸(phophoenolpyruvate)降解成延胡索酸的酶，诸如menaquinol-延胡索酸氧化还原酶的内源基因，诸如frdBC(参见例如Shen et al.,2011,见上文)。
在需要乙酰基-CoA和NADH的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以减弱编码催化将乙酰基-CoA降解成乙醇的酶，诸如由adhE编码的醇脱氢酶的内源基因(Shen et al.,2011,见上文)。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅因子来合成C5构件块的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甲酸脱氢酶基因(Shen et al.,2011,见上文)。
在一些实施方案中，可以在宿主生物体中过表达乙酰基-CoA羧化酶。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶、3-磷酸丝氨酸氨基转移酶和磷酸丝氨酸磷酸酶中的一种或多种以产生丝氨酸作为S-腺苷-L-甲硫氨酸循环的甲基供体。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达甲醇脱氢酶或甲醛脱氢酶以允许经由甲酸的甲醇分解代谢。
在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH或NADPH辅因子来合成C5构件块的情况下，可以减弱消散辅因子不平衡的转氢酶。
在一些实施方案中，可以减弱编码催化将丙酮酸降解为乙醇的酶，诸如丙酮酸脱羧酶的内源基因。
在一些实施方案中，可以减弱编码催化异丁醇产生的酶，诸如2-酮酸脱羧酶的内源基因。
在需要乙酰基-CoA的胞内利用度以合成C5构件块的一些实施方案中，可以在微生物中过表达重组乙酰基-CoA合成酶诸如acs的基因产物(Satoh et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以通过减弱内源葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)将碳流量定向到戊糖磷酸循环中以提高NADPH的供应。
在一些实施方案中，可以通过过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶将碳流量重定向到戊糖磷酸循环中以提高NADPH的供应(Lee et al.,2003,Biotechnology Progress,19(5),1444–1449)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达基因诸如编码吡啶核苷酸转氢酶的UdhA(Brigham et al.,Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因诸如GapN(Brigham et al.,2012,见上文)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况中，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶(苹果酸酶)基因诸如maeA或maeB(Brigham et al.,2012,见上文)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因诸如zwf(Lim et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组果糖1,6二磷酸酶基因诸如fbp(Becker et al.,J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以减弱内源丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1)。
在一些实施方案中，在合成C5构件块中在途径中需要过量的NADPH辅因子的情况下，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶诸如gdh的基因产物(Satoh et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。
在一些实施方案中，可以减弱促进NADPH转化成NADH的内源酶，所述转化诸如NADH产生循环，其可以经由EC 1.4.1.2(NADH-特异性)和EC1.4.1.4(NADPH-特异性)下分类的谷氨酸脱氢酶的互变产生。
在一些实施方案中，可以减弱利用NADH和NADPH两者作为辅因子的内源谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)。
在一些实施方案中，可以经由作为与小可溶性蛋白质，如麦芽糖结合蛋白的融合蛋白表达，使溶膜结合烯酰基-CoA还原酶溶解(Gloerich et al.,FEBS Letters,2006,580,2092–2096)。
在使用天然积累聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)的宿主的一些实施方案中，可以在宿主菌株中减弱酶内源聚羟基链烷酸酯合酶。
在使用天然积累脂质体的宿主的一些实施方案中，减弱编码参与脂质体合成的酶的基因。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-丙氨酸脱氢酶以从丙酮酸再生L-丙氨酸作为ω-转氨酶反应的氨基供体。
在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-谷氨酸脱氢酶、L-谷氨酸合成酶、或谷氨酸合酶以从2-氧代戊二酸再生L-谷氨酸，作为ω-转氨酶反应的氨基供体。
在一些实施方案中，可以减弱酶诸如EC 1.3.1.62下分类的庚二酰-CoA脱氢酶；酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.3.8.7或EC 1.3.8.1下分类；和/或戊二酰基-CoA脱氢酶，例如，在EC 1.3.8.6下分类的戊二酰基-CoA脱氢酶，其降解导致并且包括C5构件块的中心代谢物和中心前体。
在一些实施方案中，可以减弱经由辅酶A酯化活化C5构件块的内源酶，诸如例如，EC 6.2.1.6下分类的CoA-连接酶(例如戊二酰基-CoA合成酶)。
在一些实施方案中，可以通过对细胞膜遗传工程化结构修饰或提高C5构件块的任何关联转运蛋白活性增强或放大C5构件块穿过细胞膜到胞外培养基的流出。
可以通过过表达宽底物范围多药物转运蛋白，诸如来自枯草芽孢杆菌的Blt(Woolridge et al.,1997,J.Biol.Chem.,272(14):8864–8866)；来自大肠杆菌的AcrB和AcrD(Elkins&Nikaido,2002,J.Bacteriol.,184(23),6490–6499)，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereus)的NorA(Ng et al.,1994,Antimicrob Agents Chemother,38(6),1345–1355)，或来自枯草芽孢杆菌的Bmr(Neyfakh,1992,Antimicrob Agents Chemother,36(2),484–485)增强或放大尸胺的流出。
可以通过过表达溶质转运蛋白诸如来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的lysE转运蛋白增强或放大5-氨基戊酸和尸胺的流出(Bellmann et al.,2001,Microbiology,147,1765–1774)。
通过过表达二羧酸转运蛋白诸如来自谷氨酸棒杆菌的SucE转运蛋白增强或放大戊二酸的流出(Huhn et al.,Appl.Microbiol.&Biotech.,89(2),327–335)。
使用重组宿主生成C5构件块
通常，可以通过提供宿主微生物，并且用含有如上文描述的合适的碳源的培养基培养提供的微生物生成一种或多种C5构件块。一般地，培养基和/或培养可以使得微生物生长到足够的密度并且有效产生C5构件块。对于大规模生产过程，可以使用任何方法，诸如别处描述的(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,2nd Edition,Editors:A.L.Demain and J.E.Davies,ASM Press；和Principles of Fermentation Technology,P.F.Stanbury and A.Whitaker,Pergamon)。简言之，用特定微生物接种含有合适的培养基的大罐(例如，100加仑、200加仑、500加仑、或更多的罐)。在接种后，培养微生物以容许产生生物量。一旦达到期望的生物量，可以将含有微生物的培养基转移到第二个罐。此第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以是较大的，较小的，或者与第一个罐相同大小的。通常，第二个罐大于第一个，使得可以对来自第一个罐的培养基添加额外的培养基。另外，此第二个罐内的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。
一旦转移，可以温育微生物以容许生成C5构件块。一旦生成，可以使用任何方法来分离C5构件块。例如，可以经由吸附方法从发酵液选择性回收C5构件块。在戊二酸和5-氨基戊酸的情况下，可以经由蒸发进一步浓缩所得的洗脱液，经由蒸发和/或冷却结晶来结晶，并且经由离心回收晶体。在尸胺和1,5-戊二醇的情况下，可以采用蒸馏实现期望的产物纯度。本发明在以下实施例中进一步描述，实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
使用戊二酸半醛作为底物并且形成5-氨基戊酸的ω-转氨酶的酶活性
将编码N端His标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO:8和10的ω-转氨酶的来自青紫色杆菌和球形红杆菌的基因(参见图10)，使得可以生成N端加HIS标签的ω-转氨酶。将每个得到的经修饰的基因在T7启动子控制下克隆到pET21a表达载体中，并将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm摇动下培养。使用1mM IPTG在16℃诱导每个培养物过夜。
经由离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且在酶活性测定法中立即使用无细胞提取物。
在由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 5-氨基戊酸，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(reverse direction)(即5-氨基戊酸至戊二酸半醛)酶活性测定法。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物添加到含有5-氨基戊酸的测定缓冲液中来启动每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm摇动的情况下温育4小时。通过RP-HPLC量化从丙酮酸的L-丙氨酸形成。
没有5-氨基戊酸的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。SEQ ID NO 8的基因产物接受5-氨基戊酸作为底物，如针对空载体对照确认。参见图18。
对SEQ ID NO 10的转氨酶确认了正向(即戊二酸半醛至5-氨基戊酸)的酶活性。在由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM戊二酸半醛，10mML-丙氨酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行酶活性测定法。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物添加到含有戊二酸半醛的测定缓冲液中来启动每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm摇动的情况下温育4小时。通过RP-HPLC量化丙酮酸形成。
SEQ ID NO 10的基因产物接受戊二酸半醛作为底物，如针对空载体对照确认。参见图19。确认了ω-转氨酶活性的可逆性，表明SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10的ω-转氨酶接受戊二酸半醛作为底物，并且合成5-氨基戊酸作为反应产物。
实施例2
使用5-羟基戊酸作为底物并且形成5-羟基戊醛的羧酸还原酶的酶活性
将编码His-标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO:2-4，6，和7的羧酸还原酶(分别为GenBank登录号ACC40567.1，ABK71854.1，EFV11917.1，EIV11143.1，和ADG98140.1)的来自海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、马赛分枝杆菌、和Segniliparus rotundus的基因(参见图10)，使得可以生成N端加HIS标签的羧酸还原酶。将每个修饰的基因克隆到pET Duet表达载体中，在编码来自枯草芽孢杆菌的加His标签的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的sfp基因旁，两者都在T7启动子的控制下。与来自实施例3的表达载体一起将每种表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。在以230rpm摇动的情况下，在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力下的250mL烧瓶培养物中在37℃培养每种所得的重组大肠杆菌菌株。在37℃使用自身诱导培养基诱导每种培养物过夜。
经由离心收获来自每种诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni亲和层析从上清液中纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，以10倍稀释到50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并且经由超滤浓缩。
在由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM 5-羟基戊醛，10mM MgCl2，1mM ATP，和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份进行酶活性(即5-羟基戊酸至5-羟基戊醛)测定法。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照添加到含有5-羟基戊酸的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，并且于室温温育20分钟。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。没有5-羟基戊酸的每个仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图12。
SEQ ID NO:2-4、6和7的基因产物(由sfp的基因产物增强)接受5-羟基戊酸作为底物，如针对空载体对照确认(参见图14)，并且合成5-羟基戊醛。
实施例3
用于5-氨基戊醛，形成5-氧代戊醇的ω-转氨酶的酶活性
将编码N端His标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO:8-13的ω-转氨酶的青紫色杆菌，铜绿假单胞菌，丁香假单胞菌，球形红杆菌，大肠杆菌和河流弧菌基因(参见图10)，使得可以生成N端加HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰的基因在T7启动子控制下克隆到pET21a表达载体中。将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将每个所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm摇动下培养。使用1mM IPTG在16℃诱导每个培养物过夜。
经由离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且在酶活性测定法中立即使用无细胞提取物。
在由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 5-氨基戊醇，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(即5-氨基戊醇至5-氧代戊醇)酶活性测定法。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物添加到含有5-氨基戊醇的测定缓冲液中来启动每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm摇动的情况下温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
没有5-氨基戊醇的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8-13的基因产物接受5-氨基戊醇作为底物，如针对空载体对照确认(参见图13)，并且合成5-氧代戊醇作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，可以推断SEQ ID NO:8-13的基因产物接受5-氧代戊醇作为底物，并且形成5-氨基戊醇。
实施例4
使用尸胺作为底物并且形成5-氨基戊醛的ω-转氨酶的酶活性
将编码N端His标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO:8–10和12的ω-转氨酶的青紫色杆菌，铜绿假单胞菌，丁香假单胞菌，和大肠杆菌基因(参见图10)，使得可以生成N端加HIS标签的ω-转氨酶。将经修饰的基因在T7启动子控制下克隆到pET21a表达载体中。将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将每个所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm摇动下培养。使用1mM IPTG在16℃诱导每个培养物过夜。
经由离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液，并且在酶活性测定法中立即使用无细胞提取物。
在由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM尸胺，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(即尸胺至5-氨基戊醛)酶活性测定法。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物添加到含有尸胺的测定缓冲液中来启动每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm摇动的情况下温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
没有尸胺的每个仅酶的对照具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8–10和12的基因产物接受尸胺作为底物，如针对空载体对照确认(参见图11)，并且合成5-氨基戊醛作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，可以推断SEQ ID NO:8–10和12的基因产物接受5-氨基戊醛作为底物，并且形成尸胺。
实施例5
使用N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷，并且形成N5-乙酰基-5-氨基戊醛的ω-转氨酶的酶活性
使用缓冲液测定N端加His标签的SEQ ID NO:8,10–13的ω-转氨酶(参见实施例3，和图10)用于将N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷转化为N5-乙酰基-5-氨基戊醛的活性，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐构成。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物添加到含有N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷的测定缓冲液中来启动每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm摇动的情况下温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
没有N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8,10的基因产物接受N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷作为底物，如针对空载体对照确认(参见图15)，并且合成N5-乙酰基-5-氨基戊醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，SEQ ID NO:8，10的基因产物接受N5-乙酰基-5-氨基戊醛作为底物，形成N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷。
实施例6
使用戊二酸半醛作为底物并且形成戊二醛的羧酸还原酶的酶活性
使用戊二酸半醛作为底物测定N端加His标签的SEQ ID NO 7的羧酸还原酶(参见实施例2和图10)。使用缓冲液一式三份进行酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM戊二酸半醛，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH构成。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照添加到含有戊二酸半醛的测定缓冲液启动酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。没有戊二酸半醛的仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图12。
SEQ ID NO 7的基因产物(由sfp的基因产物增强)接受戊二酸半醛作为底物，如针对空载体对照确认(参见图16)，并且合成戊二醛。
实施例7
使用戊二酸甲酯作为底物并且形成戊二酸半醛甲酯的羧酸还原酶的酶活性
使用戊二酸甲酯作为底物测定N端加His标签的SEQ ID NO 2-4和7的羧酸还原酶(参见实施例2和图10)。使用缓冲液一式三份进行酶活性测定法，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM戊二酸甲酯，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH构成。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照添加到含有戊二酸半醛的测定缓冲液启动酶活性测定反应，然后于室温温育20分钟。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。没有戊二酸甲酯的仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图12。
SEQ ID NO 2-4和7的基因产物(由sfp的基因产物增强)接受戊二酸甲酯作为底物，如针对空载体对照确认(参见图20)，并且合成戊二酸半醛甲酯。
实施例8
使用N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷，1-氨基戊烷和1-氨基庚烷作为戊二酸半醛甲酯的代用品(proxy)并且形成5-氨基戊酸甲酯的ω-转氨酶的酶活性。
使用缓冲液测定N端加His标签的SEQ ID NO:8,10–13(参见实施例3，和图10)的ω-转氨酶用于将N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷转化为N5-乙酰基-5-氨基戊醛的活性，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐构成。通过将ω-转氨酶或空载体对照的无细胞提取物添加到含有N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
没有N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8,10-13的基因产物接受N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷作为底物，如针对空载体对照确认(参见图15)，并且合成N5-乙酰基-5-氨基戊醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，SEQ ID NOs:8,10-13的基因产物接受乙酰基屏蔽的(shielded)伯胺,诸如N5-乙酰基-5-氨基戊醛作为底物，形成N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷。
使用缓冲液测定N端加His标签的SEQ ID NO:8,10–13(参见实施例3，和图10)的ω-转氨酶用于将1-氨基戊烷转化为戊醛的活性，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 1-氨基戊烷，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐构成。通过将ω-转氨酶或空载体对照的无细胞提取物添加到含有1-氨基戊烷的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
没有1-氨基戊烷的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8-13的基因产物接受1-氨基戊烷作为底物，如针对空载体对照确认(参见图21)，并且合成戊醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，SEQ ID NO:8-13的基因产物接受5碳伯胺1-氨基戊烷作为底物，形成戊醛。
使用缓冲液测定N端加His标签的SEQ ID NO:8–13(参见实施例3，和图10)用于将1-氨基庚烷转化为庚醛的ω-转氨酶的活性，所述缓冲液由终浓度50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 1-氨基庚烷，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐构成。通过将ω-转氨酶或空载体对照的无细胞提取物添加到含有1-氨基庚烷的测定缓冲液启动每个酶活性测定反应，然后在以250rpm摇动的情况下于25℃温育4小时。通过RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
没有1-氨基庚烷的每个仅酶的对照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基线转化。参见图17。
SEQ ID NO:8-13的基因产物接受1-氨基庚烷作为底物，如针对空载体对照确认(参见图21)，并且合成庚醛作为反应产物。
鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例1)，SEQ ID NO:8-13的基因产物接受7碳伯胺1-氨基庚烷作为底物，形成庚醛。
鉴于对乙酰基屏蔽的N5-乙酰基-1,5-二氨基戊烷和C5–C7链长度伯胺(代表omega单官能化底物)证明的活性，SEQ ID NO:8-13具有接受戊二酸半醛甲酯作为底物，形成5-氨基戊酸甲酯的高度可能性。
实施例9
使用戊二酰基-CoA甲酯作为底物并且形成戊二酰基-CoA的庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶的酶活性
将编码C端His标签的序列添加到编码SEQ ID NO:1的庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶的来自大肠杆菌的基因(参见图10)，使得可以生成C端加HIS标签的庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶。将所得的经修饰的基因在T7启动子控制下克隆到pET28b+表达载体中，并且将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将每个所得的重组大肠杆菌菌株在含有100mL LB培养基和抗生素选择压力的500mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm摇动下培养。使用0.3mM IPTG在18℃诱导每个培养物过夜。
经由离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每种团粒，并且经由超声处理裂解。经由离心分开细胞碎片与上清液。使用Ni-亲和层析从上清液纯化庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶，进行缓冲液更换，并且经由超滤浓缩到20mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并且于4℃贮存。
在由终浓度25mM Tris·HCl缓冲液(pH＝7.0)和5[mM]戊二酰基-CoA甲酯组成的缓冲液中一式三份进行将戊二酰基-CoA甲酯转化为戊二酰基-CoA的酶活性测定法。通过将庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶以终浓度10[μM]添加到含有戊二酰基-CoA甲酯的测定缓冲液中来启动酶活性测定反应，并在30℃在250rpm摇动的情况下温育1小时。通过LC-MS量化戊二酰基-CoA形成。
没有酶的仅底物的对照没有显示痕量的底物戊二酰基-CoA。参见图23。SEQ ID NO.1的庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶接受戊二酰基-CoA甲酯作为底物，并且合成戊二酰基-CoA作为反应产物，如经由LC-MS确认。参见图23。
其它实施方案
应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围限定的本发明的范围。其它方面，优点和修改在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 英威达技术有限责任公司
<120> 用于生成戊二酸和戊二酸甲酯的方法
<130> 35643-0071WO1
<150> US 62/012,586
<151> 2014-06-16
<150> US 62/012,722
<151> 2014-06-06
<160> 23
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Met Asn Asn Ile Trp Trp Gln Thr Lys Gly Gln Gly Asn Val His Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp Arg Cys Ile
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35 40 45
Gly Phe Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Ala Leu Ser Leu Ala Asp Met
50 55 60
Ala Glu Ala Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Lys Ala Ile Trp Leu Gly
65 70 75 80
Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Thr His Pro
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130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
Gln Asn Val Ser Met Pro Phe Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asp Gly
195 200 205
Leu Val Pro Arg Lys Val Val Pro Met Leu Asp Lys Leu Trp Pro His
210 215 220
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225 230 235 240
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<210> 2
<211> 1174
<212> PRT
<213> 海分枝杆菌
<400> 2
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<213> 耻垢分枝杆菌
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65 70 75 80
Ala Thr Asp Glu Gly Gly Arg Thr Val Thr Arg Leu Leu Pro Arg Phe
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Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Gln Val Trp Ser Arg Val Gln Ala Val Ala
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Ala Ala Leu Arg His Asn Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Pro Gly Asp Ala
115 120 125
Val Ala Thr Ile Gly Phe Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Thr Leu Asp Leu
130 135 140
Val Cys Ala Tyr Leu Gly Leu Val Ser Val Pro Leu Gln His Asn Ala
145 150 155 160
Pro Val Ser Arg Leu Ala Pro Ile Leu Ala Glu Val Glu Pro Arg Ile
165 170 175
Leu Thr Val Ser Ala Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Val Glu Ser Val Arg
180 185 190
Asp Val Asn Ser Val Ser Gln Leu Val Val Phe Asp His His Pro Glu
195 200 205
Val Asp Asp His Arg Asp Ala Leu Ala Arg Ala Arg Glu Gln Leu Ala
210 215 220
Gly Lys Gly Ile Ala Val Thr Thr Leu Asp Ala Ile Ala Asp Glu Gly
225 230 235 240
Ala Gly Leu Pro Ala Glu Pro Ile Tyr Thr Ala Asp His Asp Gln Arg
245 250 255
Leu Ala Met Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly
260 265 270
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405 410 415
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Thr Arg Asp Gly Val Ile Val Arg Pro Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu
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Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro Tyr Pro
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Arg Pro Glu Val Thr Ala Ser Val Phe Asp Arg Asp Gly Tyr Tyr
485 490 495
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500 505 510
Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys Leu Ala Gln Gly Glu Phe Val
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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595 600 605
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<212> PRT
<213> Segniliparus rugosus
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885 890 895
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<213> 马赛分枝杆菌
<400> 6
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245 250 255
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Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu
450 455 460
Leu Lys Thr Asp Gly Met Phe Leu Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Val
465 470 475 480
Thr Ala Ser Val Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Met Thr Gly Asp Ile
485 490 495
Val Ala Glu Leu Ala His Asp Asn Ile Glu Ile Ile Asp Arg Arg Asn
500 505 510
Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Ala Val Ala Thr Leu
515 520 525
Glu Ala Glu Tyr Ala Asn Ser Pro Val Val His Gln Ile Tyr Val Tyr
530 535 540
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Ala Val Val Val Pro Thr Pro
545 550 555 560
Glu Ala Val Ala Ala Ala Lys Gly Asp Ala Ala Ala Leu Lys Thr Thr
565 570 575
Ile Ala Asp Ser Leu Gln Asp Ile Ala Lys Glu Ile Gln Leu Gln Ser
580 585 590
Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe Ile Ile Glu Pro Gln Pro Phe Thr Gln
595 600 605
Gly Asn Gly Leu Leu Thr Gly Ile Ala Lys Leu Ala Arg Pro Asn Leu
610 615 620
Lys Ala His Tyr Gly Pro Arg Leu Glu Gln Met Tyr Ala Glu Ile Ala
625 630 635 640
Glu Gln Gln Ala Ala Glu Leu Arg Ala Leu His Gly Val Asp Pro Asp
645 650 655
Lys Pro Ala Leu Glu Thr Val Leu Lys Ala Ala Gln Ala Leu Leu Gly
660 665 670
Val Ser Ser Ala Glu Leu Ala Ala Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly
675 680 685
Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Asp Ile
690 695 700
Phe Ala Val Glu Val Pro Val Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Asp
705 710 715 720
Leu Gly Gly Val Ala Lys Phe Val Asp Glu Gln Arg His Ser Gly Gly
725 730 735
Thr Arg Pro Thr Ala Glu Thr Val His Gly Ala Gly His Thr Glu Ile
740 745 750
Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Glu Ala Thr Leu
755 760 765
His Ala Ala Pro Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Ile Pro His Thr Val
770 775 780
Leu Leu Thr Gly Ser Asn Gly Tyr Leu Gly His Tyr Leu Ala Leu Glu
785 790 795 800
Trp Leu Glu Arg Leu Asp Lys Thr Asp Gly Lys Leu Ile Val Ile Val
805 810 815
Arg Gly Lys Asn Ala Glu Ala Ala Tyr Gly Arg Leu Glu Glu Ala Phe
820 825 830
Asp Thr Gly Asp Thr Glu Leu Leu Ala His Phe Arg Ser Leu Ala Asp
835 840 845
Lys His Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu Gly
850 855 860
Leu Asp Ala Asp Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Val Ile
865 870 875 880
Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu
885 890 895
Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile
900 905 910
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala
915 920 925
Ala Tyr Val Asp Pro Thr Thr Phe Asp Glu Glu Ser Asp Ile Arg Leu
930 935 940
Ile Ser Ala Val Arg Pro Ile Asp Asp Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly
945 950 955 960
Asn Ala Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu
965 970 975
Cys Gly Leu Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His
980 985 990
Ser Arg Tyr Thr Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Gln Phe Thr Arg Leu
995 1000 1005
Ile Leu Ser Leu Ile Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Gln
1010 1015 1020
Ala Gln Thr Thr Gly Glu Arg Pro Leu Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro
1025 1030 1035 1040
Gly Asp Phe Thr Ala Glu Ala Ile Thr Thr Leu Gly Thr Gln Val Pro
1045 1050 1055
Glu Gly Ser Glu Gly Phe Val Thr Tyr Asp Cys Val Asn Pro His Ala
1060 1065 1070
Asp Gly Ile Ser Leu Asp Asn Phe Val Asp Trp Leu Ile Glu Ala Gly
1075 1080 1085
Tyr Pro Ile Ala Arg Ile Asp Asn Tyr Thr Glu Trp Phe Thr Arg Phe
1090 1095 1100
Asp Thr Ala Ile Arg Gly Leu Ser Glu Lys Gln Lys Gln His Ser Leu
1105 1110 1115 1120
Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Glu Gln Pro Ser Ala Ala Glu Asn His
1125 1130 1135
Gly Val Val Pro Ala Lys Arg Phe Gln His Ala Val Gln Ala Ala Gly
1140 1145 1150
Ile Gly Pro Val Gly Gln Asp Gly Thr Thr Asp Ile Pro His Leu Ser
1155 1160 1165
Arg Arg Leu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Asp Leu Glu Gln Leu Gly Leu
1170 1175 1180
Leu
1185
<210> 7
<211> 1186
<212> PRT
<213> Segniliparus rotundus
<400> 7
Met Thr Gln Ser His Thr Gln Gly Pro Gln Ala Ser Ala Ala His Ser
1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu Leu Leu Ala Thr Asp Pro Gln Ala
20 25 30
Ala Ala Thr Leu Pro Asp Pro Glu Val Val Arg Gln Ala Thr Arg Pro
35 40 45
Gly Leu Arg Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Ala
50 55 60
Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg Ser Phe Gln Thr Val Lys Asp Pro
65 70 75 80
Ile Thr Gly Arg Ser Ser Val Glu Leu Leu Pro Thr Phe Asp Thr Ile
85 90 95
Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Ala Ser Asp Leu
100 105 110
Ala His His Pro Gln Ala Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Leu Ala Ser
115 120 125
Ile Gly Phe Ile Ser Val Asp Tyr Val Ala Ile Asp Ile Ala Gly Val
130 135 140
Phe Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Leu Gln Thr Gly Ala Thr Leu Ala
145 150 155 160
Thr Leu Thr Ala Ile Thr Ala Glu Thr Ala Pro Thr Leu Phe Ala Ala
165 170 175
Ser Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Val Asp Ala Val Leu Ala Thr Pro
180 185 190
Ser Val Arg Arg Leu Leu Val Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Ser Asp Glu
195 200 205
Asp Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Arg Lys Ile Ala Asp Ala Gly
210 215 220
Ser Ser Val Leu Val Asp Val Leu Asp Glu Val Ile Ala Arg Gly Lys
225 230 235 240
Ser Ala Pro Lys Ala Pro Leu Pro Pro Ala Thr Asp Ala Gly Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys
260 265 270
Gly Ala Met Tyr Pro Glu Arg Asn Val Ala His Phe Trp Gly Gly Val
275 280 285
Trp Ala Ala Ala Phe Asp Glu Asp Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ile
290 295 300
Asn Ile Thr Phe Leu Pro Leu Ser His Val Ala Ser Arg Leu Ser Leu
305 310 315 320
Met Pro Thr Leu Ala Arg Gly Gly Leu Met His Phe Val Ala Lys Ser
325 330 335
Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Lys Leu Ala Arg Pro Thr Asn
340 345 350
Leu Phe Leu Val Pro Arg Val Val Glu Met Leu Tyr Gln His Tyr Gln
355 360 365
Ser Glu Leu Asp Arg Arg Gly Val Gln Asp Gly Thr Arg Glu Ala Glu
370 375 380
Ala Val Lys Asp Asp Leu Arg Thr Gly Leu Leu Gly Gly Arg Ile Leu
385 390 395 400
Thr Ala Gly Phe Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Phe
405 410 415
Ile Glu Ser Leu Leu Gln Ile His Leu Val Asp Gly Tyr Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Ala Gly Pro Val Trp Arg Asp Gly Tyr Leu Val Lys Pro Pro Val
435 440 445
Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr
450 455 460
Asp Ser Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Thr Gln Thr Ile
465 470 475 480
Leu Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Thr Thr Ala Glu Val Phe Asp
485 490 495
Glu Asp Gly Phe Tyr Leu Thr Gly Asp Val Val Ala Gln Ile Gly Pro
500 505 510
Glu Gln Phe Ala Tyr Val Asp Arg Arg Lys Asn Val Leu Lys Leu Ser
515 520 525
Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Ala Tyr Ser Ser
530 535 540
Ser Pro Leu Val Arg Gln Leu Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Ser
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Pro Asp Ala Leu Lys Lys Phe
565 570 575
Gly Val Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Gly Glu Ser Leu Gln Lys
580 585 590
Ile Ala Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe
595 600 605
Ile Ile Glu Thr Asp Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Asp
610 615 620
Ala Arg Lys Ser Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg
625 630 635 640
Leu Glu Ala Met Tyr Lys Glu Leu Ala Asp Gly Gln Ala Asn Glu Leu
645 650 655
Arg Asp Ile Arg Arg Gly Val Gln Gln Arg Pro Thr Leu Glu Thr Val
660 665 670
Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Ala Glu Ile Lys
675 680 685
Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu
690 695 700
Thr Phe Ser Asn Phe Leu His Asp Leu Phe Glu Val Asp Val Pro Val
705 710 715 720
Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ser Val Ala Glu His
725 730 735
Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Pro Thr Phe Ala Thr
740 745 750
Val His Gly Lys Gly Ser Thr Thr Ile Lys Ala Ser Asp Leu Thr Leu
755 760 765
Asp Lys Phe Ile Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys His Leu Pro
770 775 780
Lys Pro Ala Asp Pro Pro Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly
785 790 795 800
Trp Leu Gly Arg Phe Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro
805 810 815
Ala Gly Gly Lys Leu Ile Thr Ile Val Arg Gly Lys Asp Ala Ala Gln
820 825 830
Ala Lys Ala Arg Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu
835 840 845
Ala Gly His Tyr Gln Asp Leu Ala Ala Thr Thr Leu Glu Val Leu Ala
850 855 860
Gly Asp Phe Ser Glu Pro Arg Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Asn
865 870 875 880
Arg Leu Ala Asp Glu Val Asp Phe Ile Ser His Pro Gly Ala Leu Val
885 890 895
Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly
900 905 910
Val Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile Thr Thr Arg Ile Lys Pro Val
915 920 925
Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Pro Ser Ala
930 935 940
Leu Asp Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val Ser Ala Glu Arg Ser Val
945 950 955 960
Asp Glu Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Gly Gly Glu
965 970 975
Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Val
980 985 990
Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Gln Lys Tyr Thr Gly Gln Val
995 1000 1005
Asn Ala Thr Asp Gln Phe Thr Arg Leu Val Gln Ser Leu Leu Ala Thr
1010 1015 1020
Gly Leu Ala Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Gly Asn Arg
1025 1030 1035 1040
Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Ile Pro Val Asp Phe Thr Ala Glu Ser
1045 1050 1055
Ile Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Ser Tyr Asn
1060 1065 1070
Val Phe Asn Pro His Arg Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp
1075 1080 1085
Trp Leu Ile Glu Ala Gly His Pro Ile Thr Arg Ile Asp Asp Tyr Asp
1090 1095 1100
Gln Trp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ser
1105 1110 1115 1120
Lys Arg Gln Ala Ser Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Ala Arg Pro
1125 1130 1135
Gly Pro Ala Val Asp Gly Ser Pro Phe Arg Asn Thr Val Phe Arg Thr
1140 1145 1150
Asp Val Gln Lys Ala Lys Ile Gly Ala Glu His Asp Ile Pro His Leu
1155 1160 1165
Gly Lys Ala Leu Val Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Ile Lys Gln Leu Gly
1170 1175 1180
Leu Leu
1185
<210> 8
<211> 459
<212> PRT
<213> 青紫色杆菌
<400> 8
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455
<210> 9
<211> 468
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 9
Met Asn Ala Arg Leu His Ala Thr Ser Pro Leu Gly Asp Ala Asp Leu
1 5 10 15
Val Arg Ala Asp Gln Ala His Tyr Met His Gly Tyr His Val Phe Asp
20 25 30
Asp His Arg Val Asn Gly Ser Leu Asn Ile Ala Ala Gly Asp Gly Ala
35 40 45
Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Arg Tyr Leu Asp Ala Val Gly Gly
50 55 60
Met Trp Cys Thr Asn Ile Gly Leu Gly Arg Glu Glu Met Ala Arg Thr
65 70 75 80
Val Ala Glu Gln Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Asn Pro Phe Cys Asp
85 90 95
Met Ala Asn Pro Arg Ala Ile Glu Leu Cys Arg Lys Leu Ala Glu Leu
100 105 110
Ala Pro Gly Asp Leu Asp His Val Phe Leu Thr Thr Gly Gly Ser Thr
115 120 125
Ala Val Asp Thr Ala Ile Arg Leu Met His Tyr Tyr Gln Asn Cys Arg
130 135 140
Gly Lys Arg Ala Lys Lys His Val Ile Thr Arg Ile Asn Ala Tyr His
145 150 155 160
Gly Ser Thr Phe Leu Gly Met Ser Leu Gly Gly Lys Ser Ala Asp Arg
165 170 175
Pro Ala Glu Phe Asp Phe Leu Asp Glu Arg Ile His His Leu Ala Cys
180 185 190
Pro Tyr Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Gly Leu Gly Glu Ala Glu Phe Leu
195 200 205
Asp Gly Leu Val Asp Glu Phe Glu Arg Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala
210 215 220
Asp Arg Val Gly Ala Phe Ile Ser Glu Pro Val Phe Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Val Ile Val Pro Pro Ala Gly Tyr His Arg Arg Met Trp Glu Leu Cys
245 250 255
Gln Arg Tyr Asp Val Leu Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Ser Phe
260 265 270
Gly Arg Leu Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Ala Val Phe Gly Val Gln
275 280 285
Pro Asp Ile Ile Leu Thr Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Gln Pro
290 295 300
Leu Gly Ala Cys Ile Phe Ser Arg Arg Ile Trp Glu Val Ile Ala Glu
305 310 315 320
Pro Asp Lys Gly Arg Cys Phe Ser His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His
325 330 335
Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ile Glu Ile Ile Glu Arg
340 345 350
Glu Gly Leu Leu Ala His Ala Asp Glu Val Gly Arg Tyr Phe Glu Glu
355 360 365
Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Ile Val Gly Asp Val Arg Gly
370 375 380
Met Arg Phe Met Ala Cys Val Glu Phe Val Ala Asp Lys Ala Ser Lys
385 390 395 400
Ala Leu Phe Pro Glu Ser Leu Asn Ile Gly Glu Trp Val His Leu Arg
405 410 415
Ala Gln Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Pro Ile Val His Leu Asn Val
420 425 430
Met Ser Pro Pro Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Val Asp Thr Val Val
435 440 445
Arg Val Leu Arg Glu Ser Ile Glu Glu Thr Val Glu Asp Leu Val Arg
450 455 460
Ala Gly His Arg
465
<210> 10
<211> 454
<212> PRT
<213> 丁香假单胞菌
<400> 10
Met Ser Ala Asn Asn Pro Gln Thr Leu Glu Trp Gln Ala Leu Ser Ser
1 5 10 15
Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys
20 25 30
Gly Pro Arg Ile Ile Thr Arg Ala Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser
35 40 45
Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ser Gly Leu Trp Cys Val Ala
50 55 60
Ile Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Ala Asp Ala Ala Ser Lys Gln Met
65 70 75 80
Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro
85 90 95
Val Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ser Asp Ile Ala Pro Glu Gly Met
100 105 110
Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Met
115 120 125
Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Gln Pro Asn Lys
130 135 140
Lys Thr Ile Ile Ser Arg Val Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Gly Gly Met Thr Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu
165 170 175
Pro Ile Pro Gly Val Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu
180 185 190
Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Ile Trp Ala Ala Glu Gln
195 200 205
Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Leu Gly Val Glu Asn Val Gly Ala Phe
210 215 220
Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Asp
225 230 235 240
Ser Tyr Trp Pro Lys Ile Lys Glu Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Leu
245 250 255
Phe Ala Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Ser Glu Trp
260 265 270
Phe Gly Ser Asp Phe Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Met Met Thr Ile Ala
275 280 285
Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Val Pro Met Gly Gly Leu Ile Val Arg
290 295 300
Asp Glu Ile Val Ala Val Leu Asn Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Glu Asn
325 330 335
Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Val Glu Arg Val Arg Ser Glu
340 345 350
Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Ser Asp His Pro
355 360 365
Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Leu Gly Ala Ile Glu Leu
370 375 380
Val Lys Asp Lys Thr Thr Arg Glu Arg Tyr Thr Asp Lys Gly Ala Gly
385 390 395 400
Met Ile Cys Arg Thr Phe Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala
405 410 415
Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Phe Ala
420 425 430
Gln Ile Asp Glu Leu Val Glu Lys Ala Arg Thr Cys Leu Asp Leu Thr
435 440 445
Leu Ala Val Leu Gln Gly
450
<210> 11
<211> 467
<212> PRT
<213> 球形红杆菌
<400> 11
Met Thr Arg Asn Asp Ala Thr Asn Ala Ala Gly Ala Val Gly Ala Ala
1 5 10 15
Met Arg Asp His Ile Leu Leu Pro Ala Gln Glu Met Ala Lys Leu Gly
20 25 30
Lys Ser Ala Gln Pro Val Leu Thr His Ala Glu Gly Ile Tyr Val His
35 40 45
Thr Glu Asp Gly Arg Arg Leu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Met Trp Cys
50 55 60
Ala Gln Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Ile Val Asp Ala Met Ala His
65 70 75 80
Gln Ala Met Val Leu Pro Tyr Ala Ser Pro Trp Tyr Met Ala Thr Ser
85 90 95
Pro Ala Ala Arg Leu Ala Glu Lys Ile Ala Thr Leu Thr Pro Gly Asp
100 105 110
Leu Asn Arg Ile Phe Phe Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Val Asp Ser
115 120 125
Ala Leu Arg Phe Ser Glu Phe Tyr Asn Asn Val Leu Gly Arg Pro Gln
130 135 140
Lys Lys Arg Ile Ile Val Arg Tyr Asp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ala Ala Cys Thr Gly Arg Thr Gly Asn Trp Pro Asn Phe Asp
165 170 175
Ile Ala Gln Asp Arg Ile Ser Phe Leu Ser Ser Pro Asn Pro Arg His
180 185 190
Ala Gly Asn Arg Ser Gln Glu Ala Phe Leu Asp Asp Leu Val Gln Glu
195 200 205
Phe Glu Asp Arg Ile Glu Ser Leu Gly Pro Asp Thr Ile Ala Ala Phe
210 215 220
Leu Ala Glu Pro Ile Leu Ala Ser Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Ala
225 230 235 240
Gly Tyr His Ala Arg Phe Lys Ala Ile Cys Glu Lys His Asp Ile Leu
245 250 255
Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Cys Gly Glu Trp
260 265 270
Phe Ala Ser Glu Lys Val Phe Gly Val Val Pro Asp Ile Ile Thr Phe
275 280 285
Ala Lys Gly Val Thr Ser Gly Tyr Val Pro Leu Gly Gly Leu Ala Ile
290 295 300
Ser Glu Ala Val Leu Ala Arg Ile Ser Gly Glu Asn Ala Lys Gly Ser
305 310 315 320
Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Asn Gln Pro Val Ala Cys Ala
325 330 335
Ala Ala Leu Ala Asn Ile Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Ile Val Asp
340 345 350
Gln Ala Arg Glu Met Ala Asp Tyr Phe Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu
355 360 365
Arg Asp Leu Pro Gly Val Ala Glu Thr Arg Ser Val Gly Leu Val Gly
370 375 380
Cys Val Gln Cys Leu Leu Asp Pro Thr Arg Ala Asp Gly Thr Ala Glu
385 390 395 400
Asp Lys Ala Phe Thr Leu Lys Ile Asp Glu Arg Cys Phe Glu Leu Gly
405 410 415
Leu Ile Val Arg Pro Leu Gly Asp Leu Cys Val Ile Ser Pro Pro Leu
420 425 430
Ile Ile Ser Arg Ala Gln Ile Asp Glu Met Val Ala Ile Met Arg Gln
435 440 445
Ala Ile Thr Glu Val Ser Ala Ala His Gly Leu Thr Ala Lys Glu Pro
450 455 460
Ala Ala Val
465
<210> 12
<211> 459
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 12
Met Asn Arg Leu Pro Ser Ser Ala Ser Ala Leu Ala Cys Ser Ala His
1 5 10 15
Ala Leu Asn Leu Ile Glu Lys Arg Thr Leu Asp His Glu Glu Met Lys
20 25 30
Ala Leu Asn Arg Glu Val Ile Glu Tyr Phe Lys Glu His Val Asn Pro
35 40 45
Gly Phe Leu Glu Tyr Arg Lys Ser Val Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Gly
50 55 60
Ala Val Glu Trp Gln Ala Gly Ser Leu Asn Thr Leu Val Asp Thr Gln
65 70 75 80
Gly Gln Glu Phe Ile Asp Cys Leu Gly Gly Phe Gly Ile Phe Asn Val
85 90 95
Gly His Arg Asn Pro Val Val Val Ser Ala Val Gln Asn Gln Leu Ala
100 105 110
Lys Gln Pro Leu His Ser Gln Glu Leu Leu Asp Pro Leu Arg Ala Met
115 120 125
Leu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Gly Lys Leu Lys Tyr Ser
130 135 140
Phe Phe Cys Asn Ser Gly Thr Glu Ser Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu
145 150 155 160
Ala Lys Ala Tyr Gln Ser Pro Arg Gly Lys Phe Thr Phe Ile Ala Thr
165 170 175
Ser Gly Ala Phe His Gly Lys Ser Leu Gly Ala Leu Ser Ala Thr Ala
180 185 190
Lys Ser Thr Phe Arg Lys Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Gly Phe Arg
195 200 205
His Val Pro Phe Gly Asn Ile Glu Ala Met Arg Thr Ala Leu Asn Glu
210 215 220
Cys Lys Lys Thr Gly Asp Asp Val Ala Ala Val Ile Leu Glu Pro Ile
225 230 235 240
Gln Gly Glu Gly Gly Val Ile Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Thr Ala
245 250 255
Val Arg Lys Leu Cys Asp Glu Phe Gly Ala Leu Met Ile Leu Asp Glu
260 265 270
Val Gln Thr Gly Met Gly Arg Thr Gly Lys Met Phe Ala Cys Glu His
275 280 285
Glu Asn Val Gln Pro Asp Ile Leu Cys Leu Ala Lys Ala Leu Gly Gly
290 295 300
Gly Val Met Pro Ile Gly Ala Thr Ile Ala Thr Glu Glu Val Phe Ser
305 310 315 320
Val Leu Phe Asp Asn Pro Phe Leu His Thr Thr Thr Phe Gly Gly Asn
325 330 335
Pro Leu Ala Cys Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ile Asn Val Leu Leu Glu
340 345 350
Gln Asn Leu Pro Ala Gln Ala Glu Gln Lys Gly Asp Met Leu Leu Asp
355 360 365
Gly Phe Arg Gln Leu Ala Arg Glu Tyr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala
370 375 380
Arg Gly Lys Gly Met Leu Met Ala Ile Glu Phe Val Asp Asn Glu Ile
385 390 395 400
Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Glu Met Phe Arg Gln Arg Val Leu Val Ala
405 410 415
Gly Thr Leu Asn Asn Ala Lys Thr Ile Arg Ile Glu Pro Pro Leu Thr
420 425 430
Leu Thr Ile Glu Gln Cys Glu Leu Val Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ala
435 440 445
Leu Ala Ala Met Arg Val Ser Val Glu Glu Ala
450 455
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> 河流弧菌
<400> 13
Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val
20 25 30
Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
50 55 60
His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
65 70 75 80
Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
85 90 95
Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
100 105 110
Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu
115 120 125
Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
130 135 140
Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
145 150 155 160
Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
180 185 190
Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
195 200 205
Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
210 215 220
Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
225 230 235 240
Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
245 250 255
Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
260 265 270
Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr
275 280 285
Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser
290 295 300
Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
325 330 335
Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
340 345 350
Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
355 360 365
Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
370 375 380
Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro
405 410 415
Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala
420 425 430
Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
435 440 445
Phe Ala Glu Val Ala
450
<210> 14
<211> 224
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 14
Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu
1 5 10 15
Asn Glu Arg Phe Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys
20 25 30
Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp
35 40 45
Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser
50 55 60
Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp
65 70 75 80
Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile
85 90 95
Cys Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys
100 105 110
Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr
115 120 125
Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr
130 135 140
His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly
165 170 175
Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His
195 200 205
Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu
210 215 220
<210> 15
<211> 222
<212> PRT
<213> 诺卡氏菌属物种NRRL 5646
<400> 15
Met Ile Glu Thr Ile Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Ala His Pro Ala Glu Glu His Leu Ile
20 25 30
Ala Lys Ser Val Glu Lys Arg Arg Arg Asp Phe Ile Gly Ala Arg His
35 40 45
Cys Ala Arg Leu Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Pro Pro Val Ala Ile
50 55 60
Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Ile Trp Pro Arg Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Ser Leu Thr His Cys Asp Gly Tyr Arg Ala Ala Ala Val Ala His Lys
85 90 95
Met Arg Phe Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Glu Pro His Ala Thr Leu
100 105 110
Pro Glu Gly Val Leu Asp Ser Val Ser Leu Pro Pro Glu Arg Glu Trp
115 120 125
Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Leu His Leu Asp Arg Leu Leu Phe Cys
130 135 140
Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp
145 150 155 160
Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly
180 185 190
Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp
195 200 205
Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala
210 215 220
<210> 16
<211> 382
<212> PRT
<213> 荧光假单胞菌
<400> 16
Met Gln Ile Gln Gly His Tyr Glu Leu Gln Phe Glu Ala Val Arg Glu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Gly Leu
20 25 30
Cys Ile Gln Ile Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Thr
35 40 45
Ala Asp Lys Asp Gly Thr Glu Ala Trp His Ser Asp Thr Ile Val Asn
50 55 60
Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln Leu
65 70 75 80
Val Ala Glu Gly Lys Leu Gln Leu Asp Ala Pro Val Ala Asn Tyr Trp
85 90 95
Pro Glu Phe Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu
100 105 110
Leu Cys His Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Met Leu Pro Thr
115 120 125
Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Arg Leu Met Val Asp Thr Leu Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly
165 170 175
Pro Gly Glu Ser Ile Val Ala Arg Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp
180 185 190
Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile
195 200 205
Ala Arg Ser Lys Gly Asn Met Gly Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Leu
210 215 220
Gln Val Met Met Arg Glu Pro Thr Ala Met Thr Thr Arg Ala Phe Ala
225 230 235 240
Asn Pro Pro Ser Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg
245 250 255
Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala
260 265 270
Gly Phe Tyr Ser Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ala Asp Met
275 280 285
Leu Glu Gln Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr Leu
290 295 300
Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Gln Pro
305 310 315 320
Gln Leu Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His
325 330 335
Pro Arg Ser Ala Pro Val Val Arg Trp Val Leu Pro Glu His Asp Val
340 345 350
Ala Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp
355 360 365
Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Cys Leu
370 375 380
<210> 17
<211> 246
<212> PRT
<213> 短乳杆菌
<400> 17
Met Ala Ala Asn Glu Phe Ser Glu Thr His Arg Val Val Tyr Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Asp Asp Thr Gly Gln Leu Thr Leu Ala Met Leu Ile Asn Leu Phe
20 25 30
Val Leu Val Ser Glu Asp Gln Asn Asp Ala Leu Gly Leu Ser Thr Ala
35 40 45
Phe Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val Thr Gln Tyr His Leu
50 55 60
His Ile Asp Glu Leu Pro Arg Thr Gly Ala Gln Val Thr Ile Lys Thr
65 70 75 80
Arg Ala Thr Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe Ala Tyr Arg Glu Tyr Trp Leu
85 90 95
Leu Asp Asp Ala Gly Gln Val Leu Ala Tyr Gly Glu Gly Ile Trp Val
100 105 110
Thr Met Ser Tyr Ala Thr Arg Lys Ile Thr Thr Ile Pro Ala Glu Val
115 120 125
Met Ala Pro Tyr His Ser Glu Glu Gln Thr Arg Leu Pro Arg Leu Pro
130 135 140
Arg Pro Asp His Phe Asp Glu Ala Val Asn Gln Thr Leu Lys Pro Tyr
145 150 155 160
Thr Val Arg Tyr Phe Asp Ile Asp Gly Asn Gly His Val Asn Asn Ala
165 170 175
His Tyr Phe Asp Trp Met Leu Asp Val Leu Pro Ala Thr Phe Leu Arg
180 185 190
Ala His His Pro Thr Asp Val Lys Ile Arg Phe Glu Asn Glu Val Gln
195 200 205
Tyr Gly His Gln Val Thr Ser Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Leu Thr
210 215 220
Thr Gln His Met Ile Lys Val Gly Asp Leu Thr Ala Val Lys Ala Thr
225 230 235 240
Ile Gln Trp Asp Asn Arg
245
<210> 18
<211> 261
<212> PRT
<213> 植物乳杆菌
<400> 18
Met Ala Thr Leu Gly Ala Asn Ala Ser Leu Tyr Ser Glu Gln His Arg
1 5 10 15
Ile Thr Tyr Tyr Glu Cys Asp Arg Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr
20 25 30
Leu Ile Asp Ile Ala Val Leu Ala Ser Glu Asp Gln Ser Asp Ala Leu
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Glu Met Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val
50 55 60
Thr Gln Tyr Ala Ile Asp Ile Thr Arg Met Pro Arg Gln Asp Glu Val
65 70 75 80
Val Thr Ile Ala Val Arg Gly Ser Ala Tyr Asn Pro Tyr Phe Ala Tyr
85 90 95
Arg Glu Phe Trp Ile Arg Asp Ala Asp Gly Gln Gln Leu Ala Tyr Ile
100 105 110
Thr Ser Ile Trp Val Met Met Ser Gln Thr Thr Arg Arg Ile Val Lys
115 120 125
Ile Leu Pro Glu Leu Val Ala Pro Tyr Gln Ser Glu Val Val Lys Arg
130 135 140
Ile Pro Arg Leu Pro Arg Pro Ile Ser Phe Glu Ala Thr Asp Thr Thr
145 150 155 160
Ile Thr Lys Pro Tyr His Val Arg Phe Phe Asp Ile Asp Pro Asn Arg
165 170 175
His Val Asn Asn Ala His Tyr Phe Asp Trp Leu Val Asp Thr Leu Pro
180 185 190
Ala Thr Phe Leu Leu Gln His Asp Leu Val His Val Asp Val Arg Tyr
195 200 205
Glu Asn Glu Val Lys Tyr Gly Gln Thr Val Thr Ala His Ala Asn Ile
210 215 220
Leu Pro Ser Glu Val Ala Asp Gln Val Thr Thr Ser His Leu Ile Glu
225 230 235 240
Val Asp Asp Glu Lys Cys Cys Glu Val Thr Ile Gln Trp Arg Thr Leu
245 250 255
Pro Glu Pro Ile Gln
260
<210> 19
<211> 397
<212> PRT
<213> 齿垢密螺旋体
<400> 19
Met Ile Val Lys Pro Met Val Arg Asn Asn Ile Cys Leu Asn Ala His
1 5 10 15
Pro Gln Gly Cys Lys Lys Gly Val Glu Asp Gln Ile Glu Tyr Thr Lys
20 25 30
Lys Arg Ile Thr Ala Glu Val Lys Ala Gly Ala Lys Ala Pro Lys Asn
35 40 45
Val Leu Val Leu Gly Cys Ser Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Ser Arg Ile
50 55 60
Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Gly Val Ser Phe Glu
65 70 75 80
Lys Ala Gly Ser Glu Thr Lys Tyr Gly Thr Pro Gly Trp Tyr Asn Asn
85 90 95
Leu Ala Phe Asp Glu Ala Ala Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Val Thr
100 105 110
Ile Asp Gly Asp Ala Phe Ser Asp Glu Ile Lys Ala Gln Val Ile Glu
115 120 125
Glu Ala Lys Lys Lys Gly Ile Lys Phe Asp Leu Ile Val Tyr Ser Leu
130 135 140
Ala Ser Pro Val Arg Thr Asp Pro Asp Thr Gly Ile Met His Lys Ser
145 150 155 160
Val Leu Lys Pro Phe Gly Lys Thr Phe Thr Gly Lys Thr Val Asp Pro
165 170 175
Phe Thr Gly Glu Leu Lys Glu Ile Ser Ala Glu Pro Ala Asn Asp Glu
180 185 190
Glu Ala Ala Ala Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Arg
195 200 205
Trp Ile Lys Gln Leu Ser Lys Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Cys Ile
210 215 220
Thr Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Ala Thr Gln Ala Leu Tyr
225 230 235 240
Arg Lys Gly Thr Ile Gly Lys Ala Lys Glu His Leu Glu Ala Thr Ala
245 250 255
His Arg Leu Asn Lys Glu Asn Pro Ser Ile Arg Ala Phe Val Ser Val
260 265 270
Asn Lys Gly Leu Val Thr Arg Ala Ser Ala Val Ile Pro Val Ile Pro
275 280 285
Leu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Lys Val Met Lys Glu Lys Gly Asn His
290 295 300
Glu Gly Cys Ile Glu Gln Ile Thr Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Leu Tyr
305 310 315 320
Arg Lys Asp Gly Thr Ile Pro Val Asp Glu Glu Asn Arg Ile Arg Ile
325 330 335
Asp Asp Trp Glu Leu Glu Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Ser Ala Leu
340 345 350
Met Glu Lys Val Thr Gly Glu Asn Ala Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ala
355 360 365
Gly Tyr Arg His Asp Phe Leu Ala Ser Asn Gly Phe Asp Val Glu Gly
370 375 380
Ile Asn Tyr Glu Ala Glu Val Glu Arg Phe Asp Arg Ile
385 390 395
<210> 20
<211> 539
<212> PRT
<213> 纤细眼虫
<400> 20
Met Ser Cys Pro Ala Ser Pro Ser Ala Ala Val Val Ser Ala Gly Ala
1 5 10 15
Leu Cys Leu Cys Val Ala Thr Val Leu Leu Ala Thr Gly Ser Asn Pro
20 25 30
Thr Ala Leu Ser Thr Ala Ser Thr Arg Ser Pro Thr Ser Leu Val Arg
35 40 45
Gly Val Asp Arg Gly Leu Met Arg Pro Thr Thr Ala Ala Ala Leu Thr
50 55 60
Thr Met Arg Glu Val Pro Gln Met Ala Glu Gly Phe Ser Gly Glu Ala
65 70 75 80
Thr Ser Ala Trp Ala Ala Ala Gly Pro Gln Trp Ala Ala Pro Leu Val
85 90 95
Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Leu Trp Trp Trp Ala Ala Arg Arg
100 105 110
Ser Val Arg Arg Pro Leu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Pro Thr Ala Val
115 120 125
Thr His Leu Ala Pro Pro Met Ala Met Phe Thr Thr Thr Ala Lys Val
130 135 140
Ile Gln Pro Lys Ile Arg Gly Phe Ile Cys Thr Thr Thr His Pro Ile
145 150 155 160
Gly Cys Glu Lys Arg Val Gln Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Arg Ala His
165 170 175
Pro Pro Thr Ser Pro Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Ile Gly Cys Ser
180 185 190
Thr Gly Tyr Gly Leu Ser Thr Arg Ile Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gln
195 200 205
Ala Ala Thr Leu Gly Val Phe Leu Ala Gly Pro Pro Thr Lys Gly Arg
210 215 220
Pro Ala Ala Ala Gly Trp Tyr Asn Thr Val Ala Phe Glu Lys Ala Ala
225 230 235 240
Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ala Phe Asp
245 250 255
Ser Thr Thr Lys Ala Arg Thr Val Glu Ala Ile Lys Arg Asp Leu Gly
260 265 270
Thr Val Asp Leu Val Val Tyr Ser Ile Ala Ala Pro Lys Arg Thr Asp
275 280 285
Pro Ala Thr Gly Val Leu His Lys Ala Cys Leu Lys Pro Ile Gly Ala
290 295 300
Thr Tyr Thr Asn Arg Thr Val Asn Thr Asp Lys Ala Glu Val Thr Asp
305 310 315 320
Val Ser Ile Glu Pro Ala Ser Pro Glu Glu Ile Ala Asp Thr Val Lys
325 330 335
Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Leu Trp Ile Gln Ala Leu Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Val Leu Ala Glu Gly Ala Lys Thr Val Ala Tyr Ser Tyr Ile
355 360 365
Gly Pro Glu Met Thr Trp Pro Val Tyr Trp Ser Gly Thr Ile Gly Glu
370 375 380
Ala Lys Lys Asp Val Glu Lys Ala Ala Lys Arg Ile Thr Gln Gln Tyr
385 390 395 400
Gly Cys Pro Ala Tyr Pro Val Val Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala
405 410 415
Ser Ser Ala Ile Pro Val Val Pro Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Tyr Arg
420 425 430
Val Met Lys Glu Lys Gly Thr His Glu Gly Cys Ile Glu Gln Met Val
435 440 445
Arg Leu Leu Thr Thr Lys Leu Tyr Pro Glu Asn Gly Ala Pro Ile Val
450 455 460
Asp Glu Ala Gly Arg Val Arg Val Asp Asp Trp Glu Met Ala Glu Asp
465 470 475 480
Val Gln Gln Ala Val Lys Asp Leu Trp Ser Gln Val Ser Thr Ala Asn
485 490 495
Leu Lys Asp Ile Ser Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Thr Glu Phe Leu Arg
500 505 510
Leu Phe Gly Phe Gly Ile Asp Gly Val Asp Tyr Asp Gln Pro Val Asp
515 520 525
Val Glu Ala Asp Leu Pro Ser Ala Ala Gln Gln
530 535
<210> 21
<211> 269
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌
<400> 21
Met Ile Asn Lys Thr Leu Leu Gln Lys Arg Phe Asn Gly Ala Ala Val
1 5 10 15
Ser Tyr Asp Arg Tyr Ala Asn Val Gln Lys Lys Met Ala His Ser Leu
20 25 30
Leu Ser Ile Leu Lys Glu Arg Tyr Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Ile
35 40 45
Leu Glu Leu Gly Cys Gly Thr Gly Tyr Val Thr Glu Gln Leu Ser Lys
50 55 60
Leu Phe Pro Lys Ser His Ile Thr Ala Val Asp Phe Ala Glu Ser Met
65 70 75 80
Ile Ala Ile Ala Gln Thr Arg Gln Asn Val Lys Asn Val Thr Phe His
85 90 95
Cys Glu Asp Ile Glu Arg Leu Arg Leu Glu Glu Ser Tyr Asp Val Ile
100 105 110
Ile Ser Asn Ala Thr Phe Gln Trp Leu Asn Asn Leu Gln Gln Val Leu
115 120 125
Arg Asn Leu Phe Gln His Leu Ser Ile Asp Gly Ile Leu Leu Phe Ser
130 135 140
Thr Phe Gly His Glu Thr Phe Gln Glu Leu His Ala Ser Phe Gln Arg
145 150 155 160
Ala Lys Glu Glu Arg Asn Ile Lys Asn Glu Thr Ser Ile Gly Gln Arg
165 170 175
Phe Tyr Ser Lys Asp Gln Leu Leu His Ile Cys Lys Ile Glu Thr Gly
180 185 190
Asp Val His Val Ser Glu Thr Cys Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Glu Val
195 200 205
Lys Glu Phe Leu His Ser Ile Arg Lys Val Gly Ala Thr Asn Ser Asn
210 215 220
Glu Gly Ser Tyr Cys Gln Ser Pro Ser Leu Phe Arg Ala Met Leu Arg
225 230 235 240
Ile Tyr Glu Arg Asp Phe Thr Gly Asn Glu Gly Ile Met Ala Thr Tyr
245 250 255
His Ala Leu Phe Ile His Ile Thr Lys Glu Gly Lys Arg
260 265
<210> 22
<211> 132
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 22
Met Ser Thr Thr His Asn Val Pro Gln Gly Asp Leu Val Leu Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ala Met Pro Ala Asp Thr Asn Ala Asn Gly Asp Ile Phe Gly Gly
20 25 30
Trp Leu Met Ser Gln Met Asp Ile Gly Gly Ala Ile Leu Ala Lys Glu
35 40 45
Ile Ala His Gly Arg Val Val Thr Val Arg Val Glu Gly Met Thr Phe
50 55 60
Leu Arg Pro Val Ala Val Gly Asp Val Val Cys Cys Tyr Ala Arg Cys
65 70 75 80
Val Gln Lys Gly Thr Thr Ser Val Ser Ile Asn Ile Glu Val Trp Val
85 90 95
Lys Lys Val Ala Ser Glu Pro Ile Gly Gln Arg Tyr Lys Ala Thr Glu
100 105 110
Ala Leu Phe Lys Tyr Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Lys Pro Arg Ala
115 120 125
Leu Pro Val Glu
130
<210> 23
<211> 286
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 23
Met Ser Gln Ala Leu Lys Asn Leu Leu Thr Leu Leu Asn Leu Glu Lys
1 5 10 15
Ile Glu Glu Gly Leu Phe Arg Gly Gln Ser Glu Asp Leu Gly Leu Arg
20 25 30
Gln Val Phe Gly Gly Gln Val Val Gly Gln Ala Leu Tyr Ala Ala Lys
35 40 45
Glu Thr Val Pro Glu Glu Arg Leu Val His Ser Phe His Ser Tyr Phe
50 55 60
Leu Arg Pro Gly Asp Ser Lys Lys Pro Ile Ile Tyr Asp Val Glu Thr
65 70 75 80
Leu Arg Asp Gly Asn Ser Phe Ser Ala Arg Arg Val Ala Ala Ile Gln
85 90 95
Asn Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Met Thr Ala Ser Phe Gln Ala Pro Glu
100 105 110
Ala Gly Phe Glu His Gln Lys Thr Met Pro Ser Ala Pro Ala Pro Asp
115 120 125
Gly Leu Pro Ser Glu Thr Gln Ile Ala Gln Ser Leu Ala His Leu Leu
130 135 140
Pro Pro Val Leu Lys Asp Lys Phe Ile Cys Asp Arg Pro Leu Glu Val
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Phe His Asn Pro Leu Lys Gly His Val Ala Glu Pro
165 170 175
His Arg Gln Val Trp Ile Arg Ala Asn Gly Ser Val Pro Asp Asp Leu
180 185 190
Arg Val His Gln Tyr Leu Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Leu Asn Phe Leu
195 200 205
Pro Val Ala Leu Gln Pro His Gly Ile Gly Phe Leu Glu Pro Gly Ile
210 215 220
Gln Ile Ala Thr Ile Asp His Ser Met Trp Phe His Arg Pro Phe Asn
225 230 235 240
Leu Asn Glu Trp Leu Leu Tyr Ser Val Glu Ser Thr Ser Ala Ser Ser
245 250 255
Ala Arg Gly Phe Val Arg Gly Glu Phe Tyr Thr Gln Asp Gly Val Leu
260 265 270
Val Ala Ser Thr Val Gln Glu Gly Val Met Arg Asn His Asn
275 280 285
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