一种测定微藻单藻落脂肪酸成分构成的方法
【专利摘要】本发明是一种测定微藻单藻落脂肪酸成分构成的方法。本发明解决了现有技术在微藻油脂成分分析过程使用的甲酯化方法需样量大、操作步骤多和耗时长的技术问题。本发明方法无需制备干燥藻粉，无需提取藻油，在饱和碱催化条件下，直接对微藻的单藻落进行甲酯化反应：一个大小约2-5mm的微藻单藻落，加入1ml的饱和KOH-CH3OH溶液，对单藻落样品进行皂化和甲酯化，在充分混合震荡作用后，加入1ml正己烷，萃取得到的脂肪酸甲酯，即可进行气相色谱分析。本发明方法适用于绿藻门、金藻门、硅藻门等单细胞藻类进行快速及在线监测的脂肪酸成分分析。
【专利说明】一种测定微藻单藻落脂肪酸成分构成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于能源微藻领域，具体的说是一种以微藻单藻落为原料的微量快速分析 其脂肪酸成分构成方法。
【背景技术】
[0002] 目前，中国经济的高速发展令世人瞩目，但是，环境污染和能源不足对中国经济持 续高速发展的负面影响也越来越凸显。在能源方面。我国化石能源，特别是石油储量不足， 不仅制约经济高速发展，甚至危害到国家能源安全。
[0003] 微藻作为重要的生物能源原料，具有生物量大、生长周期短、易培养以及含有较高 的脂类物质等优点，不仅在大气C02的循环利用中起着重要作用，而且还是制备生物质液体 燃料的良好材料，具有广阔的开发和利用前景。
[0004] 脂肪酸作为能源微藻的一种重要产物，无论是在藻种筛选还是在微藻的培养过程 中，其含量的积累和变化都为进一步的研究开发提供理论依据和技术参数。
[0005] 对于微藻脂肪酸的测定，目前还没有标准方法，大多数的方法是用有机溶剂提取 浓缩后得到的微藻粗脂肪，再对粗脂肪进行皂化和甲酯化，用有机溶剂提取，最后用GC来 测定脂肪酸的含量。但是现有方法大都操作复杂、处理时间长，不适合快速检测。因此，快 速、简便、准确的测定脂肪酸成分构成，是今后一段时间的研究热点。本方法即针对这一问 题，开展微藻脂肪酸快速测定方法研究，以期为其应用提供前期基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速检测微藻中脂肪酸成分构成 的方法，本方法与传统常用的微藻脂肪酸提取制备方法比较，具有操作步骤简单、快速等优 点。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0008] 取一个微藻的单藻落或等量微藻样品（约0? 01_5mg)，加入1ml的饱和K0H-CH30H 溶液，对单藻落样品进行皂化和甲酯化，在充分混合震荡作用后，加入1ml正己烷，萃取得 到的脂肪酸甲酯，即可进行气相色谱分析。
[0009]具体步骤如下：
[0010] (1)脂肪酸的甲酯化：
[0011] 取一个微藻的单藻落或等量微藻样品（约0. 01_5mg)，将其加入1ml的饱和 K0H-CH30H溶液，超声清洗辅助震荡反应5min，再加入lml正己烷，震荡萃取，静置后得到己 烷层即为脂肪酸甲酯，可进行气相色谱分析；
[0012] (2)脂肪酸的气相色谱检测条件：
[0013]a、色谱柱：DB-23 毛细管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim);
[0014]b、载气：氮气，流速为0.6ml/min，进样口温度270°C，FID检测器，检测器温度 280。。；
[0015] c、升温程序为：初温130°C，5°C/min升至170°C，再以3°C/min升温至220°C，保 持lOmin;
[0016] d、分流比为10:1，分流进样，进样量liiL;
[0017] e、脂肪酸成分构成，定性由与标准品的保留时间对照来确定，成分构成由各组分 对应峰面积归一化计算得来。
[0018] 同时，本发明除了应用在单藻落的脂肪酸成分分析，还可以应用在与单藻落等量 的微藻样品中，如可以将0. 01-5mg的藻粉使用同样的方法进行转酯化反应，即可快速的得 到其脂肪酸成分结果。这样便可以将此方法应用于培养过程的在线监测。
[0019] 本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0020] 1.样品用量极少，可实现微藻培养过程监控；
[0021] 2.无需制备干燥藻粉；
[0022] 3.无需提取藻种油脂，减少了操作步骤；
[0023] 4.缩短样品甲酯化时间，最快可在0. 5小时内完成检测，大大的节省了时间成本。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过具体实施例对本发明方法和结果进行说明。
[0025] 使用气相色谱对其脂肪酸甲酯成分进行分析。
[0026] a、色谱柱：DB-23 毛细管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim);
[0027]b、载气：氮气，流速为0.6ml/min，进样口温度270°C，FID检测器，检测器温度 280。。；
[0028] c、升温程序为：初温130°C，5°C/min升至170°C，再以3°C/min升温至220°C，保 持lOmin;
[0029] d、分流比为10:1，分流进样，进样量liiL;
[0030] e、脂肪酸成分构成，定性由与标准品的保留时间对照来确定，成分构成由各组分 对应峰面积归一化计算得来。
[0031] 藻种：湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis)、亚心形四月藻（Tetraselmis subcordiformis)、杜氏盐藻（Dunaliellasalina)、叉鞭金藻（Dicrateriainornata)、莱 茵衣藻（Chlamydomonasreinhardti)
[0032] 实施例1 :
[0033] 选用同一份湛江等鞭金藻的藻粉样品，分别使用常规使用的酸催化转酯化方法和 本方法进行对比，验证本方法的可行性。
[0034] 称取两份约5mg金藻藻粉，一份为5. 7mg，加入5ml的体积浓度1%的硫酸-甲醇 溶液，在70°C水浴加热，反应lh，待反应体系降至室温后，向其中加入0. 75ml的去离子水和 2ml的正己烷进行充分震荡混匀，静置分层后取上层己烷层使用气相色谱对其脂肪酸甲酯 成分进行分析；
[0035] 另一份使用本方法进行转酯化，向称取好的4. 9mg藻粉中加入1ml的饱和 K0H-CH30H溶液，超声清洗辅助震荡反应5min，再加入lml正己烷，震荡萃取，静置后得到己 烷层即为脂肪酸甲酯，收集正己烷层，使用气相色谱对其脂肪酸甲酯成分进行分析。
[0036] 两种方法的测得的脂肪酸成分结果相似，证明本方法可行。具体数据见表1。
[0037] 表1.比较常规方法和本方法得到的脂肪酸成分构成的分析结果
[0038]
[0039]
【权利要求】
1. 一种测定微藻单藻落脂肪酸成分构成的方法，其特征在于：取一个微藻的单藻落或 等量微藻样品，加入饱和的koh-ch3oh溶液，充分混合震荡，进行皂化和甲酯化反应，加入正 己烷萃取脂肪酸甲酯，对该组分进行气相色谱分析。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于： 具体步骤如下： (1) 脂肪酸的甲酯化： 取质量为〇. 〇l_5mg的一个微藻的单藻落或微藻样品，将其加入0. 5-2ml的饱和 KOH-CH3OH溶液，超声清洗辅助震荡反应3-20min，再加入0. 5-2ml正己烷，震荡萃取，静置 后得到正己烷层即为脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯进行气相色谱分析； (2) 脂肪酸甲酯的气相色谱检测条件(碳数从8到24的饱和及不饱和脂肪酸甲酯均可 检测）： a、 色谱柱：DB-23 毛细管柱（30mX0. 32mmX0. 25iim); b、 载气：氮气，流速为0. 6ml/min，进样口温度270°C，FID检测器，检测器温度280°C ; c、 升温程序为：初温130°C，5°C /min升至170°C，再以3°C /min升温至220°C，保持 lOmin ； d、 分流比为10:1，分流进样，进样量1 y L ; e、 由气相色谱数据获知脂肪酸甲酯的成分构成，进一步即获知微藻单藻落或微藻样品 脂肪酸成分构成。
3. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于： 步骤（2) e中由气相色谱数据获知脂肪酸甲酯的成分构成，其脂肪酸甲酯的成分构成 的定性结论由气相色谱数据与标准品的保留时间对照来确定，成分的相对定量结论构成由 各组分对应峰面积归一化计算得来。
4. 按照权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述微藻为红藻、硅藻、绿藻或金 藻。
【文档编号】G01N30/06GK104458982SQ201310422373
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】薛松, 刘亚男, 曹旭鹏, 艾江宁 申请人:中国科学院大连化学物理研究所