LC‑MS/MS法同时测定烟草中游离氨基酸和Amadori化合物的方法与流程

本发明属于烟草中成分分析领域，具体涉及一种lc-ms/ms同时测定烟草中游离氨基酸和amadori化合物的方法。

背景技术：

maillard反应是羰基化合物和氨基化合物之间发生的一系列非酶促棕色化反应，发生在烟叶成熟和烘烤过程中，对烤烟品质、颜色产生显著影响。氨基酸和amadori化合物(1-氧基-1-脱氧-2-酮糖)作为美拉德反应的重要反应底物和初级产物，研究其含量及其变化规律对评价烟草品质，加强该类化合物在烟叶调制、醇化，卷烟加工、贮藏等过程中的监控，及优化卷烟配方设计、提高卷烟香气质量具有指导性作用。

由于游离氨基酸和amadori化合物具有极性高、挥发性低、无强发色基团等特点，其给其分离和检测造成困难。关于氨基酸和amadori化合物的分别测定已有较多文献报道，主要采用液相色谱分离，以蒸发光散射检测器、衍生后紫外检测器、电化学检测器等作为检测手段。但这些方法存在前处理步骤繁琐、杂质干扰难以消除、重现性和准确性差等缺点。近年来，也有研究人员用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法单独分析氨基酸和amadori化合物，由于氨基酸和amadori化合物的极性较强，难于在普通的反相c18柱上实现其同时检测。为了避免繁琐耗时的衍生化步骤，troise等人采用九氟戊酸作为离子对试剂，通过离子对液相色谱法对食品中的游离氨基酸和对应的amadori化合物实现了同时分离，并通过高分辨质谱实现了包括多种没有标准品的amadori化合物在内的目标化合物的定性定量分析。但九氟戊酸会在色谱柱中不断积聚残留，造成色谱柱性质的改变和损伤，长期使用也会对质谱造成污染，且离子对试剂的使用需要更长的色谱柱平衡和洗脱时间，对实验条件和仪器设备的稳定性要求更高，不利于样品的长期高通量分析。曹长春等人采用亲水性作用色谱(hilic)法同时测定了2种氨基酸及其对应的amadori化合物等5种物质，但亲水性作用色谱适用的梯度范围较窄，造成其在复杂基质样品中多种目标化合物分析上的局限性。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明用了一款对氨基酸有较好保留能力的acclaimexplosivee2柱用于烟草中游离氨基酸和amadori化合物的同时分离，实验结果表明，在以甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相的条件下，该色谱柱同时对氨基酸和amadori化合物都具有良好的分离效果。

本发明采用的技术方案：

样品用溶剂提取后，用lc-ms/ms分析定性定量，其中液相色谱柱为acclaimexplosivee2分析色谱柱。

本发明lc-ms/ms法同时测定烟草中游离氨基酸和amadori化合物的方法，方法包括以下步骤：

(1)工作溶液的配制：

标准储备液的配制，称取氨基酸化合物和amadori化合物标准品，用超纯水配制成混合标准品储备液量备用；称取内标物量，配制内标物混合储备液；

标准工作溶液的配制，以超纯水为稀释液，配制成氨基酸化合物和amadori化合物的系列混合标准溶液；

(2)样品前处理：

精确称取烟草样品0.1g于50ml离心管中，加入内标物储备液，用溶剂10-30ml超声萃取10-30min，取萃取液2ml于8000r/min离心15min后过0.22μm微孔滤膜过滤上机；

(3)用lc-ms/ms分析：

液相色谱条件：色谱柱为acclaimexplosivee2分析色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相流速为400μl/min；柱温为30℃；进样量为2μl；其中流动相为甲醇-水、乙腈-水、0.1％甲酸水溶液-甲醇、0.1％乙酸水溶液-甲醇或0.1％甲酸含5mmol/l甲酸铵水溶液-甲醇流动相体系中的一种；

质谱条件：离子源：esi源；检测方式：正离子检测；扫描方式：mrm；喷雾电压：3200v；鞘气压力35arb；辅助气压力8arb；毛细管温度275℃；气化温度150℃；碰撞室压力1.0mtorr。

内标物为2-氨基丁酸和缬氨酸-d8，其中2-氨基丁酸简写为2-aba，其中缬氨酸-d8简写为val-d8。

步骤(2)样品前处理中萃取溶剂为水。

液相条件中流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～4.7min，4％a～35％a；4.7～8.7min，35％a～77％a；8.7～13.0min，77％a～100％a；13.1～19.0min，1％a～1％a。

本发明相对于现有技术达到的有益效果：

(1)由于氨基酸和amadori化合物的极性较强，难于在普通的反相c18柱上实现其同时检测，本发明采用了一款对氨基酸有较好保留能力的acclaimexplosivee2柱用于烟草中氨基酸和amadori化合物的同时分离。该色谱柱是用于hplc分析硝酸酯和硝胺类爆炸物的专用色谱柱，因此对含有氨基的化合物具有特异选择性。实验结果表明，在以甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相的条件下，该色谱柱不仅对氨基酸有良好的分离效果，对amadori化合物也有良好的保留，因此实验选择该款色谱柱用于两种目标化合物的同时分离测定。

(2)本发明还分别比较了甲醇-水、乙腈-水、0.1％(v/v)甲酸水溶液-甲醇、0.1％(v/v)乙酸水溶液-甲醇、0.1％甲酸(v/v)含(5mmol/l甲酸铵)水溶液-甲醇流动相体系对氨基酸和amadori化合物的分离效果。结果表明：由于甲醇的洗脱能力相对乙腈较弱，因此甲醇-水体系对基质复杂的烟草样品中的目标化合物表现出了更好的分离能力；酸的加入增强了目标化学物的响应强度并改善峰形，而以0.1％的甲酸水溶液作为流动相较0.1％的乙酸溶液更能提高目标化合物的质谱信号响应强度；虽然有报道，在氨基酸的分析中加入缓冲盐可改善色谱峰形、调节保留，但实验发现，与0.1％(v/v)甲酸水溶液-甲醇流动相体系相比，5mmol/l甲酸铵的加入，抑制了大部分目标化合物的响应强度，降低了检测灵敏度。比较了0.1％和0.2％的甲酸加入量对色谱出峰的影响，结果发现，加入量的提高并没有带来目标化合物响应信号的明显提高，由于过高的酸含量对色谱柱的使用寿命有一定的影响，因此本发明优选0.1％甲酸水溶液-甲醇的流动相体系用于游离氨基酸和amadori化合物的同时分离分析。

(3)由于游离氨基酸amadori化合物的极性较强，本发明比较了水、0.1％甲酸、0.1％乙酸、0.1％hcl、和20％甲醇水(均为体积比)等极性较强的提取溶剂对氨基酸和amdori化合物的提取效果。结果表明，对于大多数目标化合物，水的萃取效率略高于其他几种萃取溶剂。当以0.1％hcl作为提取溶剂时，arg、tyr、ile、leu、fru-pro、fru-val测定含量明显降低，仅为水提取含量的30.4-65.4％左右，这可能是由于hcl酸性略强，与部分氨基酸和amadori化合物发生反应的结果。因此本发明优选水作为提取溶剂。

采用水作为提取溶剂，分别萃取10、20、30min，比较萃取时间对萃取结果的影响，结果表明，当萃取时间为10min的时候已萃取完全，因此本发明优选选择10min为萃取时间。

(4)内标化合物的选择：lc-ms/ms采用mrm模式对目标化合物进行定量分析，具有更好的选择性。但是，复杂的基质也会对目标化合物造成一定的离子增强或抑制作用，从而导致定量的偏差。烟草行业多采用正缬氨酸(nva)作为内标物质降低复杂基质对氨基酸测定的影响。实验发现，由于nva与val是同分异构体，质量数相同且出峰时间相近，因此在分离过程中极易对val的测定造成干扰，对梯度条件要求苛刻；而2-aba作为内标物质，由于质量数不同，不会对氨基酸类目标化合造成影响。进行方法学验证时，除val的回收率为75.48％外，其他氨基酸的回收率均＞80％。后采用同位素标记的内标化合物val-d8对val进行校正，回收率达到91％，说明同位素内标因具有与目标化合物相似的性质和色谱、质谱行为，补偿了大部分的基质效应，具有良好的校正效果，但val-d8并不适用于其他目标氨基酸的定量校正，其回收率均低于2-aba作为内标时的回收率，且多个目标化合物的回收率＜80％。由于氘代内标价格昂贵，因此本发明优选2-aba对15种氨基酸进行校正，优选val-d8对val进行校正。

(5)本发明提供了一种高效液相色谱-质谱联用(lc-ms/ms)同时测定烟草中的游鸪氨基酸和amadori化合物的分析方法。烟草样品经水提取后，以甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，经acclaimexplosivee2柱分离，采用电喷雾离子源以正离子多反应监测模式进行质谱检测。结果表明，目标化合物在线性范围内线性关系良好(r²＞0.99)，回收率为82.0％～109.5％，日内rsd％为0.6％～4.8％(n＝6)，日间rsd％为1.3％～10.9％(n＝6)。本方法避免了繁琐的衍生化步骤和复杂液相色谱条件的使用，具有前处理简单、灵敏度高、特异性强的特点，且适用于高通量烟草样品中目标化合物的定量分析，可为研究游离氨基酸和amadori化合物对烟草品质的影响提供参考。

附图说明

图1：标准品中待测组分和内标的mrm色谱图，1.lys；2.arg；3.ser；4.asn；5.ala；6.gln；7.asp；8.thr；9.glu；10.fru-ala；11.2-aba；12.pro；13.fru-pro；14.val-d8；15.val；16.fru-val；17.tyr；18.ile；19.leu；20.fru-leu；21.phe；22.fru-phe；23.trp；24.fru-trp；

图2烤烟样品中待测组分和内标的mrm色谱图；

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

thermoscientific液相色谱-质谱联用仪，配有acclea1250型液相色谱仪和vantage三重四极杆质谱仪：美国thermofisher公司；scanspeedminiblue型离心机：美国基因有限公司；t701dh型超声波振荡器：德国elma公司；milli-qelement型超纯水仪：美国密理博公司；ab104-s型电子天平：瑞士mettler-toledo仪器公司。

甲醇、乙腈均为色谱纯：美国fisher公司；甲酸：纯度≥98％，德国cnw公司；乙酸：色谱纯，美国迪马公司；甲酸铵、乙酸铵：纯度≥99％、实验用氨基酸标准品：纯度均≥98％：l-赖氨酸(lys)、l-精氨酸(arg)、l-丝氨酸(ser)、l-天冬酰胺(asn)、l-丙氨酸(ala)、l-谷氨酰胺(gln)、l-天冬氨酸(asp)、l-酪氨酸(tyr)、l-异亮氨酸(ile)、l-色氨酸(trp)、dl-2-氨基丁酸(2-aba，内标)：均购自美国sigma公司；l-苏氨酸(thr)、l-谷氨酸(glu)、l-脯氨酸(pro)、l-缬氨酸(val)、l-亮氨酸(leu)、l-苯丙氨酸(phe)：均购自北京百灵威科技有限公司；dl-缬氨酸-d8(val-d8，内标)：美国cil公司；amadori化合物标准品：纯度均≥95％：1-l-丙氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-ala)、1-l-脯氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-pro)、1-l-缬氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-val)、1-l-亮氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-leu)、1-l-苯丙氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-phe)、1-l-色氨酸-1-脱氧-d-果糖(fru-trp)：均购自加拿大trc公司。本发明所用烟草样品分别产自云南和贵州。

实施例一

(1)工作溶液的配制

称取16种氨基酸化合物对照品适最，用超纯水溶液配置浓度均为5μmol/ml的混合氨基酸对照品储备液量备用。精密称取6种amadori化合物标准品适量，用超纯水配置6种对照品的混合储备液，浓度均为1000μg/ml。称取2-aba、val-d8内标适量，以水为稀释液，配制浓度分别为39mmol/ml和16mmol/ml的一级内标混合储备液。于4℃冰箱保存。

以水为稀释液，配制浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.5、1、5、10、25、50、75、125、250μmol/l的16种氨基酸的系列混合标准溶液；配制pro浓度为500μmol/l的系列标准溶液，由于pro在烟草样品中的含量高于明显高于其它氨基酸，为了满足实际样品分析，需要单独；配制2-aba、val-d8浓度为3900μmol/l和1600μmol/l的二级内标混合溶液，将6种amadori化合物配制成浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、12、16、20、24、36、60μg/ml的系列混合标准溶液，其中含内标val-d8浓度为80μmol/l，2-aba浓度为195μmol/l。

(2)样品前处理

精密称取烟草样品0.1g于50ml离心管中，加入一级内标储备液0.1ml，20ml超纯水，超声萃取10min，取萃取液2ml于8000r/min离心15min后过0.22μm微孔滤膜过滤上机。

(3)用lc-ms/ms分析，液相色谱与质谱条件

色谱柱为戴安acclaimexplosivee2柱，250×4.6mm，5μm；流动相：甲醇(a)，0.1％(v/v)甲酸水溶液(b)；流速为400μl/min；柱温为30℃；进样量为2μl；梯度洗脱程序：0～4.7min，4％a～35％a；4.7～8.7min，35％a～77％a；8.7～13.0min，77％a～100％a；13.1～19.0min，1％a～1％a。

离子源：esi源；检测方式：正离子检测；扫描方式：mrm；喷雾电压：3200v；鞘气压力35arb；辅助气压力8arb；毛细管温度275℃；气化温度150℃；碰撞室压力1.0mtorr；16种氨基酸和6种amadori化合物2种内标的保留时间、离子对及其他质谱参数见表1。

表116种氨基酸、6种amadori化合物和2种内标的多反应监测参数

实施例二

由于游离氨基酸和amadori化合物的极性较强，按照本发明实施例1的方法，本发明比较了萃取目标化合物常用的水、0.1％甲酸、0.1％乙酸、0.1％hcl、和20％甲醇水(均为体积比)等极性较强的提取溶剂对氨基酸和amdori化合物的提取效果。表2的结果表明，对于大多数目标化合物，水的萃取效率略高于其他几种萃取溶剂，当以0.1％hcl作为提取溶剂时，arg、tyr、ile、leu、fru-pro、fru-val测定含量明显降低，仅为水提取含量的30.4％～65.4％，因此本发明选择水作为提取溶剂。

表2不同萃取溶剂对萃取结果的影响

实施例三

按照本发明实施例1的方法，采用水作为提取溶剂，分别萃取10、20、30min，比较萃取时间对萃取结果的影响。表3的结果表明，当萃取时间为10min的时候已萃取完全，因此本发明优选选择10min为最佳萃取时间。

表3不同萃取时间对萃取结果的影响

实施例四

按照本发明实施例1的方法对配制的标准工作溶液进行lc-ms/ms分析，氨基酸分析以对照品的质量浓度(x)为横坐标，对照品峰面积与内标峰面积的比值(y)为纵坐标，amadori化合物以对照品的质量浓度(x)为横坐标，对照品峰面积(y)为纵坐标，氨基酸、amadori化合物分别加权(1/x，1/x²)进行线性回归，得到回归方程(见表3，4)，各检测组分的线性关系良好(r²＞0.997)。

分别将氨基酸和amadori化合物混合对照品储备液用水逐级稀释后，在优化的色谱条件下测定，将信噪比为3(s/n＝3)时所对应的检测成分的含量定为检出限(lod)，结果见表4和表5。

表416种游离氨基酸的线性范围、线性方程、相关系数(r²)和检出限

表56种amadori化合物的线性范围、线性方程、相关系数(r²)和检出限

实施例五

对某一烤烟样品进行了日内和日间平行测定，考察了方法的精密度。每日按照实施例1的实验条件处理、测定平行样品6份，连续测定6天，计算目标物的日内和日间rsd％。结果表明，见表4，氨基酸和amadori化合物的日内rsd％在0.6％～4.8％之间，日间rsd％在1.3％～10.9％之间，说明本方法的重复性好。

分别向已知含量的6份烟样中加入一定量的氨基酸和amadori化合物标样，然后按照本方法的实验条件进行前处理和上机分析。根据各目标化合物的测定值、添加量计算回收率。结果表明，见表6，各目标化合物的回收率在82.0～109.5％之间，说明测定结果较准确，可以用于烟草中游离氨基酸和amadori化合物的同时定量分析。

表6烟草样品中16种游离氨基酸和6种amadori化合物的加标回收率、批内和批间相对标准偏差

实施例六

采用本发明实施例1的方法，测定了7个烤烟样品中游离氨基酸和amadori化合物的含量，如表7所示。其中烤烟中含量较高的游离氨基酸为pro、asn和gln，含量较高的amadori化合物为fru-pro和fru-ala。

表7烟草样品中16种游离氨基酸和6种amadori化合物的含量

以amadori化合物含量占其与对应的游离氨基酸加和总量的比值来评价烟草样品中氨基酸在美拉德反应中的转化程度，见表8。由结果可以看出，ala、val、phe、trp转化率最高，具有较高的美拉德反应活性，与文献报道一致。而样品yy1的美拉德反应程度明显低于其它6个样品。

表8amadori化合物与占其与氨基酸加和总量的比例