专利名称：一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法
技术领域：
本发明属于一项利用反相高效液相色谱方法检测样品或制品中聚乙二醇残留的新 方法，也同样适用于聚乙二醇修饰的样品或制品的修饰度的检测。该方法可应用于添加 或修饰有聚乙二醇的生物制品、药品、食品、化妆品、保健品等的含量分析与检测。
背景技术：
聚乙二醇是由很多重复的氧乙烷基(-CH2-CH2-0-)结构单元组成的线形或带支链 的中性惰性大分子聚合物，其CAS登记号为25322-68-3。聚乙二醇分子无毒，无免疫 原性和抗原性，其在医药工业中的应用不断扩大，目前已被关国食品与药物管理局批准 用于医药、食品、保健品和化妆品等多个领域。
其中聚乙二醇在医药及生物制品中的应用主要包括以下三个方面 (1)聚乙二醇作为一种常用的药用辅料如应用于眼药水和栓剂中，以辅助有效药 物顺畅进入体内。在一些固体药物制剂如药片中添加适量分子量较大的聚乙二醇可增加 药物的流动性，并提高药物有效成分在胃的溶解度从而提高其生物利用度。(2)聚乙二 醇还可应用于生物制品的生产过程，如作为蛋白质纯化过程中的添加剂，可以有效提高 蛋白质的回收率，保持蛋白质的生物学活性。聚乙二醇还可以作为包涵体复性的保护剂， 从而避免蛋白质复性中间体的聚集，从而提高蛋白质的复性效率。(3)聚乙二醇对制品 的修饰，也称长效化，即将活化的聚乙二醇通过化学手段偶联到蛋白质、多肽、小分子 药物及脂质体上。修饰后的药物与母体药物相比较，在药物代谢动力学、药效学方面得 到显著提升与改善。但对这些制品，尤其是药品中聚乙二醇含量要进行严格的质量控制。 这也就面临建立样品或者制品中聚乙二醇含量分析的有效方法问题。目甜国内比较通用 的聚乙二醇含量检测方法是《中国药典》(2005版，三部，附录VIG)规定的分光光度 法，主要是依据聚乙二醇与钡离子形成复合物进行比色测定。其聚乙二醇含量的检测限 为微克每毫升。但该方法易受很多因素干扰，不适于一些复杂样品的分析。且当被分析 的样品或制品为含有修饰有聚乙二醇的产品时，则此方法不适用。
发明内容
针对上述不足，我们设计了一种利用紫外检测器联合蒸发光检测器，或者二极管阵 列检测器联合蒸发光检测器，利用聚乙二醇与其它成分包括聚乙二醇修饰产物之间极性 的差别，及游离聚乙二醇与非聚乙二醇在上述2种检测器上信号的不同，优化色谱方法 使之在高效液相色谱上实现分离，甄别出游离聚乙二醇的信号峰，通过外标法回归，从 而很好的解决了药典中比色方法测定聚乙二醇含量的方法限制。
本发明的目的在于克服现有技术中对《中国药典》(2005版，三部，附录VIG)规 定的分光光度法有干扰体系或者聚乙二醇修饰产品体系。本发明所要解决的技术问题是 利用色谱方法，充分利用聚乙二醇无紫外吸收及聚乙二醇与制品尤其是聚乙二醇修饰制 品间非极性的微弱差别，优化检测条件，对游离的聚乙二醇和样品或制品中其它成分进 行鉴别和分离，利用外标法，计算游离聚乙二醇的含量。
本发明所述的检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法，其特征在于采用紫外检 测器联合蒸发光检测器，或者二极管阵列检测器联合蒸发光检测器信号对比，甄别出游 离聚乙二醇信号峰，然后利用外标法对其定量。
上述的检测方法，其特征在于使用十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂的反相色谱柱， 分别以含三氟乙酸的乙腈和三氟乙酸的超纯水为流动相，釆用210-380纳米的紫外进行 波长检测并与蒸发光检测信号相对比。
上述的流动相优选采用含体积百分比为0.1 %三氟乙酸的10% 90%乙腈和含体积百 分比为0.1%三氟乙酸的超纯水。
上述的紫外检测器或二极管阵列检测器的特征检测波长优选280纳米。
上述蒸发光检测器检测到样品或制品中的最大信号峰的吸收值位于仪器检测范围 之内。
上述的检测方法，其特征在于比较样品或制品在蒸发光检测器和紫外检测器，或在 蒸发光检测器和二极管阵列检测器的信号的差别，区分聚乙二醇的信号和非聚乙二醇的 信号；利用紫外检测器或二极管阵列检测器检测非聚乙二醇物质的吸收，利用蒸发光检 测器检测聚乙二醇的信号。
上述外标法的外标物为聚乙二醇，所用外标聚乙二醇的分子量及多分散度与样品或 制品中所使用的聚乙二醇相同或相似。
上述的检测方法在检测样品或制品中聚乙二醇含量，或聚乙二醇残留量或聚乙二醇 修饰度方面的应用，所述样品或制品选自生物制品、药品、食品、化妆品或保健品。以下提供本发明的主要分析步骤 1样品预处理
样品为水溶液，过0.22^m滤膜；同时估测其中聚乙二醇含量，若高于10mg/ml， 则应用超纯水提前稀释至低于5 mg/ml;若为固体，则应用超纯水或者20%的乙腈溶液 溶解且经0.22 ^mi滤膜过滤。 2色谱条件
(1) 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱；当所用聚乙二醇
的分子量为5000道尔顿以下时可用C8柱，当所用聚乙二醇的分子量为5000道尔顿以 上时用C4柱；
(2) 检测器紫外检测器与蒸发光检测器联用，或二极管阵列检测器与蒸发光检 测器联用；
(3) 检测波长在210-380纳米间扫描优选样品或制品有效成分的吸收波长；
(4) 流动相以含0.1% (体积百分比)三氟乙酸的乙腈和含0.1% (体积百分比) 三氟乙酸的超纯水为流动相；
(5) 柱温10~60°C。 3浓度计算方法
用与样品或制品中使用的聚乙二醇分子量与多分散度一致或尽可能相近的聚乙二
醇标准品配制成一定梯度浓度的标准液，20 W体积上样，按外标法，以蒸发光信号的
峰面积-聚乙二醇进样浓度做线性回归，得出线性方程，利用该方程和样品中聚乙二醇 信号峰面积计算游离聚乙二醇含量。
由于某些样品或制品中成分比较复杂，所做的样品反相高效液相色谱图的紫外信号 峰和蒸发光检测器信号峰应分别与聚乙二醇标准品的反相高效液相色谱图及不含游离 聚乙二醇的样品反相高效液相色谱图做比对，从而鉴别游离聚乙二醇的蒸发光信号峰
(聚乙二醇在21(T380纳米间无紫外吸收或紫外吸收很低)。
本发明的分析方法灵敏度高，重复性、选择性好，快捷、高效、简便，适用于成分 较复杂的、对药典提供的聚乙二醇-钡离复合物比色法测定受干扰的样品，尤其是对于 聚乙二醇修饰的样品或制品非常适用。有效的扩大了聚乙二醇检测的应用范围。
本发明的有益效果
该方法主要的优点(l)通过优化色谱洗脱条件，借助紫外检测器和蒸发光检测器， 或者二极管阵列检测器和蒸发光检测器，对游离的聚乙二醇进行专属性检测；最大程度的避免了其它杂质的干扰；(2)该方法能适用于聚乙二醇修饰样品或聚乙二醇修饰制品 中游离聚乙二醇含量的检测，这一点是药典中所述的分光广度法所不能实现的；(3)该 方法还能从光谱学角度去证明样品或制品中聚乙二醇残留去除的是否彻底；为聚乙二醇 在样品或制品、及在制品的制备工艺中添加的质量控制起到极好的作用；(4)该发明另 一个扩展性益处在于可以通过该方法对多聚乙二醇修饰的大分子量生物制品的聚乙二 醇修饰度进行测定。当分子量较大，在本发明中指分子量大于50000道尔顿的制品，且 经多聚乙二醇修饰时，在本发明中指每个分子修饰高于3条聚乙二醇链时，整个制品的 修饰度较难准确测定。该发明可以通过计算加入的活化的聚乙二醇摩尔量，减去检测的 游离聚乙二醇摩尔量，两者之差除以大分子母体的摩尔量，从而得出样品或制品的聚乙 二醇的修饰度，即每个大分子修饰多少条聚乙二醇链。
图1高摩尔倍数聚乙二醇修饰精氨酸酶的反应混合物的谱图
图2纯化的聚乙二醇修饰的精氮酸酶产品的谱图
图3聚乙二醇标准品的浓度-信号峰面积线性回归图
图4低摩尔倍数聚乙二醇修饰精氨酸酶的反应混合物的谱图
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明 实施例1
检测样品为40倍摩尔量的琥珀酰亚胺丙酸活化的单甲氧基聚乙二醇修饰的重组人
精氨酸酶(EC3.5.3.1)，反应在室温下进行，然后用0.2摩尔/升的柠檬酸调节反应混合 物的pH为4.0。样品混合物的主要组分为未修饰的重组人精氨酸酶、修饰的重组人精 氨酸酶及水解后的单甲氧基聚乙二醇丙酸。用超纯水稀释反应混合物至单甲氧基聚乙二 醇衍生物的浓度约10-15毫克/毫升。
仪器为安捷伦1200色谱系统Vydac 214TP54 (250x4.6 mm, 5刚，300A)色谱柱， DAD二极管阵列检测器配合SEDEX75蒸发光检测器，自动进样器，四元泵，柱温箱， 及工作站。
流动相为色谱级的乙腈、三氟乙酸及超纯水。
单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸及单甲氧基聚乙二醇(分子量均为20000道尔顿)购自NEKTAR公司。 色谱条件
运行缓冲液含体积百分比为0.1%三氟乙酸的超纯水，在本发明中成为缓冲液A;
含体积百分比为0.1%三氟乙酸的乙腈，在本发明中成为缓冲液B;
流速0.5 ml/min
二极管阵列的检测波长280纳米 上样体积20 Pl
梯度设置0-5 min, 40%缓冲液B; 5-50 min, 40%-55%缓冲液B; 50-55 min, 55%-100%缓冲液B。 柱温40 °C
记录色谱图，见附图1,定性检测说明在该体系中有很多聚乙二醇并未实现有效修饰 到精氨酸酶上，即聚乙二醇修饰剂的量远高于其所需要的量。
实施例2
检测样品为用本技术领域内熟知的经凝胶排阻色谱纯化的聚乙二醇修饰的重组人 精氨酸酶样品。仪器为安捷伦1200色谱系统Vydac 214TP54 (250x4.6 mm， 5 wn， 300A) 色谱柱，DAD二极管阵列检测器配合SEDEX75蒸发光检测器，3动进样器，四元泵， 柱温箱，及工作站。
流动相为色谱级的乙腈、三氟乙酸及超纯水。
单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸及单甲氧基聚乙二醇(分子量均为20000道尔 顿)购自NEKTAR公司。
色谱条件-
运行缓冲液含体积百分比为0.1%三氟乙酸的超纯水，在本发明中成为缓冲液A;
含体积百分比为0.1%三氟乙酸的乙腈，在本发明中成为缓冲液B;
流速0.5 ml/min
二极管阵列的检测波长280纳米 上样体积20 14
梯度设置0-5 min, 40%缓冲液B; 5-50 min, 40%-55%缓冲液B; 50-55min, 55%-100%
7缓冲液B。
柱温40 °C
记录色谱图，见附图2。从图2中蒸发光检测器未能检测出游离聚乙二醇的信号峰， 因此该制品为不含游离聚乙二醇的精氨酸酶聚乙二醇修饰产物。该目标产物，及聚乙二 醇修饰的精氨酸酶的纯化方法有效，制品纯净。但如果利用要点法规定的比色法，由于 目标蛋白精氨酸酶上修饰有聚乙二醇，因此也能与钡离子反应，从而不能判断是否纯化 的样品中含有游离的聚乙二醇。
实施例3
利用该发明检测反应混合物中游离聚乙二醇的含量。
标准样品为购自NEKTAR公司的单甲氧基聚乙二醇，分子量为20000道尔顿。待分 析样品如实施例1中所制备的反应混合物，只是聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸/蛋白质的摩尔 比为10: 1，聚乙二醇浓度为12mg/ml。所有样品均经0.45 nm滤膜过滤，计算待分析 样品中游离聚乙二醇浓度(加入的聚乙二醇摩尔量除以反应液体积)，用超纯水稀释聚 乙二醇的浓度低于5毫克/毫升。同样，配5236系列稀释浓度的单甲氧基聚乙二醇标准 溶液，依下述色谱条件进行分析，并记录色谱图，利用安捷伦化学工作站对目标谱图积 分计算。
色谱条件-
运行缓冲液含体积百分比为0.1%三氟乙酸的超纯水，在本发明中成为缓冲液A;
含体积百分比为0.1%三氟乙酸的乙腈，在本发明中成为缓冲液B; 流速0,5 ml/min
二极管阵列的检测波长280纳米 上样体积20 W
梯度设置0-5 min， 40%缓冲液B; 5-50 min, 40%-55%缓冲液B; 50-55 min, 55%-100%缓冲液B。 柱温40 。C
不同浓度单甲氧基聚乙二醇(分子量20000道尔顿)对相应蒸发光信号面积的归一 化图见图3，反应混合物的图谱见图4。聚乙二醇标准的线性回归方程为Y=62830*x-76766， R=0.998
Y为聚乙二醇在蒸发光检测器信号峰面积，X为聚乙二醇浓度，单位为毫克/毫升， R为相关系数。
将图4中标识的水解单甲氧基聚乙二醇丙酸的峰面积利用安捷伦化学工作站积分， 然后对比标准曲线计算游离甲氧基聚乙二醇丙酸的浓度。 计算公式如下
C游离-[ (Y+76766) *Z]/62830
C ,,:样品或制品中有力的聚乙二醇浓度；Y:游离聚乙二醇在蒸发光检测器上的信 号峰面积；Z:稀释因子
在本例，聚乙二醇的起始浓度为12mg/ml (6*l(T7mol/l)，计算出反应混合物中游离 的聚乙二醇浓度为3mg/ml (1.5*l(T7mol/l)，可知体系中有4.5*1(T7 mol/1的活化的聚乙 二醇修饰到4."l(y8niol/l的精氨酸酶上，由聚乙二醇摩尔量与精氨酸酶摩尔量比，即可 得出蛋白的修饰度为ll，即每个精氨酸酶分子修饰11条聚乙二醇链。由于精氨酸酶的 分子量约为105000道尔顿，再修饰有11条分子量为20000道尔顿的聚乙二醇分子，是 一个非常庞大的分子。因此很难通过电泳技术、飞行时间质谱技术检测，因此该发明有 效的解决了大分子修饰度的问题。
其具体数据见表l。
起始聚 乙二醇 浓度游离聚乙二 醇的信号峰 面积样品的 稀释倍 数z游离的聚 乙二醇浓 度修饰上的聚 乙二醇摩尔 浓度精氨酸酶 的摩尔浓 度精氨酸酶 的修饰度
12 (mg/ml)1752023 (mg/ml)4.5-7 mol/14." mol/111
表1
9
权利要求
1、一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法，其特征在于采用紫外检测器联合蒸发光检测器，或者二极管阵列检测器联合蒸发光检测器，对比两者信号差异，甄别出游离聚乙二醇信号峰，然后利用外标法对其定量。
2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 的反相色谱柱，分别以含三氟乙酸的乙腈和三氟乙酸的超纯水为流动相，采用 210-380纳米的紫外进行波长检测并与蒸发光检测信号相对比。
3、 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于流动相采用含体积百分比为O.P/。三氟 乙酸的10% 90%乙腈和含体积百分比为0.1%三氟乙酸的超纯水。
4、 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的紫外检测器或二极管阵列检测 器的特征检测波长为280纳米。
5、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于蒸发光检测器检测到样品或制品中的 最大信号峰的吸收值位于仪器检测范围之内。
6、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于比较样品或制品在蒸发光检测器和紫 外检测器，或在蒸发光检测器和二极管阵列检测器的信号的差别，区分聚乙二醇的 信号和非聚乙二醇的信号；利用紫外检测器或二极管阵列检测器检测非聚乙二醇物 质的吸收，利用蒸发光检测器检测聚乙二醇的信号。
7、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述外标法的外标物为聚乙二醇，所 用外标聚乙二醇的分子量及多分散度与样品或制品中所使用的聚乙二醇相同或相 似。
8、 权利要求1~7中任一项所述的检测方法在检测样品中聚乙二醇含量，或聚乙二醇残 留量或聚乙二醇修饰度方面的应用。
9、 权利要求8所述的用途，其特征在于所述样品为生物制品、药品、食品、化妆品或 保健品。
全文摘要
本发明公开了一种反相高效液相色谱测定样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法，其特征在于利用聚乙二醇与其它物质在反相色谱柱上非极性的差别，采用紫外检测器联合蒸发光检测器，或者二极管阵列检测器联合蒸发光检测器信号对比，甄别出游离聚乙二醇信号峰，然后利用外标法对其定量。基于此方法，本发明的应用还可扩展到检测聚乙二醇修饰产物的纯度及修饰产物的修饰程度。本发明的分析方法灵敏度高，重复性、选择性好，快捷、高效、简便，适用于成分较复杂的、对药典提供的聚乙二醇-钡离复合物比色法测定受干扰的样品，尤其是对于聚乙二醇修饰的样品或制品非常适用。
文档编号G01N30/74GK101493446SQ20091002500
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月16日 优先权日2009年2月16日
发明者于鹏展, 秦国宏, 丹 覃 申请人:江苏先声药物研究有限公司