本申请要求于2014年6月19日提交的美国临时专利申请第62/014,503号的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。政府利益本发明是在由国立卫生研究院授予的EB003730，EB012135和CA151648下的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域：
：本公开的主题涉及基于RNA的组合物，包括含有免疫刺激性RNA的组合物和含有RNA纳米颗粒的组合物，制备所述组合物的方法，以及基于RNA的佐剂用于预防性和治疗性疗法的用途。
背景技术：
：：癌症和感染性疾病如流感和人类免疫缺陷病毒感染/获得性免疫缺陷综合症(HIV/AIDS)仍然是对全世界公共卫生的巨大威胁。预防和治疗疫苗可以提供控制这些疾病的有希望的机会。然而，尽管进行了数十年的广泛研究，但是这些疫苗仍然远不能完全控制这些疾病，因为低效率或安全问题。迫切需要设计和开发针对这些疾病的新疫苗和佐剂的新策略和方法。仿生纳米技术的领域涉及利用功能性核酸的模块单元构建纳米级的超分子结构。目的是设计以可控和可回收的方式进行自组装的纳米结构。核糖核酸(RNA)被发现为一种有吸引力的材料，通过纳米技术构建纳米粒子(1)，提供可以操作为一维，二维和三维架构的各种结构模块和基序(评论见(2))。在过去的十年中，通过手拉手(1，3-5)、脚对脚(6-9)、分支延伸(10-14)、环-受体接触(15-17)、“粘性”或“悬空”末端(6，18，19)和合成的RNA-蛋白复合物相互作用(20)的方式获得了多种几何RNA纳米颗粒和纳米支架。这些基序可用于数据库，并且可以通过操作它们的可互换单元用于构建人造纳米结构(21)。最近，RNA旋转循环转录(rollingcycletranscription)已被用于生成RNA海绵(22，23)。在RNA构造方法中，可以从结构数据库中出现的大且复杂的RNA分子中分离出如双螺旋、环和连接的结构基序，并通过操作它们的可互换单元来构建人造纳米结构(24，25)。因此，以前报道的RNA纳米颗粒的设计，例如构造四边形(tecto-square)(26)，四边形纳米支架(27，28)，RNA纳米环(1，5，7，9)或pRNA二聚体，四聚体和六聚体(1，7，9，29，30)以及RNA纳米立方体(19)，RNA多面体(14)，RNA束(6，31)和细丝(15，16)利用RNA结构和折叠的基本原理(32-36)。常规构建体的总体稳定性虽然主要依赖于由环-环，受体-环或“粘性末端”形成的规范和非规范碱基对(bp)的稳定性，其中配对核苷酸的数目通常不超过6个。需要新的方法来增加RNA纳米颗粒的整体稳定性，其使用天然选择的稳定的RNA构件用于结构构建，并且实例是来自包装马达核酸的噬菌体phi29DNA的pRNA的3WJ基序。目的是设计以可控和可回收的方式进行自组装的纳米结构。需要新的方法来增加RNA纳米颗粒的整体稳定性，其使用天然选择的稳定的RNA构件用于结构构建。一个实例是来自包装马达的噬菌体phi29DNA的pRNA的3WJ基序。除了发现pRNA-3WJ在生理条件下和在强变性剂存在下显示出优异的稳定性(10，11)，最近的研究还表明3WJ的热力学稳定性是熵驱动的(37)。稳定的RNA多边形具有作为免疫调节剂的新一代递送系统的潜力。本公开的主题涉及用于预防性和治疗性疗法的组合物和佐剂，包括含有免疫刺激性RNA的组合物和含有RNA纳米颗粒的组合物。本文公开的组合物安全，有效，多功能且易于制造，提供新的解决方案以解决与当前疫苗设计和开发方法相关的未满足的需求。技术实现要素：如在研究本文献中提供的信息之后对本领域普通技术人员将变得显而易见的，本公开的主题符合一些或所有上文指出的需要。本
发明内容描述了本公开的主题的若干实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和替换。本
发明内容仅仅是众多的和各种各样的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征；同样，那些特征可以应用于本公开主题的其它实施方式，无论是否在本
发明内容中列出。为了避免过度重复，本
发明内容没有列出或表明这些特征的所有可能的组合。本公开的主题包括可用作用于开发新型纳米疫苗的构建材料和/或免疫刺激剂的RNA和用于疾病预防和治疗的佐剂。本公开的主题包括包含可以是单链或双链的RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序的组合物。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸包括化学修饰。在一些优选的实施方式中，化学修饰选自2’氟，2’胺和2’O-甲基。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸的长度为约8-50个碱基。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸物部分双链，例如含有发夹。在一些实施方式中，免疫刺激基序是免疫刺激性RNA或CpG寡脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，免疫刺激基序与RNA-寡核苷酸结合。在一些实施方式中，免疫刺激基序是寡脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，组合物作为佐剂提供。本公开的主题包括包含多个外链和一个内链的人造RNA纳米结构，其中外链和内链自组装以形成纳米结构。在一些实施方式中，多个外链可以是例如3、4或5条链。在一些实施方式中，外链包含约48个核苷酸；并且在一些优选的实施方式中，纳米结构在每个顶点包含pRNA3WJ基序。在一些实施方式中，人造RNA纳米结构是三角形并且在H1和H2之间具有伸展的螺旋内角。在其他实施方式中，纳米结构是四边形并且在H1和H2之间具有伸展的螺旋内角。在其他实施例中，纳米结构是五角形并且在H1和H2之间具有伸展的螺旋内角。在一些实施方式中，RNA纳米结构选自RNA三角形，RNA四边形，RNA五角形，RNA六角形，RNA三向连接和RNA四向连接。在一些实施方式中，RNA纳米结构来自3WJ基序。在一些实施方式中，RNA纳米结构在H1和H2之间包含伸展的螺旋内角，如图1所示。在一些实施方式中，主题涉及包含RNA纳米结构的组合物，其包含佐剂，抗原和/或靶向配体。在一些实施方式中，组合物诱导免疫应答。在一些实施方式中，与独立于RNA纳米结构提供的佐剂，抗原和/或靶向配体相比，免疫应答增加细胞因子至少十倍。在一些实施方式中，佐剂是包含RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序的组合物。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序通过RNA-寡核苷酸与RNA纳米颗粒的RNA链共价结合并入RNA纳米颗粒中。在一些实施方式中，通过RNA-寡核苷酸和RNA纳米颗粒之间的碱基配对将RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序并入RNA纳米颗粒中。在一些实施方式中，佐剂是选择的免疫刺激性RNA(isRNA)，并且在一些实施方式中，佐剂是CpG寡脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，佐剂是长度为约8至约50个碱基的RNA。在一些实施方式中，佐剂是CpGRNA。在一些实施方式中，佐剂与RNA纳米颗粒的RNA链共价结合。在其它实施方式中，通过碱基配对将佐剂并入RNA纳米颗粒中。在一些实施方式中，RNA纳米结构包含抗原。在一些实施方式中，抗原源自细菌，病毒或细胞。在一些实施方式中，抗原结合至中和抗体或抑制性抗体。在一些实施方式中，抗原是中和表位。在一些实施方式中，抗原选自：B细胞表位，T细胞表位，T辅助表位，源自PG120的表位，gp41表位，聚糖，肽，T辅助肽和链霉亲和素。在一些实施方式中，RNA纳米结构包含靶向配体。在一些实施方式中，靶向配体选自：适体，细胞表面标记，叶酸，siRNA和shRNA。在一些实施方式中，适体结合HIV表位。在其他实施方式中，细胞表面标记是巨噬细胞或淋巴细胞。在一些实施方式中，靶向配体靶向B细胞，T细胞，树突细胞，巨噬细胞和/或癌细胞。在一些实施方式中，存在多于一种靶向配体。在一些实施方式中，靶向配体相同。在其他实施方式中，靶向配体不完全相同。本公开的主题还涉及在受试者中诱导免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的组合物。在一些实施方式中，所述方法包括施用RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序。在一些实施方式中，所述方法包括施用包含RNA纳米结构和佐剂，抗原和/或靶向配体的组合物。在一些实施方式中，本公开的主题涉及诱导细胞因子产生的方法。在一些实施方式中，细胞因子包括TNF-α，IL-6和/或IL-12。在一些实施方式中，所述方法包括施用RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序。在一些实施方式中，与独立于RNA-寡核苷酸提供的免疫刺激基序相比，细胞因子的产生增加至少十倍。在一些实施方式中，所述方法包括施用包含RNA纳米结构和佐剂，抗原和/或靶向配体的组合物。在一些实施方式中，与独立于RNA纳米结构提供的佐剂，抗原和/或靶向配体相比，诱导细胞因子产生增加至少十倍。在一些实施方式中，将本公开主题的组合物施用于受试者诱导高亲和力中和抗体或抑制性抗体的产生。在一些实施方式中，受试者患有或处于患病理状况的风险中。在一些实施方式中，病理状况是癌症，人类免疫缺陷病毒(HIV)，流感或药物和物质滥用。在一些实施方式中，本公开主题的组合物用于制造可用于治疗受试者的病理状况的药物。在一些实施方式中，预防性地使用该药物。本公开的主题还提供了制备RNA纳米结构的方法。在一些实施方式中。制备RNA纳米结构的方法包括混合等摩尔浓度的多个外RNA链和一个内RNA链以制成混合物，使混合物退火并缓慢冷却混合物。在一些实施方式中，将混合物以约1℃/分钟冷却。在一些实施方式中，将混合物从约80℃冷却至约4℃。在一些实施方式中，将混合物退火约1小时。在一些实施方式中，所述方法包括修饰一个或多个外链以包含抗原，佐剂和/或靶向配体。在一些实施方式中，任选存在3、4、或5个外链。在一些实施方式中，外链包含约48个核苷酸。在一些实施方式中，通过所述方法产生的纳米结构在每个顶点包含pRNA3WJ基序。在一些方法中，纳米结构具有选自三角形，四边形和五角形的形状。在一些实施方式中，由该方法产生的形状在H1和H2之间具有伸展的螺旋内角。附图说明本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了使用本发明的原理的说明性实施方式以及附图，其中：图1A和1B包括pRNA3WJ基序的结构特征的细节。(A)具有使用Leontis-Westhof命名法注释的碱基对的3WJ基序的二级结构。(B)3WJ基序的三级结构，其中指示H1和H2之间形成的∠AOB60°角。∠AOB角度对应于多边形的内角。图2A-2C包括RNA纳米结构多边形的设计和组装特性。(A)具有位于顶点的3WJ基序的多边形的3D建模结构，内角对应于∠AOB60°。(B)内链的增加的长度伸展纳米颗粒组装处的3WJ∠AOB，以及增加的外部“短”链的数量。图2(C)在7％天然PAGE上评价多边形的组装性质。星号“*”表示在每种类型的多边形组件上使用的Cy5标记的链。图3包括多边形的结构表征。(A)源自pRNA3WJ基序的三角形，四边形和五角形纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)图像。(B)通过动态光散射获得的多边形尺寸分布直方图。图4A和4B包括多边形稳定性的比较。(A)在不存在和存在8M尿素的情况下通过7％垂直TGGE和(B)沸腾抗性试验测量的三角形，四边形和五角形的熔融温度。计算的沸腾后多边形的恢复百分比显示在每个凝胶下方，其中误差线由几个独立实验计算。图5A-5D示出了通过RNA-CpG多角形的巨噬细胞样RAW264.7细胞和小鼠中细胞因子诱导的效果。通过50nMRNA多边形-CpG诱导(A)TNF-α和(B)IL-6细胞因子。(C)TNF-α诱导与每个RNA多边形的CpG数目的依赖性。误差线表示来自至少三个独立实验的标准偏差。(D)动物模型中的三角形-CpG纳米颗粒的免疫刺激活性。误差线表示来自受试小鼠的血清等分试样的细胞因子水平的两次独立测量的标准偏差。图6A和6B包括与细胞结合的RNA多边形-CpG复合物的比较。(A)该图表示流式细胞术数据的总结，显示了以剂量依赖性方式结合细胞的每种RNA纳米颗粒-CpG佐剂。(B)通过核(蓝色)，肌动蛋白或细胞质(绿色)和Cy-3标记的CpG(红色)信号的共定位的显示三角形-CpG和CpG与RAW624.7细胞的结合比较的共焦图像。图7A-7D包括平衡状态下的RNA多边形解离常数测定。这些是用于形成三角形(a)，四边形(b)和五角形(c)多边形的7％天然PAGE滴定数据。下面，凝胶是用于确定每个多边形的平衡浓度的图，然后用于计算表观解离常数。图8A-8C包括RNA多边形的序列和二级结构。RNA多边形和三角形(a)，四边形(b)和五角形(c)的定量的装配产量。图9A-9C包括在RNA多边形的云母表面AFM图像上的RNA多边形群体和在0.5mm2的AFM云母表面中的RNA三角形(a)，四边形(b)和五角形(c)多边形的群体分布。误差代表来自几个独立图像的计数。图10A和10B包括三角CpG纳米颗粒的二级结构和表征。(a)内含3个CpG佐剂的RNA三角形的2D结构。注意：箭头表示RNA三角形纳米颗粒中已删除的碱基对，用于动物共焦显微和细胞毒性研究。(b)这是4％琼脂糖凝胶，显示具有CpG佐剂的RNA三角形纳米支架的组件。(c)三角形-3CpG复合物的DLS表征，显示约14nm的表观流体动力学直径。误差代表来自若干独立测量的标准偏差。图11包括四边形CpG纳米颗粒的二级结构和表征。(a)方形的4CpG佐剂的RNA的2D结构。(b)这是4％琼脂糖凝胶，显示RNA方形支架与CpG佐剂的装配。(c)四边形-4CpG复合物的DLS表征，显示约15nm的表观流体动力学直径。误差代表来自若干独立测量的标准偏差。图12包括五角形-CpG纳米颗粒的二级结构和表征。(a)内含5个CpG佐剂的RNA五角形的2D结构。(b)这是4％琼脂糖凝胶，显示具有CpG佐剂的RNA五角形纳米支架的装配。(c)显示约16nm的表观流体动力学直径的五角形-5CpG复合物的DLS表征。误差代表来自若干独立测量的标准偏差。图13示出RNA-CpG佐剂对RAW264.7细胞存活率的影响。将细胞与仅不同浓度的RNA多边形，RNA多边形-CpG复合物和游离CpG一起温育。图14说明了内含CpG佐剂的RNA多边形对RAW264.7细胞的结合效应。(a)三角形-3CpGs，(b)四边形-4CpGs和(c)五边形-5CpGs纳米颗粒的浓度依赖性结合。图15包括与CpGs基序结合的RNA多边形的血清稳定性测定的结果。将内含DNACpG的RNA三角形，四边形和五边形(2'-F修饰的)的预装配复合物(1μM)在含有10％胎牛血清(Sigma)的RPMI-1640培养基中温育。在37℃温育后，在0小时，1小时，3小时，6小时，8小时和16小时的时间点取等份(10μL)，随后使用6％天然PAGE凝胶分析。图16示出用于将免疫刺激性CpG寡核苷酸，RNA或抗原有效递送至免疫细胞的热力学稳定的RNA纳米颗粒，图17描绘了三角形-3CpG的RNA和DNA序列图18显示了仅CpG，仅纳米结构RNA三角形，以及具有任选的一个，两个和三个CpG的RNA纳米结构三角形。图19热力学稳定的RNA三向连接(3WJ)，用于将免疫刺激性CpG寡核苷酸，RNA或抗原有效递送至免疫细胞。图20描绘用于递送4CpG的领结状RNA纳米颗粒三角形二聚体。纳米颗粒的尺寸是三角形的两倍(约20nm×15nm)。图21显示了内含不同数目的CpG和Cy3标记的DNA的RNA三角形，四边形和五边形纳米颗粒图22描绘了用于抗癌疫苗或免疫治疗的RNA纳米颗粒图23描绘了含有CpG-ODN佐剂和抗肿瘤抗原的3WJ纳米疫苗和含有CpG-ODN佐剂和抗肿瘤抗原的4WJ纳米疫苗图24描绘了内含CpG-GODN和siRNA的三角RNA纳米结构。图25描绘了内含CpG寡核苷酸的RNA纳米结构三角形的组件。图26显示内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的AFM图像。图27显示内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的AFM图像。图28显示内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的AFM图像。图29显示内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的AFM图像。图30显示内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的AFM图像。图31显示了内含三个CpG的RNA纳米结构三角形的详细AFM图像和内含RNA三角形的CpG的方案。具有2个CpGODN的三角形可以成功地纯化和通过AFM成像。图像显示三角形-CpG组装良好，并且大多数颗粒显示为三角形。基于AFM图像，具有3个CpG的三角形的直径为约30nm，比原始的三角形大一点。图32提供了显示16.7nM的三角形-3CpGs的平均直径的动态光散射(DLS)数据，并且其与AFM成像数据一致。图33显示RNA纳米结构三角形如何保护CpG寡核苷酸免于在血清中随时间的降解。图34是在30℃至80℃的增加的温度下，内含CpG寡核苷酸的RNA纳米结构三角形的温度梯度凝胶电泳(TGGE)。图35包括来自RNA三角形-CPG的毒性研究的相对细胞存活率对浓度的图表。图36是内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的300nM三角形RNA的流式细胞术研究。阳性结合：三角形-1CpG300nM-三角形2CpGs300nM＝三角形-3Cpgs300nM>CpG300nM。图37是内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的1500nM三角形RNA的流式细胞术研究。阳性结合：三角形-1CpG150nM＝三角形2CpG15-nM＝三角形-3CpGs150nM>CpG150nM。图38是内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的75nM三角形RNA的流式细胞术研究。阳性结合：三角形-1CpG75nM＝三角形-2CpGs75nM＝三角形-3CpGs75nM>CpG75nM。图39是内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的37.5nM三角形RNA的流式细胞术研究。阳性结合：三角形-1CpG37.5nM＝三角形2CpG37.5nM＝三角形-3CpG37.5nM>CpG37.5nM。图40是研究不同浓度的与raw264.7细胞结合的三角-1CpG的流式细胞术。阳性结合：三角-1CpG300nM>三角-1CpG150nM>三角-1CpG75nM>三角-1CpG37.5nM。图41是研究不同浓度的结合raw264.7细胞的三角形-2CpG的流式细胞术。阳性结合：三角形-2CpG300nM>三角形-2CpG150nM>三角形-2CpG75nM>三角形-2CpG37.5nM。图42是研究不同浓度的结合raw264.7细胞的三角形-3CpG的流式细胞术。阳性结合：三角形-3CpG300nM>三角形-3CpG150nM>三角形-3CpG75nM>三角形-3CpG37.5nM。图43是研究不同浓度的与raw264.7细胞结合的CpG的流式细胞术。阳性结合：CpG300nM>CpG150nM>CpG75nM>CpG37.5nM。图44包括显示不同浓度的CpG，三角-1CpG，三角-2CpG和三角-3CpG及它们各自的结合水平的表。三角-1CpG，三角-2CpGs和三角-3CpGs都具有比仅CpG强得多的结合。三角形应该增强CpG的递送，这也与先前的细胞因子数据一致(更强的结合与更强的细胞因子诱导相关)。图45是比较内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的四边形RNA的流式细胞术。阳性结合：四边形-1CpG＝四边形-2CpGs-1＝四边形-2CpGs-2＝四边形-3CpGs＝四边形-4CpGs>仅CpG图46是比较内含不同数目的结合raw264.7细胞的CpG的五边形RNA的流式细胞术。阳性结合：五边形-5CpG＝五边形-4CpG＝五边形-3CpGs-1＝五边形-3CpGs-2＝五边形-2CpGs-1＝五边形-2CpGs-2>五边形-1CpG>仅CpG。图47是比较结合raw264.7细胞的三角形-3CpG，四边形-4CpG和五边形-5CpGRNA纳米结构的流式细胞术。阳性结合：五边形-5CpG＝四边形-4CpG＝三角形-3CpG>仅CpG。图48包括与raw细胞相互作用的三角形-CpG的共聚焦成像。图49包括与raw细胞相互作用的三角形-CpG的共聚焦成像。图50提供了三角形-CpG诱导的raw细胞的形态学变化的荧光成像。在用三角形-CpG或CpG处理时，细胞形态从圆形改变为具有更多伸展的伸长的形状并形成假足。图51包括对1)三角形-CpG与三角形RNA，CpG，仅细胞和空白培养基比较和2)增加的三角-CPG的浓度的TNF-α细胞因子ELISA试验的结果。图52描绘了对1)三角形-CpG与三角形RNA，CpG，仅细胞和空白培养基比较和2)增加的三角-CPG的浓度的IL-6细胞因子ELISA试验。图53提供了比较内含不同数目的CpG的RNA三角形的TNF-α细胞因子ELISA试验的图表。图54提供了比较内含不同数目CpG的RNA四边形的TNF-α细胞因子ELISA试验的图表。图55提供了比较内含不同数目的CpG的RNA五边形的TNF-α细胞因子ELISA试验的图表。图56提供了显示内含CpGRNA的RNA三角形纳米结构和具有21个核苷酸的突出端和5U接头的CpGRNA序列的自组装的示意图。图57提供了A21CpGRNA，63个核苷酸的DNA，5’引物和3’引物的序列。图58提供了B21CpGRNA，63个核苷酸的DNA，5’引物和3’引物的序列。图59提供了C21CpGRNA，63个核苷酸的DNA，5’引物和3’引物的序列。图60是A21，B21和C21CpGRNA的DNA模板的PCR。图61是通过体外转录制备的2'FCpGRNA的图像。图62提供了内含DNACpG的2'FRNA三角形，内含DNACpG的DNA三角形和内含2'FRNACpG的2'FRNA三角形的细胞因子测试数据的汇总。图63提供了具有RNACpG基序的RNA纳米结构三角形的设计。序列表的描述SEQIDNO1是用于RNA三角形纳米结构的装配的三角形短链A的示例性RNA序列。SEQIDNO2是用于RNA三角形纳米结构的装配的三角形短链B的示例性RNA序列。SEQIDNO3是用于RNA三角形纳米结构的装配的三角形短链C的示例性RNA序列。SEQIDNO4是用于RNA三角形纳米结构的装配的三角形长链D的示例性RNA序列。SEQIDNO5是用于装配RNA四边形纳米结构的四边形短链A的示例性RNA序列。SEQIDNO6是用于装配RNA四边形纳米结构的四边形短链B的示例性RNA序列。SEQIDNO7是用于装配RNA四边形纳米结构的四边形短链C的示例性RNA序列。SEQIDNO8是用于装配RNA四边形纳米结构的四边形短链D的示例性RNA序列。SEQIDNO9是用于装配RNA四边形纳米结构的四边形长链E的示例性RNA序列。SEQIDNO10是用于装配RNA五边形纳米结构的五边形短链A的示例性RNA序列。SEQIDNO11是用于组装RNA五边形纳米结构的五边形短链B的示例性RNA序列。SEQIDNO12是用于装配RNA五边形纳米结构的五边形短链C的示例性RNA序列。SEQIDNO13是用于装配RNA五边形纳米结构的五边形短链D的示例性RNA序列。SEQIDNO14是用于装配RNA五边形纳米结构的五边形短链E的示例性RNA序列。SEQIDNO15是用于装配RNA五边形纳米结构的五边形长链F的示例性RNA序列。SEQIDNO16是示例性的链A21CpGRNA。SEQIDNO17是示例性的链A21CpGDNA。SEQIDNO18是示例性的链B21CpGRNA。SEQIDNO19是示例性的链B21CpGDNA。SEQIDNO20是示例性的链C21CpGRNA。SEQIDNO21是示例性的链C21CpGDNA。SEQIDNO22是用于装配内含RNACpG基序的三角形RNA的示例性RNA序列TriA-Cpg。SEQIDNO23是用于装配内含RNACpG基序的RNA三角形的示例性RNA序列TriB-CpG。SEQIDNO24是用于装配内含RNACpG基序的RNA三角形的示例性RNA序列TriC-CpG。SEQIDNO：25是包括SEQIDNO：17的序列的63个核苷酸的DNA序列，并且SEQIDNO：26和SEQIDNO：27是5’-和3’-引物，如图57所示。SEQIDNO：28是包括SEQIDNO：19的序列的63个核苷酸的DNA序列，并且SEQIDNO：29和SEQIDNO：30是5’-和3’-引物，如图58所示。SEQIDNO：31是包括SEQIDNO：21的序列的63个核苷酸的DNA序列，并且SEQIDNO：32和SEQIDNO：33是5’-和3’-引物，如图59所示。具体实施方式在本文献中阐述了本公开的主题的一个或多个实施方式的细节。在研究了本文献中提供的信息之后，对本文献中描述的实施方式以及其他实施方式的修改对于本领域普通技术人员将显而易见。本文献中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方式的具体细节，主要是为了清楚理解而提供，并且不应从中理解不必要的限制。在冲突的情况下，本文献的说明书，包括定义，将控制。在某些情况下，本文公开的核苷酸和多肽包括在公众可获得的数据库中，如GENBANK和SWISSPROT。包括序列以及与包括在这些公众可获得的数据库中的这些核苷酸和多肽相关的其他信息的信息明确地通过引证并入。除非另有说明或显而易见，对这种公众可获得的数据库的引用是指本申请的提交日期的数据库的最新版本。虽然本文使用的术语被认为是本领域的普通技术人员充分理解的，但是阐述定义以便于解释本公开的主题。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本文公开的主题的实践或测试中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法，装置和材料，但是现在描述代表性的方法，装置和材料。根据长期的专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一个”，“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此，例如，对提及“一个细胞”包括多个这样的单元，等等。除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量，性质例如反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指示相反，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据寻求由本公开主题获得的期望的性质而变化。如本文所使用的，术语“约”当涉及质量，重量，时间，体积，浓度或百分比的值或量时，意味着包括在一些实施方式中±20％、在一些实施方式中±10％、在一些实施例中±5％、在一些实施例中±1％、在一些实施例中±0.5％、且在一些实施例中±0.1％的变化，因为这些变化适于执行所公开的方法。如本文所使用的，范围可以表示为从“约”一个具体值，和/或至“约”另一个具体值。还应当理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则还公开“约10”。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。本公开的主题涉及用于预防性和治疗性疗法的组合物和佐剂，包括含有免疫刺激性RNA的组合物和含有RNA纳米颗粒的组合物。本文公开的组合物安全，有效，多功能且易于制造，提供新的解决方案以解决与当前疫苗设计和开发方法相关的未满足的需求。RNA可以用作用于开发新的纳米疫苗和用于疾病预防和治疗的佐剂的构建材料和/或免疫刺激剂。由RNA，CpGDNA，肽抗原或蛋白质抗原组成的超稳定RNA纳米颗粒可以在电脑中预先设计并通过热力学驱动的自组装来制造。制造的基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂具有预定义的化学计量、大小和结构，并且也是热力学超稳定并且抗血清中的降解。与仅CpGDNA和仅抗原相比，基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂的细胞摄取大大增强。与仅CpGDNA和仅抗原相比，由基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂诱导的免疫应答也将大大增强。基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂也可以与多种靶向配体结合以靶向B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞和癌细胞。靶向配体包括但不限于叶酸和RNA适体和DNA适体。在某些实施方式中，多个靶向配体可以与一个纳米颗粒结合以增强靶向功效。ssRNA、dsRNA和siRNA已显示具有免疫刺激活性。本发明涉及含有化学修饰的RNA的免疫刺激剂。化学修饰的RNA含有免疫刺激基序，其包括但不限于CpG基序。本发明还涉及使用免疫刺激RNA作为平台组分之一的疫苗和佐剂平台。此外，免疫刺激RNA还可以并入由RNA、CpGDNA、肽抗原或蛋白质抗原组成的超稳定RNA纳米颗粒中以形成纳米疫苗。制造的基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂具有预定义的化学计量、尺寸和结构，并且也是热力学超稳定的并且抗血清中的降解。与仅CpGDNA和仅抗原相比，由免疫刺激性RNA平台诱导的免疫应答将大大增强。免疫刺激RNA平台还可以与多种靶向配体结合以靶向B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞和癌细胞。靶向配体包括但不限于叶酸、siRNA、shRNA、RNA适体和DNA适体。在某些实施方式中，多个靶向配体可以结合到一个平台以增强靶向功效。根据本发明的疫苗平台和根据本发明的佐剂平台用于治疗或预防各种疾病，包括但不限于癌症、免疫学、呼吸道、中枢神经系统、炎症、心血管、感染性疾病以及药物和物质滥用。本文公开的基于RNA的组合物，包括含有RNA-纳米颗粒和含有RNA-寡核苷酸的组合物，具有许多有利的特征。这些优点包括以下。基于RNA的组合物具有限定的大小、结构和化学计量，使得可以避免由不均匀颗粒引起的不可预测的副作用。由于RNA纳米颗粒的多价性质，可以将多个抗原和佐剂并入一个颗粒中以实现协同或增强的免疫应答，如细胞因子诱导和抗体产生。颗粒的纳米尺寸将促进组织穿透并靶向重要的免疫组织或器官如淋巴结，以实现靶向和增强的免疫刺激。可以将多个靶向配体并入一个颗粒中以实现更好地靶向免疫细胞例如B细胞、T细胞、树突细胞和巨噬细胞。基于RNA的组合物的经济和容易的制造可以在无细胞系统中进行，其允许工业规模生产并避免可能的污染。RNA纳米颗粒高度可溶并且不易于聚集。它们不需要任何另外的步骤，例如与PEG连接以保持它们在溶液中稳定。RNA纳米颗粒还是热力学稳定的。例如，三角形状的RNA纳米颗粒抗沸腾。三向连接RNA纳米颗粒抗8M尿素变性。因此，RNA纳米颗粒将保持完整并且在体内不会在超低浓度下解离。例如，2'F-修饰的基于RNA的组合物抗血清中的降解，并且在血液中稳定。与仅CpGDNA和仅抗原相比，基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂的细胞摄取大大增强。本文公开的化学修饰的基于RNA的组合物的免疫刺激活性比其它佐剂如CpGDNA更强。由于基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂仅比抗原和佐剂更大的尺寸，基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂的体内半衰期明显延长，提供更好的药代动力学概况和更好的患者依从性。免疫刺激性RNA也可以并入由RNA、CpGDNA、肽抗原或蛋白质抗原组成的超稳定RNA纳米颗粒中以形成纳米疫苗。制造的基于RNA纳米颗粒的纳米疫苗和佐剂具有预定义的化学计量、大小和结构，并且还热力学超稳定并且抗血清中的降解。与仅CpGDNA和仅抗原相比，由免疫刺激RNA平台诱导的免疫应答将大大增强。本文公开的基于RNA的组合物是超稳定的并且抗血清中的降解，并且可以与靶向的配体，例如B、T、树突、巨噬细胞和癌细胞结合。本公开的主题包括包含RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序的组合物。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸包括选自2’氟，2’胺和2’O-甲基的化学修饰。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个碱基。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸是单链的。在其它实施方式中，RNA-寡核苷酸是双链或部分双链的(例如，含有发夹)。在一些实施方式中，免疫刺激基序选自免疫刺激RNA(isRNA)和CpG寡脱氧核糖核苷酸(CpG)。isRNA可以是本领域技术人员已知的任何RNA，例如，在专利申请公开号US2014/0135487和WO2003/086280中所述的那些。在一些实施方式中，免疫刺激基序与RNA-寡核苷酸结合。在一些实施方式中，免疫刺激基序是与RNA寡核苷酸结合的CpG。在一些实施方式中，提供包含RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序的组合物作为佐剂。在一些实施方式中，与独立于RNA-寡核苷酸提供的免疫刺激基序相比，细胞因子诱导的免疫调节作用增加至少十倍。在一些实施方式中，当免疫刺激基序与RNA-寡核苷酸结合时，细胞因子诱导和细胞结合的免疫调节作用增强至少10、20、30、40、50、100或200倍。本公开的主题还包括包含RNA纳米结构和佐剂，抗原和/或靶向配体的组合物。在一些实施方式中，RNA纳米结构选自RNA三角形、RNA四边形、RNA五边形、RNA六角形、RNA三向连接、RNA四向连接。在一些实施方式中，RNA纳米结构源自3WJ基序。对于一个非限制性实例，RNA纳米结构可以源自3WJ基序，如本文的审查员所述。对于另一个非限制性实例，RNA纳米结构可以如国际专利申请公开号WO2012/170372中所述。在包括佐剂的一些实施方式中，佐剂选自免疫刺激性RNA(isRNA)和CpG寡脱氧核糖核苷酸(CpG)。在包括isRNA的一些实施方式中，其长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35个碱基。在一些实施方式中，isRNA长度为约8-30个碱基。在一些实施方式中，佐剂是isRNA，并且通过碱基配对将isRNA并入RNA纳米颗粒中。在一些实施方式中，佐剂是isRNA，并且isRNA通过共价结合到RNA纳米颗粒的RNA链而并入RNA纳米颗粒中。在一些实施方式中，佐剂是如上所述的组合物，包括RNA寡核苷酸和免疫刺激基序。在一些实施方式中，通过RNA-寡核苷酸和RNA纳米颗粒之间的碱基配对将RNA寡核苷酸和免疫刺激基序并入RNA纳米颗粒。在一些实施方式中，RNA-寡核苷酸和免疫刺激基序通过与RNA纳米颗粒的RNA链共价结合的RNA-寡核苷酸并入RNA纳米颗粒中。在包含抗原的组合物的一些实施方式中，抗原衍生自细菌、病毒或细胞。在一些实施方式中，抗原结合中和抗体或抑制性抗体。在一些实施方式中，抗原是中和表位。在一些实施方式中，抗原选自：B细胞表位、T细胞表位、T辅助表位、衍生自PG120的表位、gp41表位、聚糖、肽、T辅助肽、链霉亲和素。在包括靶向配体的组合物的一些实施方式中，靶向配体选自：适体、细胞表面标记和癌细胞。在一些实施方式中，当靶向配体是适体时，适体结合HIV表位。在一些实施方式中，当靶向配体是细胞表面标记时，细胞表面标记是巨噬细胞或淋巴细胞。在一些实施方式中，组合物包含至少两种靶向配体。在一些实施方式中，多个靶向配体相同。在一些实施方式中，并非所有的多个靶向配体相同。如本领域技术人员将理解的，本文公开的组合物可以配制成包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌的水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及即将使用前重建成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及它们的合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。还可能期望的是包括等渗剂、如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶带来。可注射的药性持久的形式通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微囊基质来制备。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。药性持久的可注射制剂也通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射制剂可以例如通过经由细菌截留过滤器过滤或通过并入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。合适的惰性载体可包括糖例如乳糖。期望地，至少按重量计95％的活性成分的颗粒具有在0.01至10微米范围内的有效粒径。本公开的主题还包括本文公开的方法。例如，在受试者中诱导免疫应答的方法包括向受试者施用有效量的本文公开的组合物。本公开的主题还包括在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的组合物。在一些实施方式中，受试者患有或处于患病理状况的风险中。本公开的主题还包括诱导细胞因子产生的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的组合物。在一些实施方式中，细胞因子包括TNF-α，IL-6和/或IL-12。本公开的主题还包括诱导产生高亲和力中和抗体或抑制性抗体的方法，包括将本文公开的组合物施用于患有病理状况的受试者。示例性病理状况包括但不限于癌症、免疫学、呼吸道、中枢神经系统、炎症、心血管、感染性疾病、流感、人类免疫缺陷病毒(HIV)以及药物和物质滥用，例如可卡因或尼古丁滥用。如本文所用，术语“受试者”是指施用的靶标。本文公开的方法的受试者可以是脊椎动物，如哺乳动物，鱼类，鸟类，爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的受试者可以是人类或非人类。因此，根据本公开的主题提供兽医治疗用途。因此，本公开的主题提供对哺乳动物如人和非人灵长类动物，以及由于濒危而具有重要性的那些哺乳动物如西伯利亚虎；具有经济重要性，如在农场饲养以供人类消费的动物；和/或对人类具有社会重要性的动物，例如饲养为宠物或动物园的动物施用。这样的动物的实例包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪类，包括家猪(pig)，肉猪(hog)和野猪(wildboar)；反刍动物和/或有蹄动物如牛(cattle)，家牛(oxen)，绵羊，长颈鹿，鹿，山羊，野牛和骆驼；兔，豚鼠和啮齿动物。还提供了鸟类的治疗，包括治疗濒危和/或饲养在动物园中的那些种类的鸟类以及禽类(fowl)，更特别地驯养的禽类，即家禽(poultry)，例如火鸡，鸡，鸭，鹅，珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了家畜的治疗，包括但不限于驯养的猪类，反刍动物，有蹄类动物，马(包括赛马)，家禽等。该术语不表示特定的年龄或性别。通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明本公开的主题。以下实施例可以包括代表在与本发明相关的开发和实验过程中的各个时间收集的数据的数据的整理。实施例免疫反应的调节在癌症免疫治疗、疫苗佐剂开发和炎症或免疫疾病治疗中是重要的。在这里我们报告通过控制RNA三角形、四边形和五边形纳米结构之间的形状转换的新的免疫调节剂的开发。改变多边形中的一条RNA链自动诱导内角从60°至90°或108°的伸展，导致良好的的RNA三角形、四边形和五边形的自组装。当并入免疫佐剂时，它们对细胞因子TNF-α和IL-6诱导的免疫调节作用在体外和动物中大大增强高达100倍，而RNA多边形对照诱导不明显的作用。将RNA纳米颗粒特异性递送至巨噬细胞。免疫刺激的程度在很大程度上取决于每个纳米颗粒的有效载荷的大小、形状和数量。当每个多边形的佐剂数目增加时，观察到更强的免疫应答，证明了从三角形到五边形的形状转变的优点。通过拉伸热力学稳定的pRNA3WJ基序的60°AOB角(∠)(图1)，可以设计稳定的RNA结构。我们证明它可以伸展到较宽的构造，导致不同的2D多边形：三角形(∠AOB＝60°)，四边形(∠AOB＝90°)和五边形(∠AOB＝108°)。通过在使用RNA双螺旋的多边形的角之间通过碱基配对引入连接，避免了分子间相互作用，例如亲吻环(kissingloop)、受体环或“粘性末端”。因此，该系统在整个结构中具有增加的热稳定性是有利的。我们进一步表明RNA多边形有潜力作为用于免疫调节剂的新一代传递系统。合成的未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpGODN)是模拟细菌DNA的免疫刺激活性的免疫刺激性DNA分子(38，39)。CpGDNA基序通过内体Toll样受体9(TLR9)与各种免疫细胞相互作用强烈激活哺乳动物先天免疫系统(40，41)。在CpGDNA刺激时，免疫细胞可以分泌多种促炎和抗病毒细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-alpha或TNF-α)白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)和干扰素(IFN)，其导致强烈的免疫应答。CpGDNA的治疗潜力还在基础研究和人类临床试验中广泛探索，包括开发新的疫苗佐剂、抗癌剂、免疫保护剂和抗过敏剂(42-45)。最近，几个小组已经报道了利用DNA纳米结构例如DNA四面体(46)、DNA多肽结构(47)、DNA折纸结构(48)、Y形DNA(49)和DNA树状体(50)以递送免疫刺激性CpGDNA。在这项工作中，据我们所知，我们报告了第一次使用RNA纳米结构体外和体内递送CpGDNA。通过测量细胞因子的释放来评价RNA多边形的免疫刺激功效。我们发现细胞因子的诱导高度依赖于每个多边形的CpG数量。随着每个多边形的CpG数量的增加，观察到更强的免疫应答，证明了可以携带五个CpG的从三角形到五边形的转变的优点。我们还报告了RNACpG。将其与DNA区分开的RNA的特征是主链的每个核糖上的2’-羟基(2’-OH)。2’-OH基团提供RNA的特殊性质。从结构观点来看，这种额外的羟基基团的优点是它将核糖锁定成3’-内椅式构象，并且在结构上有利于RNA双螺旋采用A型螺旋，而不是通常存在于DNA中的B型螺旋。从热力学的角度来看，考虑到对于RNA双螺旋形成ΔG0为每个堆叠的碱基对-3.6至-8.5kJmol-1，且对于DNA双螺旋形成ΔG0为每个堆叠的碱基对-1.4kJmol-1，显著地，RNA双螺旋比DNA双螺旋更加热力学稳定。此外，在RNA的3D结构以及各种蛋白质和金属离子中存在特殊结构如弯曲，堆叠，连接和环也可以进一步提高其稳定性。类似于DNACpG序列，RNACpG序列也可以诱导免疫应答，并且可以应用于癌症免疫治疗和疫苗佐剂的开发。材料和方法RNA纳米颗粒设计，合成和自组装如前所述，pRNA分子的3WJ晶体结构(PDBID：4KZ2)主要用于使用SwissPDBviewer设计多边形模型(51)。通过使用聚合酶链式反应(PCR)生成的DNA模板体外T7转录合成相应三角形，四边形和五边形的RNA链。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化RNA，并且如前所述Cy5整体RNA标记(MirusBioLLC)或5’-末端[-32P]ATP(PerkinElmer)标记(8)。通过在1xTMS缓冲液(50mMTRISpH8.0,100mMNaCl和10mMMgCl2)中混合用于三角形的四条RNA链，用于四边形的五条RNA链和用于五边形的六条RNA链的等摩尔浓度(最终浓度为1IIM)在一个罐中装配RNA多边形。样品在热循环仪中使用受控的，从80至4℃的缓慢冷却(1℃/min)退火1小时。在一个罐中从它们相应的2’F-U/C修饰链组装内含CpGODN的所有RNA多边形。用于装配RNA多边形的三条短RNA链和一条长RNA链提供在表1中。用于装配方形RNA纳米结构的四条短链和一条长链在表2中提供。用于组装五边形RNA纳米结构的五条短链和一条长链在表3中提供。表4提供了CpG基序的序列。表5提供了内含RNACpG基序的RNA三角形的序列。天然PAGE，温度梯度凝胶电泳(TGGE)和沸腾耐性测定在0.5×TMS缓冲液存在下，在7％(29:1)天然聚丙烯酰胺凝胶上评估RNA组装。凝胶在恒定的90V，+4℃下运行。使用TyphoonFLA7000(GEHealthcare)对凝胶成像以可视化RNA链。如前所述，在含有50mMTRISpH8.0、100mMNaCl和0.2mMMgCl2的缓冲液中，在7％天然PAGE上进行温度梯度凝胶电泳(TGGE)分析(14，26，28)。垂直于电流施加30-70℃的梯度温度，并且实验在20W下运行1小时。在TGGE分析中使用100nM的总RNA浓度。如前所述，表观TM值对应于一半多边形部分解离的温度，并且计算多个RNA链的表观KD值(7)。在TMS缓冲液中或在8M尿素存在下，在含有1IIM预装配的多边形的10III中进行抗沸腾测定。将样品在100℃温育数分钟，然后在干冰上快速冷却以防止重折叠，随后在4℃下在7％天然PAGE上评估。重复几次单独的实验以减少误差。使用ImageJ进行定量分析(52)。在对应于三角形，四边形或五边形复合物的通道周围绘制等大小的框，并且对于每种类型的多边形的相应的量化值除以相应通道中呈现的值的总和。细胞培养使小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞在补充有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)中在37℃下在含有5％CO2的潮湿空气中生长。然后将细胞以5×105个细胞/ml的密度接种在24孔板或96孔板上，并在使用前培养过夜。来自RAW264.7的细胞因子分泌将RAW264.7细胞以2.5×105个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并培养过夜。然后，将内含不同数量的CpGODN的RNA纳米颗粒在Opti-MEM培养基(LifeTechnologiesCorporation，Carlsbad，CA，USA)中稀释并加入细胞中。将细胞在37℃下在含有5％CO2的加湿空气中连续培养8小时，收集细胞培养上清液，并在-80℃下储存，直到使用。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用MouseELISAMAXTMDeluxe套件(BioLe-gend，Inc.，SanDiego，CA)，根据制造商提供的方案，测定上清液中TNF-α和IL-6。来自小鼠的细胞因子分泌雄性CD-1小鼠(4-5周龄)购自CharlesRiverLaboratories。所有动物程序由肯塔基大学的机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准并且根据由国立卫生研究院发布的指导进行，用于实验室动物的护理。对于体内免疫刺激，将内含CpGODN，RNA三角形纳米颗粒或CpGODN的RNA三角形纳米颗粒溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并通过尾静脉注射以2mg/kg(每体重CpGODN)给予小鼠。将相同体积的PBS注射到小鼠中作为对照。通过心脏穿刺在注射后3小时收集血液样品。通过在12800g离心10分钟制备血清。使用MouseELISAMAXTMDeluxe套件(BioLegend，Inc.，SanDiego，CA，USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，根据制造商提供的方案，测定血清TNF-α和IL-6水平。共聚焦显微成像将RAW264.7细胞接种在24孔板中的玻璃盖玻片上，并在37℃下在含有5％CO2的湿润空气中培养过夜。除去培养基，并用Opti-MEM培养基洗涤细胞两次以除去死细胞。将内含Cy3标记的CpGDNA的RNA纳米颗粒或仅Cy3标记的CpGDNA在Opti-MEM培养基中稀释并加入细胞中。在37℃下在含有5％CO2的湿润空气中温育4小时后，将细胞用PBS洗涤两次并用4％甲醛固定。使用具有DAPI的ProLongRGold抗褪色试剂(LifeTechnologiesCorporation，Carlsbad，CA)对细胞核染色并固定样品。AlexaFluorR488鬼笔环肽(LifeTechnologiesCorporation，Carlsbad，CA，USA)用于染色肌动蛋白。在OlympusFV1000共聚焦显微镜(OlympusCorporation，Tokyo，Japan)上获得图像。原子力显微成像如先前报道的方法，将RNA多边形用MultiModeAFMNanoScopeIV系统(Veeco)成像(61)。简言之，将RNA样品用1×TMS缓冲液稀释至终浓度3-5nM。然后，将样品液滴(5-10L)立即沉积在APS云母上。在特异性修饰的APS云母表面上温育2分钟后(41；42)，用DEPC处理的水洗涤过量的样品，并在氩气流下干燥。使用以轻敲模式操作的多模式AFMNanoScopeIV系统(Veeco/DigitalInstruments，SantaBarbara，CA)获得AFM图像。动态光散射通过Zetasizernano-ZS(MalvernInstrument，LTD)在25℃下测量在50μLTMS缓冲液中的预装配的三角形，四边形和五边形复合物(10μM)的表观流体力学尺寸。激光波长为633nm。流式细胞术试验通过使用细胞刮刀从细胞培养瓶中分离RAW264.7细胞。用Opti-MEM培养基洗涤细胞，并以5×105个细胞/管的密度在1.5mL微量离心管中等分。将内含Cy3-标记的CpGDNA的RNA纳米颗粒或仅Cy3-标记的CpGDNA在Opti-MEM培养基中稀释，并与细胞在37℃温育1.5小时。在温育期间每30分钟涡旋细胞。用PBS洗涤后，将细胞重悬浮于PBS中，并通过FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences，SanJose，CA)测定荧光强度。细胞毒性试验根据制造商提供的方案，使用MTT试验试剂盒(Promega，Madison，WI)评价内含CpGODN的RNA纳米颗粒的细胞毒性。简言之，将RAW264.7细胞接种在96孔板中，并在37℃下在含有5％CO2的湿润空气中培养过夜。将内含CpGODNs和对照的RNA纳米颗粒以指定浓度溶于新鲜细胞培养基中，并加入到细胞中，在37℃温育24小时。然后，向每个孔中加入15μL染料溶液，随后在37℃下温育4小时，接下来，将100μl增溶溶液加入到每个孔中，并且将板在室温下在板振荡器上温育，直到甲臢(formazan)结晶体完全溶解。使用酶标仪在570nm处测量吸光度。相对于仅细胞对照的吸光度(仅细胞对照的存活率＝1)计算细胞存活率。RNA多边形：三角形、四边形和五边形制造和自组装最近发现的来自噬菌体Phi29DNA包装马达的超稳定的pRNA3WJ模块的结构特征用于RNA三角形、四边形和五边形2D多边形的计算机设计。在计算机建模期间，我们使用由H1和H2形成的3WJ的特定角度作为多边形的内角，因为我们假设角度可以被伸展到更开放的构象。在本报告中，H1和H2之间的螺旋内角被表示为∠AOB，如图1所示。每个RNA模型在每个顶点包含pRNA3WJ基序，且内角对应于∠AOB。如从3WJ基序的平面几何形状所预期，所得到的3D模型显示平面构象(51)(图2A)。如本文所使用的，顶点指的是角如∠AOB的点，且顶点指的是多边形的角。作为示例，并且参考图2B，由内链D和外链A，B和C限定的三角多边形包括三个顶点；由内链E和外链A，B，C和D限定的四边形多边形包括四个顶点；并且由内链F和外链A，B，C，D和E限定的五边形多边形包括五个顶点。每个多边形由分类为短链(外部)和长链(内部)的不同数量的RNA链组成(图2B)。通过增加外链的数量和中心或内部链的延伸，螺旋间∠AOB上的拉伸增加到60°、90°和108°，允许2D形成相应的三角形，四边形和五边形形状。从一个角到另一个角的测量而定宽度为10.2nm，而高度不同如下：三角形＝9.1nm，四边形＝10.2nm，五边形＝12.7nm。在单个RNA链转录后，在7％天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上评估三角形、四边形和五边形设计的自组装性质(图2C)。通过一步自组装获得所有多边形结构(7，10，11，19)。相应纳米颗粒的每个RNA组分用Cy5全链标记以评估所有RNA链在其相应组装中的参与。基于天然PAGE凝胶评估，正确组装的多边形的产率估计为>90％。从表观KD凝胶获得解离的平衡常数，并且分别确定三角形、四边形和五边形的KD值为18.8,20.3和22.5nM(图7和8)。这些结果表明每个RNA纳米颗粒组装成所需的纳米结构，并通过伸展60°∠AOB到更宽的构象。RNA链到特定形状的纳米颗粒基于pRNA3WJ基序的60°∠AOB的的组装通过调整短外链的数量和长内链的长度控制。通过原子力显微镜(AFM)和DLS的多边形的结构表征为了进一步评估所得RNA组装体的大小和形状，通过AFM进行每个多边形的结构表征。基于pRNA3WJ的多边形的AFM图像揭示所得多边形的形状类似于它们预测的理论3D模型(图3A)。对于三角形、四边形和五边形，估计的平均尺寸分别为13±1.1,14±1.8和17±1.6nm。这些值由于AFM针尖卷曲(tipconvolution)不反映RNA多边形的真实尺寸，而是表明纳米颗粒的平均尺寸从三角形增加到五边形。此外，每个RNA形状的中心腔可见，并且腔的尺寸随着多边形顶点的数量而逐渐增加。发现所有纳米颗粒的测量的高度为2nm，与先前报道的核酸双螺旋的高度一致(26，53)。进行定量分析以比较在AFM云母表面上观察到的多边形之间的表观产率。将多边形的相等浓度(1nM)沉积在云母表面上，并在0.5μm2面积中手动计数正确折叠的多边形，得到48个三角形颗粒，33个四边形颗粒和17个五边形纳米颗粒(图9)。吸附在云母上的三角纳米颗粒的估计数量比四边形的多1.5倍，且比五边形的多三倍。然而，天然PAGE显示三个多边形之间的产量几乎相等。云母表面上的多边形之间的吸附量的差异可能是由于它们的尺寸和3D构象的变化，导致不同的动力学和物理性质。进行通过DLS的多边形的流体动力学直径，以确定每个多边形的表观流体动力学直径。进行DLS以确定每个多边形的表观流体动力学直径。对于三角形、四边形和五边形发现直径分别为9.1、11.2和13.5nm(图3B)。3WJ核的数量的增加对应于观察到的更大的直径。测量直径与它们相应的3D模型一致。然而，由AFM和DLS确定的多边形尺寸之间存在差异。这可以归因于基本不同的技术，因为DLS确定纳米颗粒在溶液中的平均尺寸分布曲线，假设多边形具有球形形状[参见http://www.malvern.com上的手册]，而AFM成像由于使用的针尖尺寸(54)和成像设备的分辨率，可以产生大于实际直径的图像。然而，这两种技术证明纳米颗粒的相对尺寸从三角形增加到四边形到五边形。因此，天然PAGE、AFM和DLS显示基于pRNA3WJ∠AOB的三角形、四边形和五边形的紧密分子2D组装的形成。因此，自然保存的60°∠AOB可以伸展到达四边形和五边形的形成。角所经历的伸展或拉伸可能对纳米颗粒的总体稳定性具有显著影响。因此，评估和比较多边形的稳定性是非常重要的。三角形，四边形和五边形之间的稳定性比较多边形稳定性的TGGE研究使用垂直TGGE(BiometraGmbH)研究多边形的稳定性。这种方便的技术已经获得用于测量具有多链的RNA纳米颗粒的熔融温度的广泛使用(5，7，14，26，28，55)。使预组装的多边形经受7％天然TGGE，其中梯度温度为30-70℃，垂直于电流。在0.2nMMgCl2的存在下对100nM总浓度(Ct)下的多边形获得以下表观TM值：三角形TM＝56℃、四边形TM＝53℃和五边形TM＝50℃(图4A)。三角形纳米支架比四边形和五边形更稳定，尽管与四边形和三角形相比，五边形构建体中RNAbp的数目高得多。通常，具有相同碱基对含量的核酸的稳定性直接取决于金属离子和总核酸浓度。因为这两个标准相同，所以假定给定RNA结构中的bp数越高，稳定性越高。因此，产生的最稳定的形状应该是五边形。然而，基于TGGE数据，发现相反。这可能是由于由天然pRNA3WJ60°∠AOB的伸展引起的张力。三角形构造的角(60°)保持，四边形和五边形角分别伸展至90°和108°的较宽构象。先前已经显示，在pRNA3WJ基序的天然核结构内的任何核苷酸突变或缺失也将导致其热力学稳定性的丧失(10)。有趣的是，测量的三角形和四边形TM值偏离+3的C，如四边形和五边形偏离的。在存在和不存在8M尿素下的抗沸腾试验进一步证实三角形是最稳定的纳米颗粒(图4B)。加热至100℃后纳米颗粒带的定量导致三角形组件的75±4％恢复，表明TM>100℃。根据定义，TM是当RNA浓度的一半已经熔融，即50％恢复时测量的温度。四边形的恢复百分比为28±2％，且五边形为16±5％，远低于三角形恢复的估计值。在沸腾溶液中存在8M尿素的实验显示稳定性的总体趋势保持相同，但是三角形的恢复百分比为55±4％，四边形的恢复百分比为8±3％，没有检测到五边形部分。总体上，具有较少的3WJ基序(三角形)的纳米颗粒导致更高的热稳定性和化学降解抗性，并且稳定性的变化在很大程度上是由于∠AOB的伸展。CpG-RNA多边形的毒性试验内含三角形、四边形和五边形的免疫佐剂CpG寡核苷酸的调节效应是免疫佐剂，其被广泛用作用于疾病控制和治疗的疫苗佐剂或免疫治疗试剂(42)。为了评估RNA多边形是否可以增强免疫调节效应，使用一罐自组装将CpG寡核苷酸与每个RNA多边形合并(图10-12)。所得复合物的毒性试验显示没有毒性；此外，与仅细胞对照相比，RNA多边形-CpG复合物在温育期间诱导细胞增殖(图13)。测量TNF-α和IL-6细胞因子的释放如前所述，通过测量加入小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞后细胞因子TNF-α和IL-6的释放来评价RNA多边形的细胞外免疫刺激效力(图5A和B)(56，57)。仅与一个CpG连接的三角形RNA纳米颗粒与四边形和五边形RNA纳米颗粒相比对TNF-α和IL-6两者表现出最高水平的细胞因子诱导。增加每个纳米颗粒的CpG数量产生相反的效果，因为五边形RNA纳米载体显示最高水平的TNF-α和IL-6二者的诱导，推测是由于局部CpG浓度增加。结果表明，与单独的CpG相比，通过与具有不同形状的RNA多边形连接的CpG的细胞因子释放显著增加免疫刺激活性(图5)。具有约10nm尺寸的RNA颗粒，例如三角形，诱导最大量的TNF-α和IL-6。此外，细胞因子的诱导高度依赖于每个多边形的CpG的数量。随着每个多边形的CpG数量的增加，观察到更强的免疫应答(图5C)，证明了可以携带五个CpG寡核苷酸从三角形转移到五边形的优点。通过并入RNA三角形的免疫佐剂增强动物中的调节效应为了检查RNA纳米颗粒是否在体内保持其免疫刺激活性，通过以2mg/kg(每体重CpG寡核苷酸)注射到尾静脉中来向CD-1小鼠施用纳米颗粒，随后在给予3小时后在收集的血清中细胞因子TNF-α和IL-6水平的水平测定。图5D显示，游离三角形纳米颗粒和游离CpG不诱导任何细胞因子产生，而复合三角形-CpG导致两种细胞因子的水平升高。与游离CpG在体内相比，三角形-CpG的免疫刺激活性的差异估计为10倍。这些数据与鼠RAW264.7细胞的体外刺激一致。通过不同CpG-RNA多边形的细胞摄取的比较先前，已经证明CpG寡核苷酸可以容易地被巨噬细胞的内体膜上的TLR9识别，导致CpG佐剂的细胞摄取。为了研究RNA多边形结合细胞的效率之间是否存在差异，我们使用流式细胞术试验定量多边形-CpG的细胞摄取(9，10)。图6A表明不同的RNA多边形-CpG与RAW264.7细胞以剂量依赖性方式的结合。从三角形到具有更多CpG的五边形的结合效率增加(图14)。值得注意的是，所有RNA多边形-CpG复合物在胎牛血清(FBS)中温育16小时后保持完整，表明组装的复合物在细胞外环境中的稳固性(图15)。总体而言，与单独的CpG寡核苷酸相比，RNA多边形-CpG复合物显示出对细胞的明显更多的结合效率。该观察通过共聚焦显微镜图像(图6B)进一步证实，其揭示内含CpG的RNA纳米颗粒仅位于细胞质中，并且与游离CpG相比，细胞内有高得多的量的三角形纳米颗粒，表明RNA纳米颗粒可以有效地增强CpG佐剂的细胞摄取。共同地，流式细胞术和共聚焦成像两者表明与游离CpG相比，具有不同形状且内含CpG的所有RNA纳米颗粒具有强得多的结合和细胞进入巨噬细胞样RAW264.7细胞。此外，细胞摄取高度依赖于每个多边形的CpG数。随着每个多边形的CpG数量的增加，观察到更有效的细胞进入(图5C)，证明了从三角形到可以携带五个CpG的五边形纳米颗粒的转变的优点。RNA纳米颗粒的人造构建需要RNA基序的结构特性的知识，例如螺旋间或螺旋内距离，X-Y和X-Y-Z角，多向接头中RNA分支的数量和取向，规范和非规范相互作用，蛋白质，金属离子和小分子的结合位点(2，10，16，25，51，60)。RNA结构生物学的进展允许以原子分辨率由现有RNA结构分析RNA3D基序，以及各种数据库，包括www.pdb.com，RNA多向连接(61)和寻找RNA基序(62)。这项研究，基于以前报告的多功能pRNA3WJ3D基序(PDBaccessionID：4KZ2)，表明3WJ结构可以基于60°∠AOC的动力学折叠成所需的构象，表明调整RNA多边形的物理和结构性质用于各种技术、生物和医药需要的能力。这种方法基于用于导向相应的短链或外链折叠成平面三角形，四边形和五边形构象的中心RNA链的延伸，导致pRNA3WJ的螺旋间∠AOC的60°，90°和108°弯曲。这对于其中需要构建基于无毒和热力学稳定的构件的不同RNA纳米支架的医学应用尤其重要。由该技术产生以下优点：(i)治疗分子的数量和组合可以调整为基于RNA的纳米载体；(ii)纳米支架具有可控的尺寸和形状，并且(iii)可以根据纳米骨架的应用来应用可变的热力学和RNA酶抗性性质。除了发现用于合理设计稳定RNA纳米颗粒的独特方法外，已经证明每个RNA多边形具有作为疫苗佐剂，特别是CpG寡聚脱氧核苷酸的多价纳米载体的潜力。设计的RNA自组装成具有高化学，热和细胞内稳定性的不同的，无毒的均匀纳米颗粒。我们发现RNA纳米结构的大小和形状是诱导体外和动物模型中的免疫刺激过程的重要因素，并且细胞因子诱导和局部CpG浓度效应之间存在相关性。与四边形(～11nm)和五边形(～13nm)相比，使用内含一个CpG的最小纳米颗粒(三角形～9nm大小)获得了促炎细胞因子肿瘤坏死因子TNF-α，白细胞介素(IL)-6的最高水平的分泌。然而，在增加每个RNA纳米颗粒的CpG数目时，细胞因子诱导更多地受五边形影响，因为CpG的数量或局部浓度在五边形中最高。这项研究说明了RNA纳米颗粒的大小和形状对于改善靶向传染病和癌细胞的基于CpG的疫苗的活性，以及对于增加由先天和获得性免疫系统的免疫应答的重要性。含有CpG的RNA纳米颗粒是安全、有效、多功能和容易制造的，提供新的解决方案以解决当前疫苗和佐剂中未满足的需要。热力学上超稳定(10，11)和耐热(18)的RNA纳米颗粒的最近的发现已经扩大了在生物医学、纳米技术或聚合物工业领域中应用源自pRNA3WJ的纳米颗粒的可能性。在图64中，内含CpG的2’F三角形的细胞因子测试，内含DNACpG的DNA三角形和内含2’FRNACpG的2’F三角形显示在内含2’FRNACpG的2’F三角形中的细胞培养物上清液中相比于内含DNACpG的2’F三角形和内含DNACpG的DNA三角形的增加的TNF-α。在本文中，提及了各种参考文献。所有这些参考文献通过引用并入本文，包括以下列出的参考文献：参考文献1.Guo,P.,Zhang,C.,Chen,C.,Trottier,M.andGarver,K.(1998)Inter-RNAinteractionofphagephi29pRNAtoformahexamericcomplexforviralDNAtransportation.Mol.Cell,2,149–155.2.Guo,P.(2010)TheemergingfieldofRNAnanotechnology.Nat.Nanotechnol.,5,833–842.3.Chen,C.,Zhang,C.andGuo,P.(1999)Sequencer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