本专利申请要求2014年7月11日提交的美国临时申请62/023239的优先权，所述临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域：
：本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及用于改变植物细胞的基因组的方法。
背景技术：
：：重组DNA技术已使得可以将外来DNA序列插入生物体的基因组中，从而改变该生物体的表型。最常用的植物转化方法是农杆菌属(Agrobacterium)感染和基因枪粒子轰击，在这些方法中转基因以随机方式和以不可预测的拷贝数整合进植物基因组中。因此，人们作出努力来控制植物中的转基因整合。一种用于插入或者修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。虽然已开发出了几种方法来靶向植物基因组中的特定位点以进行修饰，但对用于产生具有改变的基因组的能育植物的更高效和有效的方法仍存在需求，该改变的基因组包含位于该植物基因组的限定区域中的特异性修饰。技术实现要素：本发明提供了在植物中利用向导RNA/CAS内切核酸酶系统的组合物和方法，从而对植物或植物细胞的基因组中的靶序列(涉及改善植物的农学性状)进行基因组修饰，选择植物，编辑基因，以及将目的多核苷酸插入植物基因组中。该方法和组合物利用向导RNA/CAS内切核酸酶系统来提供修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内靶位点和目的核苷酸的有效系统。一旦鉴定基因组靶位点，就可利用多种方法进一步修饰靶位点，由此使得其可包含多种目的多核苷酸。本发明还公开了育种方法和用于利用双组分RNA向导和Cas内切核酸酶系统来选择植物的方法。本发明还提供了具有向导RNA/Cas内切核酸酶系统的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。本发明还提供了利用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，从而对细胞或生物体的基因组中的靶序列进行基因组修饰，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入细胞或生物体的基因组中或使来自于细胞或生物体的基因组的目的多核苷酸缺失。该方法和组合物利用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统以提供修饰或改变靶位点和编辑细胞基因组内的目的核苷酸序列的有效系统，其中向导多核苷酸由RNA序列、DNA序列、或DNA-RNA组合序列组成。在一个实施方案中，一种改善植物的农学性状的方法，该方法包括：提供靶向改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸的向导RNA，该向导RNA与在多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联；以及生成植物，其中该植物表现出农学性状的改善。在一个实施方案中，本发明还公开了与对应的内源性未修饰的基因组DNA相比包括一个或多个核苷酸变化的供体多核苷酸。在一个实施方案中，供体多核苷酸不编码全长蛋白质。在一个实施方案中，供体多核苷酸包含异源调控元件。在一个实施方案中，调控元件包含启动子。在一个实施方案中，调控元件包含增强子元件。在一个实施方案中，增强子元件来源于植物。在一个实施方案中，多核苷酸选自调控元件、5’-UTR、内含子、外显子、编码序列和启动子。在一个实施方案中，异源调控元件来自于与改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸相同的植物物种。在一个实施方案中，向导RNA靶向选自涉及ZmArgos8、ZmACS6、ZmSRTF18、ZmXERICO1、海藻糖-6-磷酸酯磷酸酶(T6PP)和ZmSTPP3的表达的多核苷酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，农学特性选自非生物胁迫耐受性。在一个实施方案中，非生物胁迫耐受性为干旱或缺乏营养物质。在一个实施方案中，农学特性为收率的增大或耐旱性的增加。在一个实施方案中，Cas9内切核酸酶在多核苷酸的编码区域中产生双链断裂。在一个实施方案中，植物选自玉米、大豆、稻、小麦、高粱、芸苔属、向日葵和亚麻荠。一种改善玉米植物的谷物收率的方法，该方法包括：提供靶向涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的多核苷酸的向导RNA，该向导RNA与在该多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成植物，其中玉米植物表现出改善的谷物收率。在一个实施方案中，与涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的多核苷酸的对应的内源性未修饰的基因组DNA相比，供体多核苷酸包括一个或多个核苷酸变化。在一个实施方案中，多核苷酸为玉米ACC合酶。在一个实施方案中，多核苷酸为玉米ARGOS。在一个实施方案中，玉米ACC合酶的表达相比于对照玉米植物降低。在一个实施方案中，玉米ARGOS相比于对照玉米植物增加。在一个实施方案中，玉米ARGOS通过插入异源调控元件而增加。一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向调控编码丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸的表达的基因组区域的向导RNA，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成玉米植物，其中该玉米植物表现出改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶为ZmSTPP3。在一个实施方案中，ZmSTPP3的表达相比于对照玉米植物增加。在一个实施方案中，ZmSTPP3的表达通过插入异源调控元件来增加。在一个实施方案中，异源调控元件为中等组成型启动子。在一个实施方案中，异源调控元件来源于玉米。一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向玉米植物的基因组区域的向导RNA以引入多核苷酸的一个或多个变化，从而生成雄性能育性减少的显性表型，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成玉米植物，其中当通过包括大量能育花粉的玉米植物受精时，该玉米植物表现出减少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，雄性能育性减少。在一个实施方案中，玉米植物是良种近交或杂交玉米植物。在一个实施方案中，MS44多肽在对应于信号肽裂解位点的位置处具有突变。在一个实施方案中，信号肽裂解位点位于未加工的MS44多肽的约38位氨基酸或39位氨基酸。一种改善作物植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向植物的基因组区域的向导RNA以引入编码与SEQIDNO：554具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸的一个或多个变化，从而生成雄性能育性减少的显性表型，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成植物，其中当通过包括大量能育花粉的能育植物受精时，该植物表现出减少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，植物选自稻、小麦和高粱。在一个实施方案中，植物是能够转化的良种品种。在一个实施方案中，MS44多肽在对应于信号肽裂解位点的位置处具有突变。在一个实施方案中，植物在氮减少的环境中生长。在一个实施方案中，该多肽与SEQIDNO：554具有约90％的同一性。在本公开的一个实施方案中，该方法包括用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在植物基因组的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，该第二植物包含能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物的向导RNA，c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点的改变，以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。在另一个实施方案中，该方法包括用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物，该方法包括选择至少一种在其植物基因组中的靶位点包含改变的子代植物，其中所述子代植物通过使包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂。在这些实施方案中的植物是单子叶植物或者双子叶植物。更具体地，单子叶植物选自玉米、稻、高粱、裸麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或者柳枝稷。双子叶植物选自大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉、烟草属植物、花生、马铃薯、烟草属植物、拟南芥或者红花。在一些实施方案中，靶位点位于乙酰乳酸合酶的基因序列中。在另一个实施方案中，本公开包括包含重组DNA构建体的植物、植物部分、或种子，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合至所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。在另一个实施方案中，植物包含重组DNA构建体和向导RNA，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶和向导RNA能够形成复合物并在所述植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化的Cas9内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合至所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至表达向导RNA的核苷酸序列的启动子，其中所述向导RNA能够与植物优化的Cas9内切核酸酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合至所述植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。在另一个实施方案中，该方法包括用于选择雄性不育或雄性能育植物的方法，该方法包括对在位于雄性能育基因座的基因组靶位点处包含改变的至少一种子代植物进行选择，其中所述子代植物通过使表达Cas9内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述基因组靶位点处引入双链断裂。在另一个实施方案中，该方法包括用于产生雄性不育或雄性能育植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在位于植物基因组的雄性能育基因座的基因组靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，该第二植物包含能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物的向导RNA，c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点的改变，以及e)选择雄性不育或雄性能育的子代植物。雄性能育基因可选自，本发明还提供了用于编辑细胞的基因组中核苷酸序列的组合物和方法。在一个实施方案中，本公开描述了一种用于编辑植物细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括为植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种玉米优化的Cas9内切核酸酶，其中玉米优化的Cas9内切核酸酶能够在所述植物基因组的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。待编辑的核苷酸(目的核苷酸序列)可位于被Cas内切核酸酶识别并裂解的靶位点之内或之外。细胞包括但不限于人、动物、细菌、真菌、昆虫和植物细胞以及由本文所述方法产生的植物和种子。一种在保持初始内源性表达模式的同时为植物细胞的内源性多核苷酸提供附加表达谱的方法，该方法包括在内源性多核苷酸的上游区域提供异源调控元件，由此使得通过提供功能性终止子序列来保持初始基因的天然表达模式。本发明的方法和组合物的另外的实施方案在本文公开。附图和序列表简述由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。本申请随附的序列说明和序列表(文件名BB2394_SeqListing.txt”，创建于2011年7月4日，548kb)符合美国联邦法规37C.F.R.§§1.821-1.825中关于专利申请中的核苷酸和氨基酸序列公开的指导规则。序列说明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定义的氨基酸三字母代码，将其以引用方式并入本文。附图图1A示出可操作地连接至植物遍在蛋白启动子的包含马铃薯ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位序列(NLS)和VirD2羧基末端NLS的玉米优化的Cas9基因(编码Cas9内切核酸酶)(SEQIDNO：5)。玉米优化的Cas9基因(仅Cas9编码序列，无NLS)对应于SEQIDNO：5的第2037-2411和2601-6329位核苷酸，其中马铃薯内含子位于SEQIDNO：5的第2412-2600位。SV40NLS位于SEQIDNO：5的第2010-2036位。VirD2NLS位于SEQIDNO：5的第6330-6386位。图1B示出可操作地连接至玉米U6聚合酶III启动子的以玉米U6终止子终止的长向导RNA(SEQIDNO：12)。包含对应于玉米LIGCas-3靶位点的可变靶向结构域的长向导RNA(SEQIDNO：8)转录自/对应于SEQIDNO：12的第1001-1094位。图1C示出在单载体DNA上组合的玉米优化的Cas9基因和长向导RNA表达盒(SEQIDNO：102)。图2A示出相对于在玉米LIGCas-3(SEQIDNO：18)靶位点上适当取向的PAM序列的双链crRNA(SEQIDNO：6)-tracrRNA(SEQIDNO：7)/Cas9内切核酸酶系统和靶DNA复合物，三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期的裂解位点。图2B示出相对于在玉米基因组LIGCas-3靶位点(SEQIDNO：18)上适当取向的PAM序列(GGA)的与基因组靶位点相互作用的向导RNA/Cas9内切核酸酶复合物。向导RNA(以浅灰色框示出，SEQIDNO：8)为crRNA与tracrRNA之间的融合体，并且包含与双链DNA基因组靶位点的一条DNA链互补的可变靶向结构域。Cas9内切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期的DNA裂解位点。图3A-3B示出在玉米基因组无舌叶1基因座处，由本文所述的玉米优化的向导RNA/CAS内切核酸酶系统诱导的最频繁的前10种NHEJ突变相比于LIG3-4归巢内切核酸酶对照的比对和计数。突变通过深度测序进行鉴定。参考序列示出未经修饰的基因座，各个靶标位点以下划线表示。还指示了PAM序列和预期的裂解位点。由不完全的NHEJ导致的缺失和插入分别示为“-”或斜体加下划线的核苷酸。LIGCas-1靶位点的参考和突变1-10分别对应于SEQIDNO：55-65。LIGCas-2的参考和突变1-10分别对应于SEQIDNO：55、65-75。LIGCas-3的参考和突变1-10分别对应于SEQIDNO：76-86。LIG3-4归巢内切核酸酶靶位点的参考和突变1-10分别对应于SEQIDNO：76、87-96。图4示出如何构建同源重组(HR)修复DNA载体(SEQIDNO：97)。为了通过同源重组来促进位点特异性转基因插入，转基因(以浅灰色示出)每侧均侧接有与玉米基因组区域具有同源性的约1kb的DNA，该1kbDNA与LIGCas3和LIG3-4归巢内切核酸酶的预期裂解位点紧邻。图5示出如何通过PCR筛选位点特异性转基因插入的提取自稳定转化体的基因组DNA。无舌叶1基因座内的基因组引物(对应于SEQIDNO：98和101)设计在用于构建HR修复DNA载体(SEQIDNO：97)的区域之外，并且与转基因(对应于SEQIDNO：99和100)内部的引物成对，以利于PCR检测由适当取向的位点特异性转基因整合而形成的独特的基因组DNA接头。图6示出当短向导RNA作为RNA被直接递送时，由本文所述的玉米优化的向导RNA/CAS内切核酸酶系统诱导的NHEJ突变的比对。该突变通过深度测序进行鉴定。参考序列示出未经修饰的基因座，基因组靶标位点以下划线表示。还指示了PAM序列和预期的裂解位点。由不完全的NHEJ导致的缺失和插入分别示为“-”或斜体加下划线的核苷酸。55CasRNA-1的参考和突变1-6分别对应于SEQIDNO：104-110。图7：通过用本文所述的gRNA1/Cas9内切核酸酶系统靶向向导RNA/Cas9靶序列1(CTS1，SEQIDNO：1)将Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON插入玉米ARGOS8基因的5’-UTR中的示意图。HR1和HR2指示同源重组区域。图8A-8C：玉米植物中Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON插入事件的鉴定和分析。(A)Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON插入Zm-ARGOS8的5’-UTR中的示意图。使用本文所述的gRNA1/Cas9内切核酸酶系统靶向CTS1。HR1和HR2指示同源重组区域。P1至P4指示PCR引物。(B)PCR筛选PMI-抗性愈伤组织以鉴定插入事件。示出13个代表性愈伤组织的PCR结果。左边和右边接头的PCR分别用引物对P1+P2和P3+P4进行。(C)T0植物的PCR分析。用引物P3和P4扩增具有期望尺寸(2.4kb，泳道T0)的PCR产物。图9：通过靶向CTS3(SEQIDNO：3)和CTS2(SEQIDNO：2)用Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON置换Zm-ARGOS8启动子的示意图HR1和HR2指示同源重组区域。图10A-10D：玉米植物中用Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON置换ARGOS8基因的天然启动子。(A)通过启动子更换产生的Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON：ARGOS8等位基因的示意图。用gRNA3/gRNA2/Cas9系统靶向两个向导RNA/Cas9靶位点即CTS3(SEQIDNO：3)和CTS2(SEQIDNO：2)。HR1和HR2指示同源重组区域。P1至P5指示PCR引物。(B)PCR筛选PMI-抗性愈伤组织以鉴定更换事件。示出10个代表性的愈伤组织的PCR结果。对于左接头(L，引物P1+P2)和右接头(R，引物P5+P4)的PCR两者，一个愈伤组织样品12A09均呈阳性，这表明12A09为更换事件。(C)在初步筛选中鉴定愈伤组织事件的PCR分析。使用引物P3和P4扩增来自于事件#3、4、6、8和9的具有期望尺寸(2.4kb)的PCR产物，这表明存在Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON：ARGOS8等位基因。(D)T0植物的PCR分析。使用引物P3和P4扩增具有期望尺寸(2.4kb，泳道T0)的PCR产物。图11A-11B：玉米植物中ARGOS8基因的天然启动子的缺失。(A)启动子缺失的示意图。两个向导RNA和Cas9内切核酸酶系统(被称为gRNA3/gRNA2/Cas9系统)用于靶向Zm-ARGOS8中的CTS3和CTS2位点。P1和P4指示用于缺失事件筛选的PCR引物。(B)PCR筛选PMI-抗性愈伤组织以鉴定缺失事件。示出15个代表性愈伤组织的PCR结果。1.1-kpPCR产物指示CTS3/CTS2片段的缺失。图12：使用向导RNA/Cas9靶序列使增强子元件缺失的示意图。待缺失的增强子可为但不限于35S增强子元件。序列SEQIDNO：1是酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。SEQIDNO：2是马铃薯ST-LS1内含子的核苷酸序列。SEQIDNO：3是SV40氨基N-末端的氨基酸序列。SEQIDNO：4是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)二分VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。SEQIDNO：5是表达玉米优化的Cas9的表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：6是在可变靶向结构域中包含LIGCas-3靶序列的crRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：7是tracrRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：8是在可变靶向结构域中包含LIGCas-3靶序列的长向导RNA的核苷酸序列。SEQIDNO：9是染色体8玉米U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。SEQIDNO：10列出玉米U6聚合酶III终止子的核苷酸序列的两个拷贝。SEQIDNO：11是包含LIGCas-3可变靶向结构域的玉米优化的短向导RNA的核苷酸序列。SEQIDNO：12是包含LIGCas-3可变靶向结构域的玉米优化的长向导RNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：13是玉米基因组靶位点MS26Cas-1加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：14是玉米基因组靶位点MS26Cas-2加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：15是玉米基因组靶位点MS26Cas-3加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：16是玉米基因组靶位点LIGCas-2加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：17是玉米基因组靶位点LIGCas-3加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：18是玉米基因组靶位点LIGCas-4加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：19是玉米基因组靶位点MS45Cas-1加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：20是玉米基因组靶位点MS45Cas-2加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：21是玉米基因组靶位点MS45Cas-3加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：22是玉米基因组靶位点ALSCas-1加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：23是玉米基因组靶位点ALSCas-2加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：24是玉米基因组靶位点ALSCas-3加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：25是玉米基因组靶位点EPSPSCas-1加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：26是玉米基因组靶位点EPSPSCas-2加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：27是玉米基因组靶位点EPSPSCas-3加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：28-52是初次PCR的靶位点特异性正向引物的核苷酸序列。SEQIDNO：53是第二次PCR的正向引物的核苷酸序列。SEQIDNO：54是第二次PCR的反向引物的核苷酸序列。SEQIDNO：55是LIGCas-1和LIGCas-2基因座的未经修饰的参考序列的核苷酸序列。SEQIDNO：56-65是LIGCas-1的突变1-10的核苷酸序列。SEQIDNO：66-75是LIGCas-2的突变1-10的核苷酸序列。SEQIDNO：76是LIGCas-3和LIG3-4归巢内切核酸酶基因座的未经修饰的参考序列的核苷酸序列。SEQIDNO：77-86是LIGCas-3的突变1-10的核苷酸序列。SEQIDNO：88-96是LIG3-4归巢内切核酸酶基因座的突变1-10的核苷酸序列。SEQIDNO：97是被称为HR修复DNA的供体载体的核苷酸序列。SEQIDNO：98是用于接头1处位点特异性转基因插入的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：99是用于接头1处位点特异性转基因插入的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：100是用于接头2处位点特异性转基因插入的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：101是用于接头2处位点特异性转基因插入的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：102是连接的Cas9内切核酸酶和LIGCas-3长向导RNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：103是玉米基因组靶位点55CasRNA-1加PAM序列的核苷酸序列。SEQIDNO：104是55CasRNA-1基因座的未经修饰的参考序列的核苷酸序列。SEQIDNO：105-110是55CasRNA-1的突变1-6的核苷酸序列。SEQIDNO：111是LIG3-4归巢内切核酸酶靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：112是LIG3-4归巢内切核酸酶编码序列的核苷酸序列。SEQIDNO：113是MS26++归巢内切核酸酶靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：114是MS26++归巢内切核酸酶编码序列的核苷酸序列。SEQIDNO：115是大豆密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列。SEQIDNO：116是大豆组成型启动子GM-EF1A2的核苷酸序列。SEQIDNO：117是连接子SV40NLS的核苷酸序列。SEQIDNO：118是具有SV40NLS的大豆优化的Cas9的氨基酸序列。SEQIDNO：119是载体QC782的核苷酸序列。SEQIDNO：120是本文所述的大豆U6聚合酶III启动子即GM-U6-13.1PRO的核苷酸序列。SEQIDNO：121是向导RNA的核苷酸序列。SEQIDNO：122是载体QC783的核苷酸序列。SEQIDNO：123是载体QC815的核苷酸序列。SEQIDNO：124是酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9内切核酸酶(cas9-2)的核苷酸序列。SEQIDNO：125是DD20CR1大豆靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：126是DD20CR2大豆靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：127是DD43CR1大豆靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：128是DD43CR2大豆靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：129是DD20序列的核苷酸序列。SEQIDNO：130是互补DD20序列的核苷酸序列。SEQIDNO：131是DD43序列的核苷酸序列。SEQIDNO：132是DD43互补序列的核苷酸序列。SEQIDNO：133-141是引物序列。SEQIDNO：142是DD20CR1PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：143是DD20CR2PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：144是DD43CR1PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：145是DD43CR2PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：146是DD43CR2PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：147-156是DD20CR1靶位点的突变1至10的核苷酸序列。SEQIDNO：157-166是DD20CR2靶位点的突变1至10的核苷酸序列。SEQIDNO：167-176是DD43CR1靶位点的突变1至10的核苷酸序列。SEQIDNO：177-191是DD43CR2靶位点的突变1至10的核苷酸序列。SEQIDNO：192是玉米优化型式的Cas9蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO：193是SEQIDNO：192的玉米优化型式的Cas9基因的核苷酸序列。SEQIDNO：194是DNA型式的向导RNA(EPSPSsgRNA)。SEQIDNO：195是EPSPS多核苷酸修饰模板。SEQIDNO：196是包含TIPS核苷酸修饰的核苷酸片段。SEQIDNO：197-204是引物序列。SEQIDNO：205-208是图14所示的核苷酸片段。SEQIDNO：209是图17所示的TIPS编辑的EPSPS核苷酸序列片段的示例。SEQIDNO：210是图17所示的野生型EPSPS核苷酸序列片段的示例。SEQIDNO：211是玉米烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(epsps)基因座的核苷酸序列。SEQIDNO：212是嗜热链球菌(S.thermophiles)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571758.1)的核苷酸序列。SEQIDNO：213是嗜热链球菌(S.thermophiles)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571770.1)的核苷酸序列。SEQIDNO：214是无乳链球菌(S.agalactiae)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571785.1)的核苷酸序列。SEQIDNO：215是无乳链球菌(S.agalactiae)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571790.1)的核苷酸序列。SEQIDNO：216是变异链球菌(S.mutant)的Cas9内切核酸酶(genbankCS571790.1)的核苷酸序列。SEQIDNO：217-228是实施例17所述的引物和探针核苷酸序列。SEQIDNO：229是MHP14Cas1靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：230是MHP14Cas3靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：231是TS8Cas1靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：232是TS8Cas2靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：233是TS9Cas2靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：234是TS9Cas3靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：235是TS10Cas1靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：236是TS10Cas3靶位点的核苷酸序列。SEQIDNO：237-244是图19A-D所示的核苷酸序列。SEQIDNO：245-252是实施例18所述的向导RNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：253-260是实施例18所述的供体DNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：261-270是实施例18所述的引物的核苷酸序列。SEQIDNO：271-294是实施例18所述的引物和探针的核苷酸序列。SEQIDNO：295是本文所述的GM-U6-13.1PRO即大豆U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。SEQIDNO：298、300、301和303是连接的向导RNA/Cas9表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：299和302是供体DNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：271-294是实施例18所述的引物和探针的核苷酸序列。SEQIDNO：304是DD20qPCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：305是DD43qPCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：306-328是本文所述的引物和探针的核苷酸序列。SEQIDNO：329-334是本文所述的PCR扩增子的核苷酸序列。SEQIDNO：335是包括DD20CR1靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。SEQIDNO：364是包括DD20CR2靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。SEQIDNO：386是包括DD43CR1靶位点的大豆基因组区域的核苷酸序列。SEQIDNO：336-363、365-385和387-414是图26A-C所示的核苷酸序列。SEQIDNO：415-444是图27A-C所示的基于crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶系统而发现的NHEJ突变的核苷酸序列。SEQIDNO：445-447分别是LIGCas-1、LIGCas2和LIGCas3crRNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：448是tracrRNA表达盒的核苷酸序列。SEQIDNO：449是初次PCR的LIGCas-2正向引物的核苷酸序列。SEQIDNO：450是初次PCR的LIGCas-3正向引物的核苷酸序列。SEQIDNO：451是玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGOS8-CTS1的核苷酸序列。SEQIDNO：452是玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGOS8-CTS2的核苷酸序列。SEQIDNO：453是玉米基因组Cas9内切核酸酶靶位点Zm-ARGOS8-CTS3的核苷酸序列。SEQIDNO：454-458分别是引物P1、P2、P3、P4、P5的核苷酸序列。SEQIDNO：459是引物结合位点(PBS)的核苷酸序列，即有利于事件筛选的序列。SEQIDNO：460是Zm-GOS2PRO-GOS2INTRON、玉米GOS2启动子和GOS2内含子1(包含启动子、5′-UTR1、INTRON1和5′-UTR2)的核苷酸序列。SEQIDNO：461是玉米Zm-ARGOS8启动子的核苷酸序列。SEQIDNO：462是玉米Zm-ARGOS85′-UTR的核苷酸序列。SEQIDNO：463是玉米Zm-ARGOS8密码子序列的核苷酸序列。SEQIDNO：464是玉米Zm-GOS2基因(包含启动子、5′-UTR、CDS、3′-UTR和内含子)的核苷酸序列。SEQIDNO：465是玉米Zm-GOS2PRO启动子的核苷酸序列。SEQIDNO：466是玉米GOS2INTRON、玉米GOS25′-UTR1和内含子1和5′-UTR2的核苷酸序列。SEQIDNO：467-468、490-491、503-504分别是大豆基因组Cas内切核酸酶靶序列大豆EPSPS-CR1、大豆EPSPS-CR2、大豆EPSPS-CR4、大豆EPSPS-CR5、大豆EPSPS-CR6、大豆EPSPS-CR7的核苷酸序列。SEQIDNO：469是大豆U6小核RNA启动子GM-U6-13.1的核苷酸序列。SEQIDNO：470、471分别是QC868、QC879质粒的核苷酸序列。SEQIDNO：472、473、492、493、494、505、506、507分别是RTW1013A、RTW1012A、RTW1199、RTW1200、RTW1190A、RTW1201、RTW1202、RTW1192A的核苷酸序列。SEQIDNO：474-488、495-402、508-512是引物和探针的核苷酸序列。SEQIDNO：489是大豆密码子优化的Cas9的核苷酸序列。SEQIDNO：513是35S增强子的核苷酸序列。SEQIDNO：514是163-181处gRNA1的35S-CRTS的核苷酸序列(包括在3′端的pam)。SEQIDNO：515是295-319处gRNA2的35S-CRTS的核苷酸序列(包括在3′端的pam)。SEQIDNO：516是331-350处gRNA3的35S-CRT的核苷酸序列(包括在3′端的pam)。SEQIDNO：517是EPSPS-K90R模板的核苷酸序列。SEQIDNO：518是EPSPS-IME模板的核苷酸序列。SEQIDNO：519是EPSPS-T剪接的模板的核苷酸序列。SEQIDNO：520是ZM-RAP2.7肽的氨基酸序列。SEQIDNO：521是ZM-RAP2.7编码DNA序列的核苷酸序列。SEQIDNO：522是ZM-NPK1B肽的氨基酸序列。SEQIDNO：523是ZM-NPK1B编码DNA序列的核苷酸序列。SEQIDNO：524是RAB17启动子的核苷酸序列。SEQIDNO：525是玉米FTM1的氨基酸序列。SEQIDNO：526是玉米FTM1编码DNA序列的核苷酸序列。SEQIDNO：527-532是核苷酸序列。SEQIDNO：551-553是雄性能育性减少基因的向导RNA靶。SEQIDNO：554玉米雄性能育性所涉及的多肽。具体实施方式下文将参照附图更完整地描述本公开，其中附图示出了本公开的一些但并非全部实施方案。这些不应理解为受限于本文提出的实施方案。同样的编号在全文中是指类似的要素。虽然本文中采用特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用，而并非用于限制目的。I.概述本发明提供了用于植物或植物细胞的基因组中的靶序列的基因组修饰的组合物和方法，以用于选择植物、基因编辑、以及将目的多核苷酸插入到植物基因组中。该方法利用向导RNA/CAS内切核酸酶系统，其中Cas内切核酸酶通过向导RNA来进行导向，以在细胞基因组中的特异性靶位点处识别并任选地引入双链断裂。向导RNA/CAS内切核酸酶系统提供了用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。本发明进一步提供了利用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点以及编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定基因组靶位点，就可利用多种方法进一步修饰靶位点，由此使得其包含多种目的多核苷酸。本发明还公开了利用双组分向导RNA/CAS内切核酸酶系统的育种方法。本发明还提供了用于编辑细胞基因组中核苷酸序列的组合物和方法。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可位于被Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。II.向导RNA/CAS内切核酸酶系统a.CRISPR基因座CRISPR基因座(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)(也称SPIDR——SPacerInterspersedDirectRepeats，间隔子间隔的直接重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重复序列(通常24bp至40bp，重复1至140次，也称CRISPR重复序列)组成，该DNA重复序列是部分回文的。重复的序列(通常是物种特异性的)被恒定长度的可变序列(通常20bp至58bp，取决于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))间隔。CRISPR基因座首先在大肠杆菌(E.coli)中识别(Ishino等人，(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人，(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。在地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、鱼腥藻属(Anabaena)和肺结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中已鉴定出类似的间隔短序列重复序列(Groenen等人，(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人，(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人，(1996)Biochim.Biophys.Acta1307：26-30；Mojica等人，(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座与其它SSR不同之处在于重复序列的结构，该重复序列也被命名为短规则间隔重复序列(shortregularlyspacedrepeats，SRSR)(Janssen等人，(2002)OMICSJ.Integ.Biol.6：23-33；Mojica等人，(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。该重复序列是成簇出现的短元件，其通常被恒定长度的可变序列规则地间隔(Mojica等人，(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。b.Cas基因，Cas内切核酸酶如本文所用，术语“Cas基因”是指这样的基因，其通常与侧翼CRISPR基因座偶联、相关或接近或在侧翼CRISPR基因座的附近。术语“Cas基因”、“CRISPR相关(Cas)基因”在本文中可互换使用。Cas蛋白质家族的全面综述示于Haft等人，(2005)ComputationalBiology，PLoSComputBiol1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中。如该文献中所描述，除了四个之前已知的基因家族外，还描述了41个CRISPR相关(Cas)基因家族。该文献表明，CRISPR系统属于不同的类别，具有不同的重复序列模式、不同组的基因以及不同物种范围。给定的CRISPR基因座中的Cas基因的数目可随物种而不同。如本文所用，术语“Cas内切核酸酶”是指由Cas基因编码的Cas蛋白质，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入DNA靶序列中。Cas内切核酸酶通过向导多核苷酸来进行导向，以识别并任选地将双链断裂引入细胞基因组中的特异性靶位点处。如本文所用，术语“向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”是指能够将双链断裂引入DNA靶序列中的Cas内切核酸酶与向导多核苷酸的复合物。在通过向导RNA识别靶序列时，Cas内切核酸酶使靠近基因组靶位点的DNA双链体解旋并将两条DNA链裂解，但唯一条件是正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定向在靶序列的3′端(图2A，图2B)。在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为Cas9内切核酸酶，诸如但不限于2007年3月1日公布的WO2007/025097的SEQIDNO：462、474、489、494、499、505和518中列出的Cas9基因，该专利以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为植物、玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶(图1A)。在另一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域的SV40核靶向信号上游和Cas密码子区域的二分VirD2核定位信号(Tinland等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7442-6)下游。在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因为SEQIDNO：1、124、212、213、214、215、216、193的Cas9内切核酸酶基因或SEQIDNO：5的核苷酸2037-6329，或其任何功能性片段或变体。术语“功能性片段”、“功能上等同的片段”和“功能等同片段”在本文中可互换使用。这些术语是指本发明的Cas内切核酸酶序列的一部分或亚序列，其中产生双链断裂的能力被保留。术语“功能性变体”、“功能上等同的变体”和“功能等同变体”在本文中可互换使用。这些术语是指本发明的Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。片段或变体经由诸如定点诱变和合成构建的方法获得。在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因是植物密码子优化的酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)Cas9基因，该基因能识别原则上可被靶向的形式N(12-30)NGG的任何基因组序列。在一个实施方案中，Cas内切核酸酶基因通过本领域已知的任何方法被直接引入细胞中，例如但不限于瞬时引入方法、转染和/或局部施用。内切核酸酶是裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特异性位点处裂解DNA而不损伤碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型内切核酸酶，它们进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶活性和限制性酶活性两者都包含在单一复合物中。内切核酸酶还包括在特异性识别位点处结合并切割的大范围核酸酶(也称之为归巢内切核酸酶(HEases)，类似于限制性内切核酸酶)，然而，对于大范围核酸酶的识别位点通常更长，约18bp或更多(于2012年3月22日提交的专利申请WO-PCTPCT/US12/30061)。大范围核酸酶基于保守的序列基序分成四个家族，该家族为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HEases的显著之处在于它们的识别位点长，并且能容忍它们的DNA底物中有一定的序列多态性。大范围核酸酶的命名规范与其它限制性内切核酸酶的规范相似。对于分别由独立式ORF(free-standingORF)、内含子和内含肽编码的大范围核酸酶，它们也通过前缀F-、I-或者PI-进行表征。重组过程中的一个步骤涉及在识别位点之处或者附近进行多核苷酸裂解。该裂解活性可用于产生双链断裂。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见Sauer，(1994)CurrOpBiotechnol(《生物技术当前述评》)，5：521-7；以及Sadowski，(1993)FASEB(美国实验生物学学会联合会)，7：760-7。在一些示例中，重组酶来自整合酶或者解离酶家族。TAL效应子核酸酶是新一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或者其它生物体的基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。TAL效应子核酸酶是通过将天然或者经工程改造的转录激活因子样(TAL)效应子或其功能部分与内切核酸酶的催化结构域(诸如例如FokI)融合来产生。独特的模块式TAL效应子DNA结合结构域使得可以设计具有潜在地任何给定的DNA识别特异性的蛋白质(Miller等人，(2011)NatureBiotechnology29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是经工程改造的双链断裂诱导剂，由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域构成。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包含两个、三个或者四个例如具有C2H2结构的锌指，但是其它锌指结构也是已知的并被工程改造。锌指结构域易于设计特异性结合选定的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN由经工程改造的DNA结合锌指结构域与非特异性内切核酸酶结构域连接组成，所述非特异性内切核酸酶结构域例如来自IIs型内切核酸酶(诸如FokI)的核酸酶结构域。可将另外的功能性融合到锌指结合结构域，包括转录激活因子结构域、转录阻遏蛋白结构域和甲基化酶。在一些示例中，核酸酶结构域的二聚反应为裂解活性所需。每个锌指识别靶DNA中的三个连续碱基对。例如，一个3锌指结构域识别9个连续的核苷酸的序列，由于该核酸酶要求二聚反应，使用两组锌指三联体来结合一条18个核苷酸的识别序列。c.向导RNA/CAS内切核酸酶系统细菌和古生菌已经进化出利用短RNA直接降解外源核酸的适应性免疫防御，称为规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-相关的(Cas)系统(PrashantMali等人)。来自于细菌的II型CRISPR/Cas系统利用crRNA和tracrRNA将Cas内切核酸酶导向至其DNA靶标。crRNA(CRISPRRNA)包含与双链DNA靶标的一条链互补的区域和与tracrRNA(反式激活CRISPRRNA)形成引导Cas内切核酸酶裂解DNA靶标的RNA双链体的碱基对(图2B)。如本文所用，术语“向导RNA”是指crRNA(CRISPRRNA)(其包含可变靶向结构域)和tracrRNA这两种RNA分子的合成融合体(图2B)。在一个实施方案中，向导RNA包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。如本文所用，术语“向导多核苷酸”是指可与Cas内切核酸酶形成复合物并使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地裂解DNA靶位点的多核苷酸序列。向导多核苷酸可由单分子或双分子组成。向导多核苷酸序列可为RNA序列、DNA序列、或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，向导多核苷酸可包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，诸如但不限于锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6--二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、连接于胆固醇分子、连接于聚乙二醇分子、连接于间隔子18(六亚乙基二醇链)分子、或导致环化的5’至3’共价连接。仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也被称为“向导RNA”。向导多核苷酸可为双分子(也称为双链体向导多核苷酸)，包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子向导多核苷酸的CER结构域包含沿互补区杂交的两个单独分子。两个单独分子可为RNA、DNA、和/或RNA-DNA组合序列。在一些实施方案中，包含与CER结构域连接的VT结构域的双链体向导多核苷酸的第一分子被称为“crDNA”(当由连续伸展的DNA核苷酸组成时)或“crRNA”(当由连续伸展的RNA核苷酸组成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合组成时)。cr核苷酸可包括细菌和古生菌中天然存在的cRNA片段。在一个实施方案中，存在于本文所公开的cr核苷酸中的细菌和古生菌中天然存在的cRNA的片段尺寸的范围可为但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，包括CER结构域的双链体向导多核苷酸的第二分子被称为“tracrRNA”(当由连续伸展的RNA核苷酸组成时)或“tracrDNA”(当由连续伸展的DNA核苷酸组成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合组成时)。在一个实施方案中，对RNA/Cas9内切核酸酶复合物进行导向的RNA为包含双链体crRNA-tracrRNA的双链RNA。向导多核苷酸还可为单分子，包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。所谓“结构域”是指可为RNA、DNA、和/或RNA-DNA组合序列的连续伸展的核苷酸。单向导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可包含RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA-组合序列。在一些实施方案中，单向导多核苷酸包含连接至tracr核苷酸(包括CER结构域)的cr核苷酸(包括与CER结构域连接的VT结构域)，其中所述连接是包含RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由得自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列组成的单向导多核苷酸可被称为“单向导RNA”(当由连续伸展的RNA核苷酸组成时)或“单向导DNA”(当由连续伸展的DNA核苷酸组成时)，或“单向导RNA-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合组成时)。在本公开的一个实施方案中，单向导RNA包含可与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的cRNA或cRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述向导RNA/CAS内切核酸酶复合物可将Cas内切核酸酶引导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点中。术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用并且是指与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列(图2A和2B)第一核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶向结构域的长度可为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，可变靶向结构域包含连续伸展的12至30个核苷酸。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、经修饰的DNA序列、经修饰的RNA序列、或它们的任何组合组成。术语向导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用并且是指与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如向导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可由DNA序列、RNA序列、经修饰的DNA序列、经修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)、或它们的任何组合组成。连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包括RNA序列、DNA序列、或RNA-DNA组合序列。在一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的长度可为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施方案中，连接单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包括四核苷酸环序列，诸如但不限于GAAA四核苷酸环序列。向导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可选自但不限于5′帽、3′聚腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列序列、形成dsRNA双链体的序列、使向导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、为蛋白质提供结合位点的修饰或序列、锁定核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸；2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、连接于胆固醇分子、连接于聚乙二醇分子、连接于间隔子18分子、5’至3’共价连接、或它们的任何组合。这些修饰可导致至少一种附加有益特征，其中该附加有益特征选自：改进或受调控的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、蛋白质或蛋白复合物的结合位点、改进的与互补靶序列的结合亲和性、改进的对细胞降解的抗性、以及增大的细胞渗透性。在一个实施方案中，向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在DNA靶位点处引入双链断裂的复合物。在本发明的一个实施方案中，可变靶向结构域的长度可为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在本公开的一个实施方案中，向导RNA包含可与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的cRNA(或cRNA片段)和tracrRNA(或tracfRNA片段)，其中所述向导RNA/CAS内切核酸酶复合物能将Cas内切核酸酶引导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点中。在一个实施方案中，可使用本领域已知的任何方法诸如但不限于粒子轰击或局部施用将向导RNA直接引入植物或植物细胞中。在另一个实施方案中，向导RNA可通过引入重组DNA分子而被间接引入，该重组DNA分子包含能够使向导RNA转录入所述植物细胞的可操作地连接至植物特异性启动子(如图1B所示)的对应的向导DNA序列。术语“对应的向导DNA”是指与RNA分子相同但用“T”置换RNA分子中每个“U”的DNA分子。在一些实施方案中，向导RNA经由粒子轰击或重组DNA构建体的农杆菌属转化引入，该重组DNA构建体包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的对应的向导DNA。在一个实施方案中，对RNA/Cas9内切核酸酶复合物进行导向的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链RNA(如图2B所示)。相对于双链crRNA-tracrRNA，使用向导RNA的一个优点在于仅需要制成一个表达盒来表达融合的向导RNA。III.Cas内切核酸酶的靶位点术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶基因座”可在本文互换使用，并且是指植物细胞基因组(包括叶绿体和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在其中通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可为植物基因组的内源性位点，或另选地，靶位点可与植物异源并因而未天然存在于基因组中，或者相比于其天然存在的地方，靶位点可见于异源基因组位置。如本文所用，术语“内源性的靶序列”和“天然靶序列”可在本文互换使用以指这样的靶序列：对于植物基因组是内源性的或天然的并且位于植物基因组中该靶序列的内源性的或天然的位置。在一个实施方案中，靶位点可类似于被双链断裂诱导剂诸如LIG3-4内切核酸酶(公布于2009年5月21日的US专利公布2009-0133152A1)或MS26++大范围核酸酶(提交于2012年6月19日的美国专利申请13/526912)特异性识别并且/或者结合的DNA识别位点或靶位点。“人工靶位点”或“人工靶序列”可在本文互换使用并指已被引入植物基因组中的靶序列。这种人工靶序列可在序列上与植物基因组中的内源性的或者天然的靶序列相同，但可位于植物基因组中的另一不同位置(即非内源的或者非天然的位置)。“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”可在本文互换使用，并且是指相比于未改变的靶序列包含至少一种改变的如本文所公开的靶序列。此类“改变”包括例如：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或者(iv)(i)-(iii)的任何组合。本文公开了用于修饰植物基因组靶位点的方法。在一个实施方案中，用于修饰植物细胞基因组中靶位点的方法包括将具有Cas内切核酸酶的向导RNA引入植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。本发明还提供了用于修饰植物细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括将向导RNA和Cas内切核酸酶引入所述植物中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。本发明还提供了用于修饰植物细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括将具有Cas内切核酸酶的向导RNA和供体DNA引入植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。本发明还提供了用于修饰植物细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括：a)将包括可变靶向结构域的向导RNA和Cas内切核酸酶引入植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及，b)鉴定出至少一种在所述靶标处具有修饰的植物细胞，其中修饰包括一个或多个核苷酸在所述靶位点处的至少一个缺失或置换。本发明还提供了用于修饰植物细胞基因组中的靶DNA序列的方法，所述方法包括：a)将能够表达向导RNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入植物细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及，b)鉴定出至少一种在所述靶标处具有修饰的植物细胞，其中修饰包括一个或多个核苷酸在所述靶位点处的至少一个缺失或置换。靶位点的长度可以是变化的，并且包括例如长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸的靶位点。还可能的是靶位点可为回文的，即一条链上的序列在互补链上从相反方向读起来是一样的。切口/裂解位点可位于靶序列之内，或者切口/裂解位点可在靶序列之外。在另一个变型形式中，裂解可发生在互相正对着的核苷酸位置处以产生平端切口，或者在其它情况中，切口可交错以产生单链突出端，也称“粘性末端”，可以为5′突出端或者3′突出端。还可使用基因组靶位点的活性变体。此类活性变体可与给定的靶位点具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中该活性变体保留生物活性并因而能够被Cas内切核酸酶识别并裂解。通过内切核酸酶测量靶位点的双链断裂的测定法在本领域中是已知的，一般是测量该试剂对含有识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。IV.用于将目的多核苷酸整合到被向导RNA/Cas系统识别的植物基因组靶位点中的方法就Cas内切核酸酶而言，可采用各种方法和组合物来获得具有插入在靶位点中的目的多核苷酸的植物。此类方法可采用同源重组来在靶位点处提供目的多核苷酸的整合。在所提供的一种方法中，将供体DNA构建体中的目的多核苷酸提供给植物细胞。如本文所用，“供体DNA”是包括待插入到cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸的DNA构建体。供体DNA构建体进一步包括侧接目的多核苷酸的第一同源性区域和第二同源性区域。供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域分别与存在于植物基因组的靶位点中或侧接植物基因组的靶位点的第一基因组区域和第二基因组区域共享同源性。所谓“同源性”是指类似的DNA序列。例如，在供体DNA上所见的“与基因组区域同源的区域”是与给定的植物基因组中的“基因组区域”具有类似序列的DNA区域。同源性区域可为足以促进经裂解的靶位点处同源重组的任何长度。例如，同源性区域的长度可为至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100个或更多个碱基，由此使得同源性区域的同源性足以与对应的基因组区域发生同源重组。充分的同源性表明两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。如本文所用，“基因组区域”是存在于靶位点的任一侧的植物细胞基因组中的染色体链段，或者另选地还包含靶位点的一部分。基因组区域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100个或更多个碱基，由此使得基因组区域的同源性足以与对应的同源性区域发生同源重组。目的多核苷酸和/或性状可在复合性状基因座中堆积在一起，如在US-2013-0263324-A1(公布于2013年10月3日)和PCT/US13/22891(公布于2013年1月24日)中所描述，这两个申请均据此以引用方式并入。本文所述的向导多核苷酸/Cas9内切核酸酶系统提供产生双链断裂并允许性状在复合性状基因座中堆积的有效系统。在一个实施方案中，通过为植物细胞提供一种或多种向导多核苷酸、一种Cas内切核酸酶、以及任选的一种或多种供体DNA，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统用于将一个或多个目的多核苷酸或一个或多个目的性状引入到一个或多个靶位点中。能育植物可由植物细胞产生，其在所述一个或多个靶位点处包括一个改变，其中所述改变选自：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。可将包括这些改变的靶位点的植物与在相同的复合性状基因座中包含至少一个目的基因或性状的植物杂交，由此进一步使性状堆积于所述复合性状基因座中。(另参见US-2013-0263324-A1，公布于2013年10月3日，和PCT/US13/22891，公布于2013年1月24日)。在一个实施方案中，所述方法包括一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列的复合性状基因座的方法，所述方法包括：(a)选择植物中的基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；(b)使至少一种植物细胞与至少第一向导多核苷酸、第二多核苷酸、和任选的至少一种供体DNA、以及Cas内切核酸酶接触，其中所述第一向导多核苷酸和第二向导多核苷酸和Cas内切核酸酶可形成允许Cas内切核酸酶在至少第一靶序列和第二靶序列处引入双链断裂的复合物；(c)鉴定出来自(b)的在第一靶序列处包含第一改变并在第二靶序列处包含第二改变的细胞；以及(d)从(c)的细胞再生出第一能育植物，所述能育植物包含第一改变和第二改变，其中所述第一改变和第二改变物理连接在一起。在一个实施方案中，所述方法包括一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个改变的靶序列的复合性状基因座的方法，所述方法包括：(a)选择植物中的基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；(b)使至少一种植物细胞与第一向导多核苷酸、Cas内切核酸酶接触、以及任选的第一供体DNA接触，其中所述第一向导多核苷酸和Cas内切核酸酶可形成允许Cas内切核酸酶在第一靶序列处引入双链断裂的复合物；(c)鉴定出来自(b)的在第一靶序列处包含第一改变的细胞；(d)从(c)的细胞再生出第一能育植物，所述第一能育植物包含所述第一改变；(e)使至少一种植物细胞与第二向导多核苷酸、Cas内切核酸酶以及任选的第二供体DNA接触；(f)鉴定出来自(e)的在第二靶序列处包含第二改变的细胞；(g)从(f)的细胞再生出第二能育植物，所述第二能育植物包含第二改变；以及，(h)从(g)的第二能育植物获得能育子代植物，所述能育子代植物包含第一改变和第二改变，其中所述第一改变和第二改变物理连接在一起。给定基因组区域与在供体DNA上所见的对应同源性区域之间的结构类似性可为允许发生同源重组的任何序列同一性程度。例如，供体DNA的“同源性区域”与植物基因组的“基因组区域”所共享的同源性或序列同一性的量可为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列序列同一性，由此使得序列发生同源重组。供体DNA上的同源性区域可与侧接靶位点的任何序列具有同源性。而在一些实施方案中，同源性区域与直接侧接靶位点的基因组序列共享显著的序列同源性，已经认识到，同源性区域可被设计成与可进一步5′或3′接于靶位点的区域具有足够的同源性。在另一些实施方案中，同源性区域还可与靶位点的片段以及下游基因组区域具有同源性。在一个实施方案中，第一同源性区域还包含靶位点的第一片段并且第二同源性区域包含靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段是相异的。如本文所用，“同源重组”是指在同源性位点处两个DNA分子之间的DNA片段交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体在同源重组的量以及同源重组与非同源重组的相对比例方面不同。一般地讲，同源性区域的长度影响同源重组事件的频率，同源性区域越长，频率越高。为观察到同源重组而需要的同源性区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情况下就已观察到同源重组。参见例如Singer等人，(1982)Cell31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics(《遗传学》)，112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4768-72，Sugawara和Haber，(1992)MolCellBiol12：563-75，Rubnitz和Subramani，(1984)MolCellBiol4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics(《遗传学》)，115：161-7。同源性指导的修复(HDR)是在细胞内修复双链和单链DNA断裂的机制。同源性指导的修复包括同源重组(HR)和单链退火(SSA)(Lieber.2010Annu.Rev.Biochem.79：181-211)。最常见的HDR形式称为同源重组(HR)，其在供体和受体DNA之间具有最长的序列同源性要求。其它HDR形式包括单链退火(SSA)和断裂诱导的复制，并且这些相对于HR需要更短的序列同源性。在单链断裂处，在切口处的同源性指导的修复(单链断裂)可经由不同于在双链断裂处的HDR的机制发生(Davis和Maizels.PNAS(0027-8424)，111(10)，第E924-E932页。植物细胞的基因组改变，例如通过同源重组(HR)改变，是遗传工程的强大工具。尽管高等植物中的同源重组频率低，但还是存在植物内源性基因同源重组的少数成功示例。植物中同源重组的参数已主要通过拯救(rescue)所引入的截短的选择性标记基因进行了研究。在这些实验中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之间。观察到的同源重组频率为大约10-4至10-5。参见例如Halfter等人，(1992)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，231：186-93；Offringa等人，(1990)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，9：3077-84；Offringa等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)PlantJ7：109-19。同源重组在昆虫中已得到证明。Dray和Gloor在果蝇中发现，少至3kb的总模板：靶标同源性就足够以适当的效率将大的非同源DNA链段复制到靶标中(Dray和Gloor，(1997)Genetics(《遗传学》)，147：689-99)。Golic等人使用在果蝇中的靶标FRT处进行FLP介导的DNA整合，证实了当供体和靶标共享4.1kb的同源性时，与1.1kb的同源性时相比，整合效率大约高10倍(Golic等人，(1997)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，25：3665)。来自果蝇的数据表明，2-4kb的同源性对于有效靶向是充足的，但是存在一些证据证明低得多的同源性——约30bp至约100bp——可能就足够(Nassif和Engels，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)MolCellBiol(《分子细胞生物学》)，17：627-34)。也在其它生物体中实现了同源重组。例如，在寄生性原生动物利什曼原虫属中进行同源重组需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，用少至50bp侧翼同源性实现了基因替换(Chaveroche等人，(2000)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)中也证明了靶向基因替换(Gaertig等人，(1994)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，22：5391-8)。在哺乳动物中，使用可培养生长、转化、选择和引入到小鼠胚胎中的多能胚胎干细胞系(ES)，同源重组在小鼠中已经是最成功的。带有插入的转基因ES细胞的胚胎发育成遗传上的后代。通过将同胞小鼠进行杂种繁殖，可获得携带选定的基因的纯合小鼠。这个方法的综述在以下文献中提供：Watson等人，(1992)RecombinantDNA(《重组DNA》)，第2版(ScientificAmericanBooks，由WHFreeman&Co.发售)；Capecchi，(1989)TrendsGenet(《遗传学趋势》)，5：70-6；以及Bronson，(1994)JBiolChem(《生物化学杂志》)，269：27155-8。由于缺乏能够移植到卵母细胞或者发育的胚胎中的干细胞，在小鼠以外的哺乳动物中的同源重组曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature(《自然》)，405：1066-9(2000)报道了通过在原代胚胎成纤维细胞中进行转化和选择在绵羊中成功进行了同源重组。易错DNA修复机制可在双链断裂位点处产生突变。非同源端连接(NHEJ)途径是将断裂的末端连接在一起的最普通的修复机制(Bleuyard等人，(2006)DNARepair(《DNA修复》)，5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但是缺失、插入或者其它重排是可能发生的。一个双链断裂的两个末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，19：5562-6)，但是，如果出现两个不同的双链断裂，则来自不同断裂的游离末端可连接并导致染色体缺失(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell(《植物细胞》)，14：1121-31)，或两个不同染色体之间的染色体易位(Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。也可将游离基因的DNA分子连接到双链断裂中，例如将T-DNA整合到染色体双链断裂中(Chilton和Que，(2003)PlantPhysiol(《植物生理学》)，133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，17：6086-95)。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被涉及双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，则基因转换途径可恢复原始结构，如果同源序列可用的话，诸如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)PlantCell(《植物细胞》)，16：342-52)。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics(《遗传学》)，152：1173-81)。一旦双链断裂在DNA中被诱导，细胞的DNA修复机制就被激活以修复断裂。易错DNA修复机制可在双链断裂位点处产生突变。将断裂末端结合在一起的最常见修复机制是非同源端连接(NHEJ)途径(Bleuyard等人，(2006)DNARepair5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但是缺失、插入或者其它重排是可能发生的(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。另选地，双链断裂可通过同源DNA序列之间的同源重组修复。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被涉及双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，则基因转换途径可恢复原始结构，如果同源序列可用的话，诸如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)PlantCell(《植物细胞》)，16：342-52)。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics(《遗传学》)，152：1173-81)。DNA双链断裂似乎是刺激同源重组途径的有效因素(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，28：281-92；Tzfira和White，(2005)TrendsBiotechnol(《生物技术趋势》)，23：567-9；Puchta，(2005)JExpBot(《实验植物学杂志》)，56：1-14)。使用DNA断裂剂，在植物中人工构建的同源DNA重复序列之间观察到同源重组增加两倍至九倍(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，28：281-92)。在玉米原生质体中，用线状DNA分子进行实验证明了质粒之间的同源重组增强(Lyznik等人，(1991)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，230：209-18)。在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括使植物细胞与供体DNA和内切核酸酶接触。一旦双链断裂通过内切核酸酶引入在靶位点中，供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域就可与其对应的基因组同源性区域发生同源重组，导致供体与基因组之间发生DNA交换。因此，所提供的方法导致：目的供体DNA的多核苷酸整合到植物基因组的靶位点中的双链断裂中，由此改变初始靶位点并产生改变的基因组靶位点。可通过任何本领域已知的手段引入供体DNA。例如，提供了具有靶位点的植物。供体DNA可由本领域中已知的任何转化方法，包括例如农杆菌属介导的转化或基因枪粒子轰击来提供。供体DNA可瞬时存在于细胞中，或者其可经由病毒复制子而被引入。在Cas内切核酸酶和靶位点存在下，使供体DNA插入到经转化的植物基因组中。锌指核酸酶是具有改变的特异性的经工程改造的内切核酸酶，例如通过将经工程改造的DNA结合结构域与内切核酸酶融合，例如FokI(Durai等人，(2005)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，33：5978-90；Mani等人，(2005)BiochemBiophysResComm(《生物化学和生物物理研究通讯》)，335：447-57)。Wright等人和Lloyd等人报道了使用锌指核酸酶在整合到烟草属植物或者拟南芥属染色体DNA中的DNA靶位点处的高频率诱变(Wright等人，(2005)PlantJ(《植物杂志》)，44：693-705；Lloyd等人，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：2232-7)。使用设计的识别烟草属植物内源性乙酰乳酸合酶(ALS)基因座的锌指核酸酶，引入了已知能赋予针对咪唑啉酮和磺脲除草剂的抗性的突变ALS基因以替换内源性ALS基因，替换频率为超过2％的转化细胞(Townsend等人，(2009)Nature(《自然》)，459：442-5)。内源性基因的敲除和转基因的表达可通过基因靶向同时实现。使用设计的锌指核酸酶，靶向了编码玉米种子中的植酸生物合成最终步骤中所需的肌醇-1，3，4，5，6-五磷酸2-激酶的IPKl基因，以通过同源重组插入编码草胺膦乙酰转移酶对草铵膦除草剂(诸如双丙氨磷)的耐受性的PAT基因。插入PAT基因来破坏IPK1基因，在发育的种子中同时导致了除草剂耐受性和预期的肌醇磷酸谱(profile)改变(Shukla等人，(2009)Nature(《自然》)，459：437-41)。另一个方法使用对现有的归巢内切核酸酶进行蛋白质工程改造以改变它们的靶标特异性。归巢内切核酸酶诸如I-SceI或I-CreI能结合和裂解相对较长的DNA识别序列(分别为18bp和22bp)。这些序列据预测在基因组中很少天然发生，通常仅1或者2个位点/基因组。可通过对DNA结合结构域处的氨基酸置换进行合理设计和/或对突变的单体进行组合性装配和选择，来改变归巢内切核酸酶的裂解特异性(参见例如Arnould等人，(2006)JMolBiol(《分子生物学杂志》)，355：443-58；Ashworth等人，(2006)Nature(《自然》)，441：656-9；Doyon等人，(2006)JAmChemSoc(《美国化学会志》)，128：2477-84；Rosen等人，(2006)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，34：4791-800；以及Smith等人，(2006)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)，34：e149；Lyznik等人，(2009)美国专利申请公布20090133152A1；Smith等人，(2007)美国专利申请公布20070117128A1)。已证明了经工程改造的大范围核酸酶能裂解同族突变位点而不扩大它们的特异性。将对野生型酵母I-SceI归巢核酸酶具有特异性的人工识别位点引入在玉米基因组中，检测到当转基因I-SceI通过杂交引入并且通过基因切除激活时，在1％的被分析的F1植物中存在识别序列的突变(Yang等人，(2009)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，70：669-79)。更实际的是，使用基于I-CreI大范围核酸酶序列进行设计的经工程改造的单链内切核酸酶靶向玉米无舌叶基因座(ligulelesslocus)。当设计的归巢核酸酶通过农杆菌属介导转化未成熟胚来引入时，在3％的T0转基因植物中检测到选定的无舌叶基因座识别序列的突变(Gao等人，(2010)PlantJ(《植物杂志》)，61：176-87)。目的多核苷酸在本文进行了进一步描述并且反映出作物开发参与者的商业市场和利益。所关注的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如收率和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因将相应变化。V.使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统编辑的基因组如本文所述，向导RNA/CAS内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板结合地使用，以允许编辑目的基因组核苷酸序列。另外，如本文所述，对使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统的每个实施方案而言，可部署类似的向导多核苷酸/CAS内切核酸酶系统，其中向导多核苷酸并不仅仅包含核糖核酸，而且其中向导多核苷酸还包含RNA-DNA分子的组合或仅包含DNA分子。在存在多个双链断裂形成系统的情况下，它们对基因编辑的实际应用可能因诱导的双链断裂(DSB)的频率相对较低而受到限制。迄今为止，许多基因组修饰方法依赖于同源重组系统。同源重组(HR)可提供用于发现目的基因组DNA序列并根据实验规范对其进行修饰的分子学方法。同源重组以较低频率发生于植物体细胞中。该方法可通过在所选内切核酸酶靶位点处引入双链断裂(DSB)而被提高到基因组工程的实践水平。该挑战已经有效地在目的基因组位点处形成DSB，因为在两个相互作用的DNA分子之间存在方向性信息传递偏差(断裂的分子充当遗传学信息的受体)。本文描述了向导RNA/CAS内切核酸酶系统的用途，其提供了灵活的基因组裂解特异性并导致DNA靶位点处高频率的双链断裂，由此允许在目的核苷酸序列中有效的基因编辑，其中待编辑的目的核苷酸序列可位于被Cas内切核酸酶识别并裂解的靶位点之内或之外。术语“多核苷酸修饰模板”是指当与待编辑的核苷酸序列相比时包括至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可为至少一个核苷酸置换、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板可进一步包含侧接至少一个核苷酸修饰的同源核苷酸序列，其中侧翼同源核苷酸序列提供与待编辑的期望核苷酸序列足够的同源性。在一个实施方案中，本公开描述了一种用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括为细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板、以及至少一种Cas内切核酸酶，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞基因组中的靶序列处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。细胞包括但不限于人、动物、细菌、真菌、昆虫和植物细胞以及由本文所述方法产生的植物和种子。待编辑的核苷酸可位于被Cas内切核酸酶识别并裂解的靶位点之内或之外。在一个实施方案中，至少一个核苷酸修饰不是被Cas内切核酸酶识别并裂解的靶位点处的修饰。在另一个实施方案中，在待编辑的至少一个核苷酸与基因组靶位点之间存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000个核苷酸。在另一个实施方案中，本公开描述了一种用于编辑植物细胞基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将向导RNA、多核苷酸修饰模板、以及至少一种玉米优化的Cas9内切核酸酶引入植物细胞中，其中所述玉米优化的Cas9内切核酸酶能够在植物基因组中的moCas9靶序列(SEQIDNO：209的碱基25-44)处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。在另一个实施方案中，本公开描述了一种用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括向细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在靶位点处引入双链断裂的复合物，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。待编辑的核苷酸序列对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的序列。例如，细胞基因组中的核苷酸序列可为被稳定掺入细胞基因组中的转基因。此类转基因的编辑可导致进一步期望的表型或基因型。细胞基因组中的核苷酸序列还可为内源性的或人工来源的突变序列或已有序列，诸如目的内源性基因或突变基因。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行启动子修饰调控元件通常是指涉及调控核酸分子诸如基因或靶基因转录的调控元件。调控元件为核酸并且可包含启动子、增强剂、内含子、5’-非翻译区(5’-UTR，也称之为前导序列)、或3’-UTR、或它们的组合。调控元件可以以“顺式”或“反式”起作用，并且一般来讲其以“顺式”起作用，即，其激活位于相同核酸分子例如染色体(调控元件位于此处)上的基因的表达。由调控元件调控的核酸分子并非必须编码功能性肽或多肽，例如调控元件可调节短干扰RNA或反义RNA的表达。增强子元件为如下任何核酸分子：当功能性地连接到启动子而不考虑其相对位置时使核酸分子的转录增加。因此，“增强子”可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。阻遏物(本文有时也称为沉默子)被定义为在功能性地连接到启动子而不考虑其相对位置时抑制转录的任何核酸分子。“启动子”通常是指能够控制另一个核酸片段转录的核酸片段。启动子通常包括核心启动子(也称为最小启动子)序列。一般来讲，核心启动子包括TATA框和与CAAT框或CCAAT框相关联的富含GC区域。这些元件用于使RNA聚合酶II结合至启动子并有助于聚合酶位于RNA起始位点。一些启动子可能不具有TATA框或CAAT框或CCAAT框，而是可能包含用于转录起始位点的起始子元件。核心启动子是指导转录起始所需的最小序列，并且通常可能不包含增强子或其它UTR。启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成性DNA链段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。“在植物中有启动子功能的”是能够在植物细胞中控制转录而无论其来源是否为植物细胞的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选的启动子”可互换使用以指这样的启动子：主要地但不必排他地在一种组织或器官中表达，但是也可在一种特定细胞中表达。“发育调控的启动子”通常是指其活性由发育事件确定的启动子。“组成型启动子”通常是指在所有或大部分发育阶段，在所有或大部分植物的组织或细胞类型中呈活性的启动子。对于被分类为“组成型”(例如遍在蛋白)的其它启动子，一些绝对表达水平的变化可存在于不同的组织或阶段。术语“组成型启动子”、“独立于组织”在本文中可互换使用。本文所公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的组成型表达以便改变植物表型。“异源核苷酸序列”通常是指不与本公开的植物启动子序列一起天然存在的序列。虽然该核苷酸序列对于启动子序列是异源的，但它对于植物宿主可以是同源的、或天然的、或异源的、或外来的。然而，应认识到，本发明的启动子可以与它们的天然编码序列一起使用以提高或者降低表达，从而导致转化的种子的表型变化。术语“异源核苷酸序列”、“异源序列”、“异源核酸片段”和“异源核酸片段”可在本文中互换使用。本公开涵盖包含本文所公开的启动子序列的功能性片段的重组DNA构建体。“功能性片段”是指本公开的启动子序列的一部分或亚序列，其中引发转录或驱动基因表达的能力(诸如产生某些表型)被保留。片段经由方法诸如定点诱变和合成构建获得。就所提供的本文所述启动子序列而言，功能性片段用于促进可操作地连接的异源核苷酸序列的表达，从而形成重组DNA构建体(也为嵌合基因)。例如，该片段可用于设计重组DNA构建体以在转化的植物中产生所需的表型。通过相对于异源核苷酸序列以适当取向连接启动子片段，重组DNA构建体可被设计成用于共抑制或反义。在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为启动子，其中启动子的编辑包括用不同的启动子(也称之为替换启动子)或启动子片段(也称之为替换启动子片段)替换启动子(也称之为“启动子更换”或“启动子替换”)或启动子片段，其中启动子替换导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：启动子活性增大，启动子组织特异性增大，启动子活性减小，启动子组织特异性减小，新启动子活性，诱导型启动子活性，扩展基因表达的窗口，相同细胞层或其它细胞层中基因表达的时间选择或发育进展的改变(诸如但不限于延长玉米花粉囊的绒毡层中基因表达的时间选择(US5,837,850，公布于1998年11月17日)，DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的启动子(或启动子片段)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的启动子(或启动子片段)。替换启动子(或替换启动子片段)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的启动子(或启动子片段)。在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中启动子的编辑包括用玉米GOS2PRO：GOS2-内含子启动子替换ARGOS8启动子。在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中启动子的编辑包括用大豆遍在蛋白启动子替换天然EPSPS1启动子。在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中启动子的编辑包括用胁迫诱导型玉米RAB17启动子替换内源性玉米NPK1启动子。在一个实施方案中，核苷酸序列可为启动子，其中待编辑的启动子选自玉米-PEPC1启动子(Kausch等人，PlantMolecularBiology，45：1-15，2001)、玉米遍在蛋白启动子(UBI1ZMPRO，Christensen等人，plantMolecularBiology18：675-689，1992)、玉米-Rootmet2启动子(US7,214,855)、稻肌动蛋白启动子(OS-ACTINPRO，US5641876；McElroy等人，ThePlantCell，第2卷，163-171，1990年2月)、高粱RCC3启动子(提交于2012年2月13日的US2012/0210463)、玉米-GOS2启动子(US6,504,083)、玉米-ACO2启动子(提交于2014年3月14日的US申请14/210,711)或玉米-油质蛋白启动子(US8466341B2)。在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列结合地使用以允许启动子或启动子元件插入到目的基因组核苷酸序列中，其中启动子插入(或启动子元件插入)导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：启动子活性增大(启动子强度增大)，启动子组织特异性增大，启动子活性减小，启动子组织特异性减小，新启动子活性，诱导型启动子活性，基因表达的窗口扩展，基因表达的时间选择或发育进展的改变、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待插入的启动子元件可为但不限于启动子核心元件(诸如但不限于CAAT框、CCAAT框、Pribnow框、和/或TATA框)、用于诱导型表达的翻译调控序列和/或阻遏物系统(诸如，TET操纵子阻遏物/操纵子/诱导物元件，或磺酰脲(Su)阻遏物/操纵子/诱导物元件)。脱水应答元件(DRE)首先被鉴定为干旱应答基因rd29A的启动子中的顺式-作用启动子元件，其包含9bp保守的核心序列即TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.，(1994)PlantCell6，251-264)。DRE插入内源性启动子可赋予下游基因的干旱诱导型表达。另一个示例是ABA-应答元件(ABRE)，其包含发现存在于多个ABA和/或胁迫调控的基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(BuskP.K.，PagesM.(1998)PlantMol.Biol.37：425-435)。35S增强剂或MMV增强子插入内源性启动子区域将增加基因表达(US专利5196525)。待插入的启动子(或启动子元件)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的启动子(或启动子元件)。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于插入增强子元件，诸如但不限于在内源性FMT1启动子前面的花椰菜花叶病毒35S增强子以增强FTM1的表达。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于将TET操纵子阻遏物/操纵子/诱导物系统的组分，或磺酰脲(Su)阻遏物/操纵子/诱导物系统的组分插入到植物基因组中，以产生或控制诱导型表达系统。在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统用于使得启动子或启动子元件缺失，其中启动子缺失(或启动子元件缺失)导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：基因座永久性失活，启动子活性增大(启动子强度增大)，启动子组织特异性增大，启动子活性减小，启动子组织特异性减小，新启动子活性，诱导型启动子活性，基因表达的窗口扩展，基因表达的时间选择或发育进展的改变、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的启动子元件可为但不限于启动子核心元件、启动子增强子元件或35S增强子元件(如实施例32中所述)。待缺失的启动子或启动子片段对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使存在于如本文所述的玉米基因组中的ARGOS8启动子缺失。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使如本文所述的存在于植物基因组中的35S增强子元件缺失。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行终止子修饰在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中终止子的编辑包括用不同的终止子(也称之为替换终止子)或终止子片段(也称之为替换终止子片段)来替换终止子(也称之为“终止子更换”或“终止子替换”)或终止子片段，其中所述终止子替换导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：终止子活性增大，终止子组织特异性增大，终止子活性减小，终止子组织特异性减小，DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的终止子(或终止子片段)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的终止子(或终止子片段)。替换终止子(或替换终止子片段)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的终止子(或终止子片段)。在一个实施方案中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中待编辑的终止子选自包括以下终止子的组：来自于玉米Argos8或SRTF18基因的终止子或其它终止子，诸如马铃薯PinII终止子、高粱肌动蛋白终止子(SB-ACTINTERM，WO2013/184537A1，公布于2013年12月)、高粱SB-GKAFTERM(WO2013019461)、稻T28终止子(OS-T28TERM，WO2013/012729A2)、AT-T9TERM(WO2013/012729A2)或GZ-W64ATERM(US7053282)。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列结合地使用以允许终止子或终止子元件插入到目的基因组核苷酸序列中，其中终止子插入(或终止子元件插入)导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：终止子活性增大(终止子强度增大)，终止子组织特异性增大，终止子活性减小，终止子组织特异性减小，DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待插入的终止子(或终止子元件)对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的终止子(或终止子元件)。在另一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使得终止子或终止子元件缺失，其中终止子缺失(或终止子元件缺失)导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：终止子活性增大(终止子强度增大)，终止子组织特异性增大，终止子活性减小，终止子组织特异性减小，DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的终止子或终止子片段对于待编辑的细胞可为内源性的、人工的、已有的、或转基因的。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行调控序列修饰在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞基因组中的调控序列。调控序列为能够增加或减少生物体内特异性基因的表达和/或能够改变生物体内基因的组织特异性表达的核酸分子链段。调控序列的示例包括但不限于3’UTR(非翻译区)区、5’UTR区、转录激活因子、转录增强子、转录阻遏物、翻译阻遏物、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、启动子元件、CAMV35S增强子、MMV增强子元件(提交于2013年3月11日的PCT/US14/23451)、SECIS元件、聚腺苷酸化信号、以及多聚泛素化位点。在一些实施方案中，调控元件的编辑(修饰)或替换导致蛋白质翻译、RNA裂解、RNA剪接、转录终止或翻译后修饰发生改变。在一个实施方案中，可在启动子内鉴定出调控元件，并且这些调控元件也可被编辑或修饰以优化这些调控元件来上调或下调启动子。在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为多聚泛素化位点，其中多聚泛素化位点的修饰导致蛋白质降解的速率改变。遍在蛋白标记的报废蛋白质将通过蛋白酶或自噬而降解。已知蛋白酶抑制剂使得蛋白质超量产生。对编码目的蛋白质的DNA序列作出修饰可导致目的蛋白质的至少一个氨基酸修饰，其中所述修饰允许蛋白质的多聚泛素化(翻译后修饰)，从而导致蛋白质降解改变。在一个实施方案中，待修饰的目的基因组序列为内含子或UTR位点，其中修饰包括将至少一个微小RNA插入所述内含子或UTR位点，其中包括内含子或UTR位点的基因的表达也导致所述微小RNA表达，这继而使微小RNA所靶向的任何基因沉默而不破坏包含所述内含子的天然/转基因的基因表达。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于使得锌指转录因子缺失或突变，其中锌指转录因子的缺失或突变导致或允许形成显性失活的锌指转录因子突变(Li等人，2013，RicezincfingerproteinDSTenhancesgrainproductionthroughcontrollingGn1a/OsCKX2expressionPNAS，110：3167-3172)。单个碱基对下游锌指结构域的插入将导致移框并产生仍可结合至无转录活性的DNA的新蛋白质。突变体蛋白将竞争结合到细胞分裂素氧化酶基因启动子并阻断细胞分裂素氧化酶基因的表达。细胞分裂素氧化酶基因表达的降低将增大细胞分裂素水平并促进稻圆锥花序生长和玉米穗生长，并且在正常和胁迫条件下提高收率。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统修饰剪接位点和/或引入交替剪接位点蛋白质合成利用了从经受成熟过程的前mRNA分子形成的mRNA分子。前mRNA分子被戴帽，剪接并通过添加polyA尾而稳定化。真核细胞发展出产生初始前mRNA分子的交替变体的复杂剪接过程。它们中的一些不可产生用于蛋白质合成的功能性模板。在玉米细胞中，在外显子-内含子连接位点处，剪接过程受剪接位点影响。规范的剪接位点的示例为AGGT。基因编码序列可包含可影响前mRNA成熟过程的总体效率并因此可限制细胞中的蛋白质积聚的多个交替剪接位点。向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸修饰模板结合地使用来编辑目的基因，以在所描述的接头处引入规范剪接位点。在一个实施方案中，待修饰的目的核苷酸序列为玉米EPSPS基因，其中基因的修饰包括除去交替剪接位点，从而导致功能性基因转录物和基因产物(蛋白质)的收率提高。在一个实施方案中，待修饰的目的核苷酸序列为基因，其中基因的修饰包括编辑选择性剪接的基因的内含子边界，以改变剪接变体的积聚。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统修饰或替换编码目的蛋白质的核苷酸序列在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞基因组中的编码序列，其中修饰或替换导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：蛋白质(酶)活性增大、蛋白质功能增加、蛋白质活性减小、蛋白质功能下降、位点特异性突变、蛋白质结构域更换、蛋白质敲除(例如由于引入DNA结合元件和/或DNA结合元件的缺失或添加)、新蛋白质功能、蛋白质功能改变。在一个实施方案中，蛋白质敲除是由于将终止密码子引入目的编码序列中。在一个实施方案中，蛋白质敲除是由于目的编码序列中起始密码子的缺失。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行氨基酸和/或蛋白质融合在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可以或不可与共递送的多核苷酸序列一起使用以使编码第一蛋白质的第一编码序列与编码第二蛋白质的第二编码序列在细胞基因组中融合，其中蛋白质融合导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：蛋白质(酶)活性增大、蛋白质功能增加、蛋白质活性减小、蛋白质功能下降、新蛋白质功能、蛋白质功能改变、新蛋白质定位、蛋白质表达的新时间选择、蛋白质表达模式改变、嵌合蛋白、或具有显性表型功能的修饰的蛋白质。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可以或不可与共递送的多核苷酸序列一起使用以使编码叶绿体定位信号的第一编码序列与编码目的蛋白质的第二编码序列融合，其中蛋白质融合导致目的蛋白质靶向叶绿体。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可以或不可与共递送的多核苷酸序列一起使用以使编码叶绿体定位信号的第一编码序列与编码目的蛋白质的第二编码序列融合，其中蛋白质融合导致目的蛋白质靶向叶绿体。在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可以或不可与共递送的多核苷酸序列一起使用以融合第一编码序列与第二编码序列，其中蛋白质融合导致具有显性表型功能的经修饰的蛋白质。使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统通过在目的基因中表达反向重复序列进行基因沉默在一个实施方案中，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列结合地使用以将反向基因片段插入到生物体基因组的目的基因中，其中反向基因片段的插入可允许反向重复序列(发夹)在体内产生并且可导致所述内源性基因沉默。在一个实施方案中，反向基因片段的插入可导致在基因的天然(或经修饰的)启动子中和/或天然基因的天然5’端中形成体内产生的反向重复序列(发夹)。反向基因片段可进一步包括可导致靶向基因的沉默增强的内含子。用于性状基因座表征的基因组缺失植物育种中的性状定位(Traitmapping)通常导致检测到容纳控制目的性状表达的一个或多个基因的染色体区域。就质量性状而言，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除所鉴定的染色体区域中的候选基因，以确定基因的缺失是否影响性状的表达。就数量性状而言，目的性状的表达由跨越一个或多个染色体的不同效应大小、复杂性、以及统计显著性的多个数量性状基因座(QTL)控制。在对影响复杂性状的QTL区域有负面影响或有害的情况下，向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除由标记辅助的精确定位而界定的整个区域，并且靶向其选择性消除或重排的特异性区域。类似地，可使用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统利用选择性基因组缺失来操纵存在/缺失变异(PAV)或拷贝数变异(CNV)。在一个实施方案中，目的区域可侧接有两个独立的向导多核苷酸/Cas内切核酸酶靶序列。切割同时可进行。缺失事件为无目的区域的两个染色体末端的修复。另选的结果将包括目的区域的倒位、切割位点处的突变和目的区域的复制。VI.用于鉴定在其基因组中在靶位点处包含所整合的目的多核苷酸的至少一种植物细胞的方法本发明还提供了一种用于鉴定在其基因组中在靶位点处包含所整合的目的多核苷酸的至少一种植物细胞的方法。多种方法可用来鉴定那些在靶位点处或者附近具有基因组插入的植物细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、Southem印迹法以及它们的任何组合。参见例如美国专利申请12/147,834，将该专利申请全文以引用的方式并入本文。方法还包括从植物细胞再生出植物，该植物细胞包含整合到其基因组中的目的多核苷酸。植物可为不育或能育的。已经认识到任何目的多核苷酸均可被提供、在靶位点处整合到植物基因组中并在植物中表达。目的多核苷酸反映出作物开发参与者的商业市场和利益。所关注的作物和市场在变化，并且随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如收率和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因将相应变化。目的多核苷酸/多肽包括但不限于除草剂耐受性编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列、或修饰植物性状诸如收率、谷粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、以及油含量和/或油组成的序列。更具体的目的多核苷酸包括但不限于改善作物收率的基因，改善作物合意性的多肽，编码赋予对非生物胁迫诸如干旱、氮、温度、盐度、有毒金属或微量元素的抗性的蛋白或者赋予对毒素诸如杀虫剂和除草剂的抗性的那些蛋白或者赋予对生物胁迫诸如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫入侵的抗性及对与这些生物体相关病害的发展的抗性的那些蛋白的基因。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如锌指)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及持家的那些基因(诸如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、能育性或不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，目的基因包括涉及油、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响去壳的谷粒的大小、蔗糖载量等的那些基因。除了使用传统的育种方法外，还可通过遗传方式改变农学上重要的性状，诸如油含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和的和不饱和的油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。美国专利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389描述了大麦硫堇(Hordothionin)蛋白质修饰法，这些专利都以引用方式并入本文。另一个示例是美国专利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，以及Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，这些文献的公开内容都以引用方式并入本文。还可在目的多核苷酸上编码可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达的商业性状。经转化的植物的另一个商业用途是生产聚合物和生物塑料，诸如美国专利5,602,321中所述。基因诸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶(参见Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。可通过定点诱变产生编码序列的衍生物，由此增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。举例来说，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682，以及WO98/20133，这些专利的公开内容以引用方式并入本文。其它蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自葵花籽(Lilley等人，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，Applewhite编辑(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，第497-502页；以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene71：359)；两个文献均以引用方式并入本文)；以及来自稻的蛋白质(Musumura等人，(1989)PlantMol.Biol.(《植物分子生物学》)12：123，将该文献以引用方式并入本文)。其它农学上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。改善作物收率的多核苷酸包括矮化基因，诸如Rhtl和Rht2(Peng等人，(1999)Nature(《自然》)400：256-261)以及增加植物生长的那些，诸如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及增加谷粒蛋白的那些多核苷酸。改善盐耐受性的多核苷酸是增加或允许植物在与已引入耐盐基因的该植物的天然环境相比具有更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如邻氨基苯甲酸合酶(AS；EC4.1.3.27)，该酶催化从芳族氨基酸途径分支到植物、真菌和细菌中的色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸生物合成的化学过程分隔在叶绿体中。参见例如美国公开20080050506，其以引用方式并入本文。另外的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌中分离并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利7,361,811，将其以引用的方式并入本文。该目的多核苷酸序列可编码涉及提供病害或害虫抗性的蛋白质。所谓“病害抗性”或“害虫抗性”意指植物避开作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状。害虫抗性基因可编码对严重影响收率的害虫诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和昆虫抗性基因，诸如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕抗菌肽(cecropin)，或者用于抗真菌保护的蛋白质诸如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或者用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因产物的示例。编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，诸如针对伏马毒素(fumonisin)的解毒基因(美国专利5,792,931)；无毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人，(1994)Science(《科学》)266：789；Martin等人，(1993)Science(《科学》)262：1432；以及Mindrinos等人，(1994)Cell(《细胞》)78：1089)等。昆虫抗性基因可编码针对导致收率大跌的害虫(诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。此类基因包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser等人，(1986)Gene(《基因》)，48：109)等。“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”表达生成的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间段的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因引入到植物中：编码对乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草剂例如草胺膦或者basta的抗性的基因(如，bar基因)、对草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、对HPPD抑制剂的抗性的基因(如，HPPD基因)或者本领域已知的其它此类基因。参见例如美国专利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美国临时申请61/401,456，将所述专利中的每个以引用的方式并入本文。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。不育基因也可编码在表达盒中，并且为物理去雄提供备选方案。以此类方法使用的基因的示例包括雄性能育性基因，诸如MS26(参见例如美国专利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(参见例如美国专利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(参见例如美国专利7,919,676)。玉米植物(ZeamaysL.)可通过自花授粉和异花授粉技术二者来进行育种。玉米可在同一植株上具有位于雄穗上的雄花和位于雌穗上的雌花。其可自花授粉(“自交”)或异花授粉。当风将花粉从雄穗吹至从端始雌穗顶部突出的穗丝时在玉米中发生天然的授粉。授粉可容易地由本领域的技术人员已知的技术控制。玉米杂交体的开发需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。谱系育种和轮回选择是用于从群体开发近交系的两种育种方法。育种程序将来自两种或更多种近交系或各种广泛来源的期望性状组合到育种库(breedingpool)中，通过自交并选择期望的表型从该育种库中开发新的近交系。杂交玉米品种是两种此类近交系的杂交，其各自可具有具有一种或多种对方所缺乏的或补充对方的期望特征。将新的近交系与其它近交系杂交，并评估由这些杂交得到的杂交体以确定哪个杂交体具有商业潜力。第一代杂交子代称为F1。F1杂交体比其近交亲本更茁壮。这种杂交优势可以体现为多种方式，包括增加的营养生长和提高的收率。杂交玉米种子可通过结合人工去雄的雄性不育系统产生。为了产生杂交种子，从生长的雌性近交亲本中去除雄穗，该雌性近交亲本可与雌性近交亲本以各种交替的行模式种植。因此，假设与外来玉米花粉源存在充分的分离，雌性近交的雌穗将仅用雄性近交的花粉受精。所得的种子因而为杂交体(F1)并将形成杂交植物。在完成雌性亲本的人工去雄后，影响植物发育的田地变化可导致植物抽穗。或者，可能无法在去雄过程中完全去除雌性近交植物的雄穗。在任何情况下，结果是雌性植物将成功地脱落花粉，并且一些雌性植物将自花授粉。这将导致雌性近交的种子与正常产生的杂交种子一同收获。雌性近交种子未表现出杂种优势，因而生产性不如F1种子。此外，雌性近交种子的存在可代表生产杂交体的公司的种质安全风险。另选地，雌性近交可通过机器而机械去雄。机械去雄大致与手工去雄一样可靠，但是更快且成本较低。然而，大部分去雄机器相比于手工去雄对植物产生更大的损伤。因此，目前没有完全令人满意的去雄形式，并且对于进一步降低生产成本并在杂交种子生产中消除雌性亲本的自花授粉的另选的替代方案的需求仍继续存在。此外，已经认识到目的多核苷酸可还包含与所靶向的目的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与对应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要该序列能与对应的mRNA杂交并干扰其表达。以此方式，可使用与对应的反义序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用于破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或者更多个核苷酸的序列。此外，目的多核苷酸还可以以有义取向使用以抑制植物中的内源性基因的表达。用于使用有义取向的多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作地连接至对应于该内源性基因的转录物的核苷酸序列的至少一部分，驱动在植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源性基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，通常高于约65％的序列同一性、约85％的序列同一性或高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323；该专利以引用方式并入本文。目的多核苷酸还可以是表型标记。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和可选择标记，无论它是阳性还是阴性的可选择标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA链段，该DNA链段使得可以常常在特定条件下鉴别或选择或者不选择含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，诸如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机化合物和有机化合物或者组合物等提供结合位点。可选择标记的示例包括但不限于包含限制性酶位点的DNA链段；编码提供曾针对原本有毒的化合物的抗性的产物的DNA链段，该有毒化合物包括抗生素诸如奇放线菌素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码原本在受体细胞中缺乏的产物的DNA链段(如tRNA基因、营养缺陷型标记)；编码可容易鉴定的产物的DNA链段(例如表型标记诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP、以及细胞表面蛋白)；PCR新引物位点的产生(如两个之前不并置的DNA序列的并置)、限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学剂等不作用或者作用的DNA序列的加入；以及使其得以鉴定的特定修饰(如甲基化)所需的DNA序列的加入。另外的可选择标记包括赋予对除草化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech(《生物技术新见》)3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell(《细胞》)71：63-72；Reznikoff，(1992)MolMicrobiol(《分子微生物学》)6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell(《细胞》)48：555-66；Brown等人，(1987)Cell(《细胞》)49：603-12；Figge等人，(1988)Cell(《细胞》)52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science(《科学》)248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(德国海德尔堡大学博士论文)；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol(《分子细胞生物学》)10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol(《分子结构生物学专题》)10：143-62；Degenkolb等人，(1991)AntimicrobAgentsChemother(《抗微生物剂化学疗法》)35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry(《生物化学》)27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(德国海德尔堡大学博士论文)；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgentsChemother(《抗微生物剂化学疗法》)36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology(《实验药理学手册》)，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature(《自然》)334：721-4。也可以在一个或多个基因上编码商业性状，该基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质表达。经转化的植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，诸如美国专利5,602,321中所述。基因诸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶(参见Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)，170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其它真核生物在内的其它来源的那些。此类产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白质，特别是具有能够提高植物营养价值的改善氨基酸分布的经修饰的蛋白质的水平。这通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或多个用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表达DNA序列的使基因沉默的方法是本领域已知的，包括但不限于共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰、含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰、转录基因沉默以及微RNA(miRNA)干扰。如本文所用，“核酸”是指多核苷酸，并且包括脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。核酸也可包括片段和经修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，表示单链或者双链的RNA和/或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或者改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)用如下的单字母代码指代：“A”指代腺苷或脱氧腺苷(分别对于RNA或者DNA)，“C”指代胞嘧啶或脱氧胞嘧啶，“G”指代鸟苷或脱氧鸟苷，“U”指代尿苷，“T”指代脱氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或T)，K指代G或T，“H”指代A或C或T，“I”指代肌苷，并且“N”指代任何核苷酸。“开放阅读框”缩写为ORF。术语“功能上等同的亚片段”和“功能等同亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指代分离的核酸片段的这样的部分或者亚序列，其中改变基因表达或者产生某种表型的能力得到保持，无论该片段或者亚序列是否编码活性酶。例如，片段或亚片段可用于设计基因以在转化的植物中产生期望的表型。可通过将核酸片段或其亚片段——无论其是否编码活性酶——相对于植物启动子序列以有义或者反义取向进行连接，来设计基因用于抑制。术语“保守结构域”或者“基序”是指沿在进化上相关的蛋白质的经比对的序列在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其它位置处的氨基酸在同源蛋白质之间可变，但在特定位置处高度保守的氨基酸表示对于蛋白质的结构、稳定性或者活性而言必需的氨基酸。由于它们因其在蛋白质同源物家族的经比对的序列中的高保守度而被鉴定，它们可用作鉴定物或者“识别标志(signature)”，以确定具有新确定的序列的蛋白质是否属于之前鉴定的蛋白质家族。多核苷酸和多肽序列、其变体以及这些序列的结构关系，可用术语“同源性”、“同源的”、“基本上相同的”、“基本上相似的”和“基本上对应”描述，这些术语在本文中可互换使用。这些是指多肽或者核酸片段，其中一个或多个氨基酸或者核苷酸碱基的变化不影响分子的功能，诸如介导基因表达或者产生某种表型的能力。这些术语还指核酸片段的这样的修饰，相对于初始的未修饰的片段，所述修饰不实质上改变所得的核酸片段的功能性质。这些修饰包括在核酸片段中缺失、置换和/或插入一个或多个核苷酸。所涵盖的基本上类似的核酸序列，可通过其与本文所例示的序列杂交，或者与本文所公开的且与任何本文所公开的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分杂交(在中等严格条件下，例如0.5XSSC，0.1％SDS，60℃)的能力来定义。可调节严格条件以筛选中等相似片段，诸如来自远缘生物的同源序列，以及高度相似片段，诸如来自近缘生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定了严格条件。术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶核酸序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少80％的序列同一性，或者90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互补)。术语“严格条件”或者“严格杂交条件”包括指代在体外杂交测定中探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，由此使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般地讲，探针长度小于约1000个核苷酸，任选地长度小于500个核苷酸。通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01M至1.0M钠离子浓度(或者其它盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如大于50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30％-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％-45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.5倍至1倍SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.1倍SSC中在60℃至65℃下洗涤。在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或者氨基酸残基。术语“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸或者多肽序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列同一性百分比的可用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者50％至100％的任何整数百分比。这些同一性可用本文描述的任何程序确定。序列比对和百分比同一性或者相似性计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序。在本申请的上下文中，应当理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，分析的结果将基于所提到的软件的“默认值”，除非另有指明。本文所用的“默认值”将意指软件第一次初始化时原始装载在该软件中的任何数值或者参数的集。“ClustalV比对方法”对应于标示为ClustalV的比对方法(由Higgins和Sharp，(1989)CABIOS(《计算机在生物科学中的应用》)5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci(《计算机在生物科学中的应用》)，8：189-191描述)，并且其存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序中。对于多重比对，默认值对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的逐对比对和百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，以及对角线保存(DIAGONALSSAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，窗口＝4，以及对角线保存＝4。在使用ClustalV程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。“ClustalW比对方法”对应于标示为ClustalW的比对方法(由Higgins和Sharp，(1989)CABIOS(《计算机在生物科学中的应用》)5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci(《计算机在生物科学中的应用》)，8：189-191描述)，并且其存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlignTMv6.1程序中。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(DelayDivergenSeqs)(％)＝30，DNA转换权重(DNATransitionWeight)＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。在使用ClustalW程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。除非另行指出，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys公司，加利福尼亚州圣地亚哥市(SanDiego，CA))采用以下参数获得的值：对于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用空位产生罚分权重(gapcreationpenaltyweight)50和空位长度延伸罚分权重(gaplengthextensionpenaltyweight)3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；使用空位产生罚分权重8和空位长度延伸罚分2以及BLOSUM62计分矩阵得到氨基酸序列同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。GAP使用Needleman和Wunsch(1970)JMolBiol48：443-53的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并使用以匹配碱基为单位的空位形成罚分和空位延伸罚分产生出具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。“BLAST”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于寻找生物序列之间的相似性区域的搜索算法。该程序将核苷酸或者蛋白质序列与序列数据库进行比较，并计算各匹配的统计学显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，由此使得相似性不被预测为随机发生。BLAST报告所鉴定的序列以及它们与查询序列的局部比对。本领域的技术人员熟知，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的或者经天然修饰或合成法修饰的多肽，其中这种多肽具有相同或相似的功能或活性。百分比同一性的可用示例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者50％至100％之间的任何整数百分比。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。“基因”是指表达功能性分子诸如但不限于特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指如自然界中存在那样具有其自身调控序列的基因。“突变基因”是已通过人工干预被改变的基因。这种“突变基因”的序列与相应的非突变基因的序列的不同之处在于至少一个核苷酸添加、缺失或置换。在本发明的某些实施方案中，突变基因包含由如本文所公开的向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统引起的改变。突变的植物为包含突变基因的植物。如本文所用，“靶向突变”是天然基因中的通过如下方式产生的突变：使用涉及本文所公开的或者本领域已知的能够在靶序列的DNA中诱导双链断裂的双链断裂诱导剂的方法，对天然基因内的靶序列进行改变。在一个实施方案中，靶向突变是如本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶诱导的基因编辑的结果。可在核苷酸序列中发生向导RNA/CAS内切核酸酶诱导的靶向突变，该核苷酸序列位于被Cas内切核酸酶识别并裂解的基因组靶位点之内或之外。术语“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，也涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体或者质粒)中存在的细胞器DNA。“密码子修饰的基因”或者“密码子偏好的基因”或者“密码子优化的基因”是这样的基因，其密码子使用的频率被设计成模拟宿主细胞的偏好密码子使用的频率。“等位基因”是基因的占据染色体上给定基因座的几种另类形式之一。当染色体上给定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上给定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的多核苷酸序列。“调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于：启动子、翻译前导序列、5′非翻译序列、3′非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。“植物优化的核苷酸序列”是已经过优化以提高在植物中的表达、特别是提高在植物中或者一种或多种目的植物中的表达的核苷酸序列。例如，可通过使用一个或多个用于改进表达的植物偏好的密码子，对本文所公开的编码蛋白质诸如例如双链断裂诱导剂(例如内切核酸酶)的核苷酸序列进行修饰，来合成植物优化的核苷酸序列。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.(《植物生理学》)92：1-11。合成植物偏好的基因的方法是本领域可用的。参见例如美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人，(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，所述专利和文献以引用方式并入本文。已知增强在植物宿主中的基因表达的另外的序列修饰。这些包括例如消除：一个或多个编码假聚腺苷酸化信号的序列、一个或多个外显子-内含子剪接位点信号、一个或多个转座子样重复序列以及其它这种得到很好表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调节到给定的植物宿主的平均水平，这通过参考在宿主植物细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免一个或多个预测的发夹二级mRNA结构。因此，本发明的“植物优化的核苷酸序列”包含这种序列修饰中的一个或多个。“启动子”是指能够控制编码序列或者功能RNA的表达的DNA序列。启动子序列由近端上游元件和更远端的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同启动子的不同元件构成，和/或包含合成的DNA链段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。还认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切界限仍未完全限定，因此具有一定变异的DNA片段可以具有相同的启动子活性。造成基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。已示出，某些启动子能够以比其它启动子高的速率指导RNA合成。这些称为“强启动子”。某些其它启动子已示出仅在特定类型的细胞或组织中以更高水平指导导RNA合成，并且如果启动子优选地在某些组织中指导RNA合成而在其它组织中以较低水平指导RNA合成，则通常称为“组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”。因为引入植物中的(一种或多种)嵌合基因的表达模式使用启动子进行控制，所以目前感兴趣的是能够在特异性组织类型中或特异性植物发育阶段以一定水平控制(一种或多种)嵌合基因表达的新启动子的分离。本发明的一些实施方案涉及新发现的U6RNA聚合酶III启动子，如实施例12所述的GM-U6-13.1(SEQIDNO：120)和实施例19所述的GM-U6-9.1(SEQIDNO：295)。“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的示例已有描述(例如Turner和Foster，(1995)MolBiotechnol(《分子生物技术》)，3：225-236)。“3′非编码序列”、“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响添加聚腺苷酸片至mRNA前体的3′末端。不同的3′非编码序列的用途由Ingelbrecht等人，(1989)PlantCell1：671-680例举。“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，它被称为初级转录物。当RNA转录物是由初级转录物的转录后加工衍生的RNA序列时，它被称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指没有内含子且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补且用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链或者用DNA聚合酶I的Klenow片段转变为双链形式。“有义”RNA是指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译为蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”是指与靶初级转录物或者mRNA的全部或者部分互补，并且阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见例如美国专利5,107,065)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”是指反义RNA、核糖酶RNA或其它可能不被翻译但仍对细胞过程具有作用的RNA。术语“互补序列”或者“反互补序列”在本文中可互换地用来指涉mRNA转录物，并且意在定义该信息(message)的反义RNA。术语“可操作地连接”是指核酸序列缔合在单一核酸片段上，使得一个核酸序列的功能被另一个核酸序列调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达时(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义取向或反义取向与调控序列可操作地连接。在另一个示例中，互补的RNA区域可以直接或者间接地与靶mRNA的上游(5′)可操作地连接，或者与靶mRNA的下游(3′)可操作地连接，或者在靶mRNA内部可操作地连接，或者第一互补区在靶mRNA的上游(5′)，而其互补序列在靶mRNA的下游(3′)。本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，在以下文献中有更完全的描述：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual(《分子克隆实验指南》)；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)。转化方法是本领域技术人员熟知的，并在下文中描述。“PCR”或“聚合酶链反应”是一项用于合成特定DNA链段的技术，由一系列的重复的变性、退火和延伸循环组成。通常，将双链DNA进行热变性，并将两条与靶链段的3′边界互补的引物与该DNA在低温下退火，然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤称为一个“循环”。术语“重组”是指序列的两个本来分开的链段例如通过化学合成人工组合在一起，或者通过遗传工程技术对核酸的分离的链段进行操纵。术语“质粒”、“载体”和“盒”是指这样的染色体外元件，其通常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链DNA的形式。这种元件可以是衍自任何来源的、单链或双链的DNA或RNA的、线性或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已连接或者重组成能够将目的多核苷酸引入到细胞中的独特构建体。“转化盒”是指含有基因并且除该基因之外还具有有利于特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有基因并且除该基因之外还具有允许该基因在宿主中表达的元件的特定载体。术语“重组DNA分子”、“重组构建体”、“表达构建体”、“构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如调控序列和编码序列)的人工组合。例如，构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或者可与载体一起使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将被用来转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、选择和繁殖宿主细胞而必须在载体上存在的遗传元件。技术人员也将认识到，不同的独立转化事件可导致不同的表达水平和模式(Jones等人，(1985)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，4：2411-2418；DeAlmeida等人，(1989)MolGenGenetics(《分子与普通遗传学》)，218：78-86)，从而通常筛选多个事件以获得表现出所需的表达水平和模式的品系。这种筛选可通过标准的分子生物学测定法、生物化学测定法和其它测定法完成，所述测定法包括DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白质表达的免疫印迹分析、酶或活性测定和/或表型分析。如本文所用，术语“表达”是指产生前体形式或成熟形式的功能性最终产物(例如mRNA、向导RNA或蛋白质)。术语“引入”意指向细胞提供核酸(例如表达构建体)或蛋白质。引入包括指代核酸掺入到真核或者原核细胞中，其中该核酸可掺入到该细胞的基因组中，并且包括指代核酸或蛋白质瞬时提供到细胞。引入包括指代稳定的或瞬时的转化方法，以及有性杂交。因此，在将核酸片段(例如，重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞中的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主的复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。“成熟”蛋白质是指经翻译后加工的多肽(即，已从初级翻译产物去除了任何存在的原肽或者前肽所得的多肽)。“前体”蛋白是指mRNA的初级翻译产物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，包括核基因组和细胞器基因组两者，从而导致基因稳定遗传(geneticallystableinheritance)。相反，“瞬时转化”是指核酸片段转移到宿主生物体的细胞核或者其它含DNA的细胞器中，导致基因表达，但不存在整合或者稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体称作“转基因”生物体。遗传改良种质的商业化发展也已经进展到将多种性状引入到作物植物中的阶段，该方法常常被称为基因堆积方法。在该方法中，可将赋予不同目的特征的多个基因引入到植物中。基因堆积可通过多种方式实现，包括但不限于共转化、再转化、以及杂交具有不同目的基因的品系。术语“植物”是指整个植株、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、及其种子和子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或者在植物器官、组织或培养物中。术语“植物器官”是指构成植物的形态上和功能上不同的部分的植物组织或者一组植物组织。术语“基因组”是指生物体的每个细胞或病毒或细胞器中存在的遗传物质(基因和非编码序列)的全部互补序列；和/或作为(单倍体)单元从一个亲本遗传的一整套染色体。“子代”包含植物的任何后续世代。在本发明的某些实施方案例中，能育植物是产生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。这种自身能育植物可在没有任何其它植物贡献配子及其中所含的遗传物质的情况下产生子代植物。本发明的其它实施方案可涉及使用非自身能育的植物，因为该植物不产生活的或者能够授受精的雄配子或雌配子或两者。如本文所用，“雄性不育植物”是不产生活的或者能够授精的雄配子的植物。如本文所用，“雌性不育植物”是不产生活的或者能够受精的雌配子的植物。应认识到，雄性不育植物和雌性不育植物可以分别是雌性能育和雄性能育的。还应认识到，雄性能育(但雌性不育)植物当与雌性能育植物杂交时可产生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物当与雄性能育植物杂交时可产生活的子代。“厘摩”(cM)或者“图距单位(mapunit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。育种方法和用于利用双组分RNA向导和Cas内切核酸酶系统选择植物的方法本发明可用于培育包含一个或多个转基因性状的植物。最常见地，转基因性状是作为基于农杆菌属、基因枪或者其它常用过程的转化系统的结果而随机插入在植物基因组当中。最近，已开发出了能够指导转基因插入的基因靶向规程。一种重要的技术即位点特异性整合(SSI)能使转基因靶向与之前插入的转基因相同的染色体位置。定制的大范围核酸酶和定制的锌指大范围核酸酶使研究者可以设计核酸酶以靶向特定的染色体位置，并且这些试剂使得可以将转基因靶向于被这些核酸酶裂解的染色体位点。目前用于真核基因组(例如植物基因组)的精确遗传工程改造的系统依赖于归巢内切核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、以及转录激活因子——如效应子核酸酶(TALEN)，其对于每个新靶基因座需要从头蛋白质工程改造(denovoproteinengineering)。当多个不同靶序列的修饰为目标时，本文所述的高度特异性的RNA-指导的DNA核酸酶、向导RNA/CAS9内切核酸酶系统更易于定制并因而更有用。本发明还利用了向导RNA/Cas系统的双组分性质——具有其恒定的蛋白质组分即Cas内切核酸酶、以及其可变且易于重新编程的靶向成分即向导RNA或crRNA。在核酸酶靶标外切割可对于靶细胞有毒的情况下，本文所述的向导RNA/Cas系统尤其可用于基因组工程改造，特别是植物基因组工程改造。在本文所述的向导RNA/Cas系统的一个实施方案中，呈表达优化的Cas9基因形式的恒定组分被稳定地整合到靶基因组例如植物基因组中。Cas9基因的表达受到启动子例如植物启动子的控制，该启动子可为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，例如温度诱导型、胁迫诱导型、发育阶段诱导型、或化学诱导型启动子。在不存在可变组分即向导RNA或crRNA时，Cas9蛋白质不能切割DNA并因此其在植物细胞中的存在应当几乎没有或没有影响。因此，本文所述的向导RNA/Cas系统的关键优点是产生并保持能够有效表达Cas9蛋白质的细胞系或转基因生物体的能力，并且对细胞生存力几乎没有或没有影响。为了在期望的基因组位点诱导切割以实现靶向遗传修饰，可通过各种方法将向导RNA或crRNA引入包含稳定整合且表达的cas9基因的细胞中。例如，向导RNA或crRNA可通过化学或酶促方法合成，并且经由直接递送方法诸如粒子轰击或电穿孔引入Cas9表达细胞中。另选地，能够在靶细胞中有效表达向导RNA或crRNA的基因可经化学合成、酶促方法合成，或者处于生物系统中，并且这些基因可经由直接递送方法诸如粒子轰击或电穿孔或生物递送方法诸如农杆菌属介导的DNA递送引入Cas9表达细胞中。本公开的一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包括改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在植物基因组的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，该第二植物包含能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物的向导RNA，c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点的改变，以及e)选择具有所述靶位点的期望改变的子代植物。本公开的另一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包括改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在植物基因组的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，该第二植物包含向导RNA和供体DNA，其中所述向导RNA能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代的靶位点的改变，以及e)选择在所述靶位点处包含目的多核苷酸的子代植物。本公开的另一个实施方案是用于选择在其植物基因组中包括改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括选择至少一种在其植物基因组中的靶位点处包括改变的子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含向导RNA和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含目的多核苷酸。如本文所公开的，介导基因靶向的向导RNA/Cas系统可以以类似于WO2013/0198888(公布于2013年8月1日)所公开的方式在用于指导转基因插入和/或用于产生包括多个转基因的复合转基因性状基因座的方法中使用，在该公开中不使用双链断裂诱导剂引入目的基因，使用如本文公开的向导RNA/Cas系统或向导多核苷酸/Cas系统。在一个实施方案中，复合转基因性状基因座是具有多个在遗传上彼此连接的转基因的基因组基因座。通过在彼此相距0.1、0.2、0.3、04、0.5、1、2、或甚至5厘摩(cM)内插入独立的转基因，转基因可培育为单个遗传基因座(参见例如美国专利申请13/427,138)或PCT申请PCT/US2012/030061。在选择包含转基因的植物之后，可使包含(至少)一个转基因的植物杂交以形成包含两个转基因的F1。在来自于这些F1(F2或BC1)的子代中，1/500子代将具有重组到同一染色体上的两个不同的转基因。该复合基因座然后可被培育成为具有两种转基因性状的单个遗传基因座。可重复这个过程以按需堆积尽可能多的性状。可鉴定与目的表型或性状相关联的染色体区间。在本领域中熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界被划定成包括将与控制目的性状的基因连接的标记。换句话讲，染色体区间被划定成使得位于该区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作大斑病抗性的标记。在一个实施方案中，染色体区间包括至少一个QTL，并且此外可实际上包括多于一个QTL。在同一区间中紧密靠近的多个QTL可混淆特定标记与特定QTL的相关性，因为一个标记可显示连锁于多于一个QTL。相反地，例如，如果两个紧密靠近的标记示出与期望的表型性状共分离，有时并不清楚那些标记中的每个是否鉴定相同的QTL或两个不同的QTL。术语“数量性状基因座”或“QTL”是指在至少一个遗传背景中，例如在至少一个育种群体中，与数量表型性状的差异表达相关联的DNA区域。QTL区域涵盖影响所考虑性状的一个或多个基因或与该一个或多个基因紧密相连。“QTL的等位基因”可包括连续基因组区域或连锁群诸如单倍型内的多个基因或其它遗传因子。QTL的等位基因可代表指定窗口内的单倍型，其中所述窗口为可用一组一个或多个多态标记限定并跟踪的连续基因组区域。单倍型可由在指定窗口内各个标记处的等位基因的独特指纹来限定。多种方法可用来鉴定那些在靶位点处或者附近具有改变的基因组的细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、Southern印迹法以及它们的任何组合。蛋白质可以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于这类操纵的方法是一般是已知的。例如，可通过在DNA中的突变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法包括例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92；Kunkel等人，(1987)MethEnzymol(《酶学方法》)，154：367-82；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra编辑，(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany，NewYork)以及其中引用的参考文献。有关不太可能影响蛋白质的生物活性的氨基酸置换的指导，见于例如Dayhoff等人，(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(NatlBiomedResFound，Washington，D.C.)的模型中。保守置换，诸如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。保守缺失、插入和氨基酸置换预期不产生蛋白质特征的根本性变化，并且任何置换、缺失、插入或者它们的组合的效应可通过常规筛选测定法进行评估。测定双链断裂诱导活性的测定法是已知的，并且一般是测量该试剂对含有靶位点的DNA底物的总体活性和特异性。充分的同源性或者序列同一性表示两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总体长度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通过序列的总长度上的序列同一性百分比，和/或通过包含局部化相似性的保守区域(诸如具有100％序列同一性的连续的核苷酸)以及序列长度的一部分上的序列同一性百分比来描述。靶标和供体多核苷酸共享的同源性或者序列同一性的量可变化，并且包括总长度和/或具有在以下范围内的单位整数值的区域：约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或者至多达并包括该靶位点的总长度。这些范围包括该范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通过两个多核苷酸的完全比对长度上的序列同一性百分比来描述，该序列同一性百分比包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性百分比。充分的同源性包括多核苷酸长度、全局序列同一性百分比和连续的核苷酸的任选保守区域或局部序列同一性百分比的任何组合，例如充分的同源性可描述为75-150bp的与靶基因座区域具有至少80％序列同一性的区域。充分的同源性也可通过所预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(《分子生物学实验手册》)，Ausubel等人编辑，(1994)CurrentProtocols，(GreenePublishingAssociates，Inc.和JohnWiley&Sons，Inc)；以及Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，(Elsevier，NewYork)。已知用于将核苷酸序列和多肽引入到生物体中的多种方法，包括例如转化、有性杂交，以及将多肽、DNA或mRNA引入细胞中。用于接触、提供和/或引入组合物到各种生物体中的方法是已知的，并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法和有性育种。稳定转化表示所引入的多核苷酸整合到生物体的基因组中并能够被其子代遗传。瞬时转化表示所引入的组合物仅仅在生物体中暂时表达或者存在。用于将多核苷酸或多肽引入到植物中的规程可根据作为转化目标的植物或者植物细胞的类型(诸如单子叶植物或双子叶植物)而变化。将多核苷酸和多肽引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-34，以及美国专利6,300,543)、分生组织转化(美国专利5,736,369)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，83：5602-6)、农杆菌属介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3：2717-22)，以及弹道粒子加速(美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人，(1995)“DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment”，载于PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology(《生物技术》)6：923-6)；Weissinger等人，(1988)AnnRevGenet(《遗传学年评》)，22：421-77；Sanford等人，(1987)ParticulateScienceandTechnology(《粒子科学与技术》)5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)PlantPhysiol(《植物生理学》)，87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)InVitroCellDev.Biol.(《体外细胞与发育生物学》)27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)TheorApplGenet(《理论和应用遗传学》)，96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology(《生物技术》)，8：736-40(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-9(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology(《生物技术》)，6：559-63(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)PlantPhysiol(《植物生理学》)，91：440-4(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology(《生物技术》)，8：833-9(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature(《自然》)，311：763-4；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-9(百合科)；DeWet等人，(1985)，载于TheExperimentalManipulationofOvuleTissues(《胚珠组织的实验操纵》)，Chapman等人编辑(Longman，NewYork)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCellRep(《植物细胞报道》)，9：415-8)以及Kaeppler等人，(1992)TheorApplGenet(《理论和应用遗传学》)，84：560-6(颈须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)PlantCell(《植物细胞》)4：1495-505)(电穿孔)；Li等人，(1993)PlantCellRep(《植物细胞报道》)，12：250-5；Christou和Ford，(1995)AnnalsBotany(《植物性年鉴》)，75：407-13(稻)，以及Osjoda等人，(1996)NatBiotechnol(《自然生物技术》)，14：745-50(玉米，通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))。另选地，可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触来将多核苷酸引入到植物中。一般地讲，这种方法涉及将多核苷酸掺入在病毒DNA或者RNA分子内。在一些示例中，可最初将目的多肽作为病毒聚蛋白的一部分合成，后者然后在体内或者体外通过蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。涉及病毒DNA或者RNA分子的、用于将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是已知的，参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931。瞬时转化方法包括但不限于直接引入多肽诸如双链断裂诱导剂到生物体中、引入多核苷酸诸如DNA和/或RNA多核苷酸、以及引入RNA转录物诸如编码双链断裂诱导剂的mRNA到生物体中。这类方法包括例如显微注射法或粒子轰击法。参见例如Crossway等人，(1986)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，202：179-85；Nomura等人，(1986)PlantSci(《植物科学》)，44：53-8；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2176-80；以及Hush等人，(1994)JCellSci(《细胞科学杂志》)，107：775-84。术语“双子叶植物”是指也称为“双子叶植物纲”的被子植物的亚类，并且包括对整个植株、植物器官(例如，叶、杆、根等)、种子、植物细胞及其子代的引用。本文所用的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明上下文中，术语“杂交的”或“交配”或“杂交”意指经由授粉融合配子而产生子代(即，细胞、种子或植株)。该术语涵盖有性杂交(一个植株通过另一个植株授粉)和自交(自花授粉，即，当花粉和胚珠来自于同一植株或遗传上相同的植株)。术语“基因渗入”是指遗传基因座的期望等位基因从一个遗传背景传输到另一个遗传背景。例如，指定基因座处期望的等位基因的渗入可经由两个亲本植物之间的有性杂交传输到至少一个子代植物，其中亲本植物中的至少一者在其基因组内具有期望的等位基因。另选地，例如，等位基因的传输可例如在融合的原生质体中通过两个供体基因组之间的重组而发生，其中供体原生质体中的至少一者在其基因组内具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如转基因或者所选择的标记或QTL的等位基因。标准的DNA分离、纯化、分子克隆、载体构建和验证/表征方法是已建立的，参见例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)。载体和构建体包括包含目的多核苷酸和任选其它组分的环状质粒和线性多核苷酸，其它组分包括连接子、衔接子、调控区域、内含子、限制位点、增强子、隔离子、可选择的标记、目的核苷酸序列、启动子和/或其它有助于载体构建或者分析的位点。在一些示例中，识别位点和/或靶位点可包含在内含子、编码序列、5′UTR、3′UTR和/或调控区域内。本发明还提供表达构建体，用于在植物、植物细胞或植物部分中表达能够结合靶位点并在靶位点中产生双链断裂的向导RNA/Cas系统。在一个实施方案中，本发明的表达构建体包括可操作地连接至编码cas基因的核苷酸序列的启动子以及可操作地连接至本发明的向导RNA的启动子。该启动子能够驱动可操作地连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。启动子是涉及RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合以引发转录的DNA区域。植物启动子是能够在植物细胞中引发转录的启动子，有关植物启动子的综述参见Potenza等人，(2004)InVitroCellDevBiol(《体外细胞发育生物学》)，40：1-22。组成型启动子包括例如WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子以及其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人，(1985)Nature(《自然》)313：810-2)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)PlantCell(《植物细胞》)2：163-71)；遍在蛋白(Christensen等人，(1989)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，12：619-32；Christensen等人，(1992)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)TheorApplGenet81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3：2723-30)；ALS启动子(美国专利5,659,026)，等等。其它组成型启动子描述于例如：美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。在一些示例中，可使用诱导型启动子。病原体感染后被诱导的病原体诱导型启动子包括但不限于那些调控PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的表达的启动子。可将化学调控启动子用于通过施用外源化学调控剂来调节基因在植物中的表达。该启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学剂的施加诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中化学剂的施加阻抑基因表达。化学诱导型启动子包括但不限于玉米In2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活(DeVeylder等人，(1997)PlantCellPhysiol38：568-77)；玉米GST启动子(GST-II-27，WO93/01294)，其由用作芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活；以及烟草属PR-1a启动子(Ono等人，(2004)BiosciBiotechnolBiochem68：803-7)，其由水杨酸激活。其它化学调节性启动子包括甾类化合物响应性启动子(参见例如糖皮质素类诱导型启动子(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-5；McNellis等人，(1998)PlantJ(《植物杂志》)，14：247-257)；四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(Gatz等人，(1991)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，227：229-37；美国专利5,814,618和5,789,156)。组织优选的启动子可用于靶向特定植物组织内的增强的表达。组织优选的启动子包括例如Kawamata等人，(1997)PlantCellPhysiol(《植物细胞生理学》)，38：792-803；Hansen等人，(1997)MolGenGenet(《分子与普通遗传学》)，254：337-43；Russell等人，(1997)TransgenicRes(《转基因研究》)，6：157-68；Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol(《植物生理学》)，112：1331-41；VanCamp等人，(1996)PlantPhysiol(《植物生理学》)，112：525-35；Canevascini等人，(1996)PlantPhysiol(《植物生理学》)，112：513-524；Lam，(1994)ResultsProblCellDiffer20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)PlantJ(《植物杂志》)，4：495-505。叶优选的启动子包括例如Yamamoto等人，(1997)PlantJ(《植物杂志》)，12：255-65；Kwon等人，(1994)PlantPhysiol，105：357-67；Yamamoto等人，(1994)PlantCellPhysiol(《植物细胞生理学》)，35：773-8；Gotor等人，(1993)PlantJ(《植物杂志》)，3：509-18；Orozco等人，(1993)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，23：1129-38)；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：9586-90；Simpson等人，(1958)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，4：2723-9；Timko等人，(1988)Nature(《自然》)，318：57-8。根优选的启动子包括例如Hire等人，(1992)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，20：207-18(大豆根特异性谷氨酰胺合酶基因)；Miao等人，(1991)PlantCell(《植物细胞》)，3：11-22(胞质谷氨酰胺合酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)PlantCell(《植物细胞》)，3：1051-61(法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，14：433-43(根瘤农杆菌(A.tumefaciens)甘露氨酸合酶(MAS))的根特异性启动子)；Bogusz等人，(1990)PlantCell(《植物细胞》)，2：633-41(从糙叶山黄麻(Parasponiaandersonii)和山黄麻(Trematomentosa)分离的根特异性启动子)；Leach和Aoyagi，(1991)PlantSci(《植物科学》)，79：69-76(发根农杆菌(A.rhizogenes)rolC和rolD根诱导基因)；Teeri等人，(1989)EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，8：343-50(农杆菌属损伤诱导的TR1′和TR2′基因)；VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，29：759-72)；以及rolB启动子(Capana等人，(1994)PlantMolBiol(《植物分子生物学》)，25：681-91；菜豆蛋白基因(Murai等人，(1983)Science(《科学》)，23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3320-4)。另参见美国专利：5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。种子优选的启动子包括种子发育过程中活跃的种子特异性启动子和在种子发芽过程中活跃的种子发芽启动子。参见Thompson等人，(1989)BioEssays10：108。种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米素)；以及milps(肌-肌醇-1-磷酸酯合酶)；(WO00/11177；和美国专利6,225,529)。对于双子叶植物，种子优选的启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子优选的启动子包括但不限于玉米15kDa玉米素、22kDa玉米素、27kDaγ玉米素、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1、油质蛋白和nuc1。另参见WO00/12733，其中公开了来自END1和END2基因的种子优选的启动子。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和可选择的标记，无论它是阳性可选择标记还是阴性可选择标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择或可筛选的标记包含这样的DNA链段，该DNA链段使得可以常常在特定条件下鉴定或选择或者不选择含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，诸如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机的化合物或组合物等提供结合位点。可选择标记的示例包括但不限于：包含限制性酶位点的DNA链段；编码提供对抗原本有毒的化合物的抗性的产物的DNA链段，有毒的化合物包括抗生素诸如奇放线菌素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码原本在受体细胞中缺乏的产物的DNA链段(如tRNA基因、营养缺陷型标记)；编码可容易鉴定的产物的DNA链段(例如表型标记如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP、以及细胞表面蛋白)；PCR新引物位点的产生(如两个之前不并置的DNA序列的并置)、限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学剂等不作用或者作用的DNA序列的加入；以及使其得以鉴定的特定修饰(如甲基化)所需的DNA序列的加入。另外的可选择标记包括赋予对除草化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech(《生物技术新见》)3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell(《细胞》)71：63-72；Reznikoff，(1992)MolMicrobiol(《分子微生物学》)6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell(《细胞》)48：555-66；Brown等人，(1987)Cell(《细胞》)49：603-12；Figge等人，(1988)Cell(《细胞》)52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science(《科学》)248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(德国海德尔堡大学博士论文)；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol(《分子细胞生物学》)10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes(《核酸研究》)19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol(《分子结构生物学专题》)10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.AgentsChemother(《抗微生物剂化学疗法》)35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry(《生物化学》)27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(德国海德尔堡大学博士论文)；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)Antimicrob.AgentsChemother(《抗微生物剂化学疗法》)36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology(《实验药理学手册》)，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature(《自然》)334：721-4。可采用常规条件将具有所引入的序列的细胞生长或者再生成植物，参见例如McCormick等人，(1986)PlantCellRep5：81-4。然后可使这些植物生长，并用相同转化株或者用不同转化株或未转化株进行授粉，并鉴定出具有所需特性和/或包含所引入的多核苷酸或者多肽的所得子代。可生长两代或更多代以确保多核苷酸得到稳定保持和遗传，并收获种子。可使用任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物。可使用的单子叶植物的示例包括但不限于玉米(Zeamays)、稻(Oryzasativa)、裸麦(Secalecepeale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、小麦(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumspp.)、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、菠萝(Ananascomosus)、香蕉(Musaspp.)、棕榈、观赏植物、草坪草和其它草类。可使用的双子叶植物的示例包括但不限于大豆(Glycinemax)、卡诺拉油菜(Brassicanapus和B.campestris)、苜蓿(Medicagosativa)、烟草(Nicotianatabacum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)、棉(Gossypiumarboreum)和花生(Arachishypogaea)、西红柿(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)等。目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或多个目的基因。这种目的基因可编码例如为植物提供农学优势的蛋白质。标记辅助选择和植物育种开发作物物种的分子标记的主要动机是通过标记辅助选择(MAS)提高植物育种效率的潜能。遗传标记等位基因，或另选地数量性状基因座(QTL等位基因)用于鉴定如下植物：在一个或多个基因座处包含期望的基因型，并且希望使期望的基因型以及期望的表型传递给它们的子代。遗传标记等位基因(QTL等位基因)可用于鉴定如下植物：在一个基因座，或在若干非连锁或连锁基因座处包含期望的基因型(例如单倍型)，并且希望使期望的基因型以及期望的表型传递给它们的子代。应当理解，出于MAS的目的，术语“标记”可涵盖标记和QTL基因座两者。在确定所期望的表型和多态性染色体基因座，例如标记基因座或QTL一起分离之后，可以使用那些多态性基因座来选择对应于所期望表型的等位基因——称为标记辅助选择(MAS)的过程。简而言之，在来自于待选择植物的生物样品中检测出对应于标记核酸的核酸。该检测可利用探针核酸与标记的杂交形式，例如使用等位基因特异性杂交、Southern印迹分析、northern印迹分析、原位杂交、引物杂交，之后进行标记区域的PCR扩增等。用于检测标记的多种过程在本领域中是熟知的。在证实生物样品中存在(或不存在)特定标记之后，对植物进行选择，即通过选择育种用于形成子代植物。植物育种人员需要组合目的性状与高收率基因及其它期望的性状来开发改善的植物品种。筛选大量的样品可能是昂贵、耗时的，并且不可靠。标记和/或遗传连锁的核酸的使用是用于在育种程序中选择具有期望性状的植物的有效方法。例如，标记辅助选择相对于田间评估的一个优点在于MAS可在全年的任意时间进行而无需考虑生长季。此外，环境影响与标记辅助选择不相关。当分离影响一个或多个性状的多个基因座的群体时，MAS的效率相比于表型筛选变得甚至更大，因为可在实验室从单个DNA样品一起处理所有基因座。细胞的DNA修复机制是转化以引入外源DNA或者在内源性基因上诱导突变的基础。DNA同源重组是细胞使用同源序列修复DNA损伤的专门DNA修复方式。在植物中，DNA同源重组发生频率过低而不能用于转化，直到发现该过程可通过DNA双链断裂来刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.CellBiol.21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)Science(《科学》)，300：763；Wright等人，(2005)PlantJ.44：693-705)。缩写词的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升、“L”指升、“μM”指微摩尔浓度、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔浓度、“mmol”指毫摩尔、“μmole”指微摩尔、“g”指克、“μg”指微克、“ng”指纳克、“U”指单位、“bp”指碱基对，并且“kb”指千碱基。另外，如本文所述，对引用向导RNA的每个实施例或实施方案而言，可设计类似的向导多核苷酸，其中向导多核苷酸并不仅仅包括核糖核酸，而且其中向导多核苷酸还包括RNA-DNA分子的组合或仅包括DNA分子。一种用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、以及任选的多核苷酸修饰模板引入细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂的复合物，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。根据实施方案53所述的方法，其中细胞基因组中的核苷酸序列选自启动子序列、终止子序列、调控元件序列、剪接位点、编码序列、多聚泛素化位点、内含子位点和内含子增强基序。一种用于在细胞基因组中编辑启动子的方法，该方法包括将向导多核苷酸、多核苷酸修饰模板以及至少一种Cas内切核酸酶引入细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂的复合物，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。一种用于替换细胞中的第一启动子序列的方法，该方法包括将向导RNA、多核苷酸修饰模板、以及Cas内切核酸酶引入所述细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂的复合物，其中所述多核苷酸修饰模板包含第二启动子或不同于所述第一启动子序列的第二启动子片段。根据实施方案56所述的方法，其中第一启动子序列的替换导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：启动子活性增大，启动子组织特异性增大，启动子活性减小，启动子组织特异性减小，新启动子活性，诱导型启动子活性，基因表达的窗口扩展，或相同细胞层或其它细胞层中的基因表达的时间选择或发育进展的改变。根据实施方案56所述的方法，其中所述第一启动子序列选自玉米ARGOS8启动子、大豆EPSPS1启动子、玉米EPSPS启动子、玉米NPK1启动子，其中第二启动子序列选自玉米GOS2PRO：GOS2-内含子启动子、大豆遍在蛋白启动子、胁迫诱导型玉米RAB17启动子、玉米-PEPCI启动子、玉米遍在蛋白启动子、玉米-Rootmet2启动子、稻肌动蛋白启动子、高粱RCC3启动子、玉米-GOS2启动子、玉米-ACO2启动子和玉米油质蛋白启动子。一种用于使细胞基因组中的启动子序列缺失的方法，该方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶引入细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在位于所述启动子序列之内或之外的至少一个靶位点处引入双链断裂的复合物。一种用于将启动子或启动子元件插入细胞基因组的方法，该方法包括将向导多核苷酸、包含启动子或启动子元件的多核苷酸修饰模板、以及Cas内切核酸酶引入细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成允许Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂的复合物。根据实施方案60所述的方法，其中启动子或启动子元件的插入导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：启动子活性增大，启动子组织特异性增大，启动子活性减小，启动子组织特异性减小，新启动子活性，诱导型启动子活性，基因表达的窗口扩展、基因表达的时间选择或发育进展的改变、DNA结合元件的突变、或DNA结合元件的添加。一种用于编辑锌指转录因子的方法，该方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、以及任选的多核苷酸修饰模板引入细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包括所述锌指转录因子的至少一个核苷酸修饰或缺失，其中所述锌指转录因子的缺失或修饰导致形成显性失活的锌指转录因子突变体。一种用于形成融合蛋白的方法，该方法包括将向导多核苷酸、Cas内切核酸酶、以及多核苷酸修饰模板引入细胞中，其中所述Cas内切核酸酶在位于所述细胞基因组中的第一编码序列之内或之外的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包括编码目的蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合导致以下中的任一项，或以下项的任意组合：融合蛋白靶向于所述细胞的叶绿体，蛋白质活性增大，蛋白质功能增加，蛋白质活性减小，蛋白质功能下降，新蛋白质功能，蛋白质功能改变，新蛋白质定位，蛋白质表达的新时间选择，蛋白质表达模式改变，嵌合蛋白，或具有显性表型功能的修饰的蛋白质。在一个实施方案中，可使用本文所公开的向导cas9技术对玉米根蠕虫(crw1)突变(WO2014047505A1，以引用方式并入本文)进行工程化改造。在一个实施方案中，可使用本文所公开的向导cas9技术对玉米根蠕虫(crw2)突变(WO2014047508A1，以引用方式并入本文)进行工程化改造。实施例以下实施例进一步说明本发明，其中份和百分数是以重量计，并且度是指摄氏度，除非另有规定。应当理解，这些实施例虽然说明本发明的实施方案，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可作出本发明的各种变化和修改以使本发明适合于各种应用和条件。此类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。实施例1用于基于玉米植物中的基因组修饰的向导RNA/CAS内切核酸酶的玉米优化的表达盒就基因组工程应用而言，II型CRISPR/Cas系统最小限度地需要Cas9蛋白质和双链的crRNA/tracrRNA分子或合成融合的crRNA和tracrRNA(向导RNA)分子以用于DNA靶位点识别和裂解(Gasiunas等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人，(2012)Science337：816-21，Mali等人，(2013)Science339：823-26，以及Cong等人，(2013)Science339：819-23)。本文描述了如下向导RNA/CAS内切核酸酶系统：基于II型CRISPR/Cas系统并且由Cas内切核酸酶和向导RNA(或双链的crRNA和tracrRNA)组成，所述Cas内切核酸酶和向导RNA一起形成识别植物中基因组靶位点并将双链断裂引入所述靶位点的复合物。为了在玉米中测试向导RNA/CAS内切核酸酶系统，根据本领域中已知的标准技术，对得自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因(SEQIDNO：1)进行玉米密码子优化并引入马铃薯ST-LS1内含子(SEQIDNO：2)，从而消除其在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属中的表达(图1A)。为了有利于Cas9蛋白质在玉米细胞中进行核定位，在Cas9开放阅读框的氨基末端和羧基末端处分别掺入猿猴病毒40(SV40)单组分氨基末端核定位信号(MAPKKKRKV，SEQIDNO：3)和根癌农杆菌二分VirD2T-DNA边界内切核酸酶羧基末端核定位信号(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQIDNO：4)(图1A)。通过标准分子生物学技术将玉米优化的Cas9基因可操作地连接至玉米组成型或调节型启动子。玉米优化的Cas9表达盒的示例(SEQIDNO：5)示出于图1A中。图1A示出由植物遍在蛋白启动子驱动的包含ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位信号(NLS)和VirD2羧基末端NLS的玉米优化的Cas9基因。推荐用于形成用于基因组工程应用的功能性向导RNA/CAS内切核酸酶系统的第二组分为crRNA和tracrRNA分子的双链体或合成融合的crRNA和tracrRNA分子，即向导RNA。为了在玉米中赋予有效的向导RNA表达(或双链的crRNA和tracrRNA的表达)，使用标准分子生物学技术分离出位于8号染色体上的玉米U6聚合酶III启动子(SEQIDNO：9)和玉米U6聚合酶III终止子(SEQIDNO：10的前8个碱基)并将它们可操作地融合至向导RNA的末端(图1B)。开发两种不同的向导RNA构造以在玉米中进行测定：短向导RNA(SEQIDNO：11)，基于Jinek等人，(2012)Science337：816-21；以及长向导RNA(SEQIDNO：8)，基于Mali等人，(2013)Science339：823-26。表达盒的一个示例(SEQIDNO：12)示于图1B中，其示出了驱动长向导RNA表达的玉米U6聚合酶III启动子，该长向导RNA终止于U6聚合酶III终止子。如图2A和图2B所示，向导RNA或crRNA分子还需要包含与长度为约12-30个核苷酸并位于PAM序列(图2A-2B的反义链上的5’NGG3’，对应于图2A-2B的有义链上的5’CCN3’)上游的双链DNA靶标的一条链互补的区域(也称之为可变靶向结构域)，以用于靶位点识别和裂解(Gasiunas等人，(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人，(2012)Science337：816-21，Mali等人，(2013)Science339：823-26，以及Cong等人，(2013)Science339：819-23)。为有利于玉米基因组DNA靶序列快速引入crRNA或向导RNA表达构建体中，采用取向于向外的方向进行裂解，以反向串联取向引入两个IIS型BbsI限制性内切核酸酶靶位点，如Cong等人，(2013)Science339：819-23中所描述的那样。在裂解时，IIS型限制性内切核酸酶从crRNA或向导RNA表达质粒中切除其靶位点，产生突出端，从而使得包含期望的玉米基因组DNA靶位点的双链寡核苷酸能够框内定向克隆到可变靶向结构域中。在该实施例中，仅以G核苷酸起始的靶序列用于促进向导RNA或crRNA的聚合酶III的有利的表达。Cas内切核酸酶基因和向导RNA两者的表达然后允许形成图2B中所示的向导RNA/Cas复合物(SEQIDNO：8)。另选地，Cas内切核酸酶基因、crRNA和tracrRNA的表达允许形成如图2A所示的crRNA/tracrRNA/Cas复合物(SEQIDNO：6-7)。实施例2可通过不完全的非同源端连接复用向导RNA/CAS内切核酸酶系统以同时靶向玉米的多个染色体基因座进行诱变为了测试多个染色体基因座是否可同时采用本文所述的向导RNA/玉米优化的CAS内切核酸酶系统进行诱变，将靶向MS26Cas-2靶位点(SEQIDNO：14)、LIGCas-3靶位点(SEQIDNO：18)和MS45Cas-2靶位点(SEQIDNO：20)的长向导RNA表达盒以及Cas9内切核酸酶表达盒以双链体或三链体共转化到玉米胚中，并且通过深度测序来检查如实施例2所述的不确切NHEJ突变的存在。用Cas9表达盒和对应的向导RNA表达盒共转化的Hi-II玉米胚单独充当阳性对照，而仅用Cas9表达盒转化的胚充当阴性对照。实施例3用于使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统编辑的植物基因组的递送方法该实施例描述了在植物之中或之内分别递送或保持以及表达Cas9内切核酸酶和向导RNA(或单独的crRNA和tracrRNA)的方法，以经由同源重组允许指导DNA修饰或基因插入。更具体地，该实施例描述了各种方法，包括但不限于Cas9内切核酸酶作为DNA、RNA(5′-加帽和聚腺苷酸化的)或蛋白质分子递送。此外，向导RNA可作为DNA或RNA分子被递送。如实施例2所示，当通过基因枪转化未成熟玉米胚而将Cas9内切核酸酶和向导RNA作为DNA载体递送时，观察到较高的突变频率。该公开的其它实施方案可为使Cas9内切核酸酶作为DNA、RNA或蛋白质递送，并且向导RNA作为DNA或RNA分子或作为双链体crRNA/tracrRNA分子(作为RNA或DNA)或它们的组合递送。Cas9(作为DNA载体)和向导RNA(作为DNA载体)实施例的递送也可通过共递送单个或多个农杆菌属载体上的这些DNA盒并通过农杆菌属介导转化来转化植物组织来实现。此外，可首先将包含组成型、组织特异性或条件性调控的Cas9基因的载体递送到植物细胞以允许稳定整合到植物基因组中，从而建立在植物基因组中仅包含Cas9基因的植物品系。在该实施例中，为了产生突变或促进同源重组的目的，当用于靶向整合的HR修复DNA载体与向导RNA共递送时，单个或多个向导RNA、或者单个或多个crRNA和tracrRNA可作为DNA或RNA、或组合被递送到包含Cas9基因的基因组整合型式的植物品系中。作为该实施例的扩展，还可建立包含作为DNA分子的Cas9基因和tracrRNA的基因组整合型式的植物品系。在该实施例中，当用于靶向整合的HR修复DNA载体与crRNA分子共递送时，单个或多个crRNA分子可作为RNA或DNA被递送以促进产生突变或促进同源重组，从而允许植物基因组的单个或多个位点处的定向诱变或同源重组。实施例4在植物中被直接作为RNA递送的向导RNA/CAS内切核酸酶系统的组分该实施例示出了如本文所述的方法的使用和用于植物的染色体基因座的修饰或诱变的实施例7的构造[Cas9(DNA载体)，向导RNA(RNA)]。实施例1所述的玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒与构成靶向玉米基因座和所示序列的短向导RNA的单链RNA分子(由IntegratedDNATechnologies，Inc.合成)通过如实施例2所述的粒子枪进行共递送。仅用Cas9表达盒或短向导RNA分子转化的胚充当阴性对照。在轰击后七天，收获得到未成熟胚，通过深度测序分析如实施例2所述的NHEJ突变。在位点处发现了阴性对照中不存在的突变(图6，对应于SEQIDNO：104-110)。这些突变类似于在实施例2、3、4和6中所发现的那些。该数据指出，本文所述的玉米优化的向导RNA/CAS内切核酸酶系统的组分可直接作为RNA被递送。表1：作为RNA被递送的短向导RNA的玉米基因组靶位点和位置实施例5稀有切割工程改造的大范围核酸酶的产生LIG3-4大范围核酸酶和LIG3-4预期识别序列包含LIG3-4预期识别序列(SEQIDNO：111)的内源性玉米基因组靶位点被选择用于设计稀有切割双链断裂诱导剂(SEQIDNO：112)，如美国专利公布2009-0133152A1(公布于2009年5月21日)所述的那样。LIG3-4预期识别序列为22bp多核苷酸，具有如下序列：ATATACCTCACACGTACGCGTA(SEQIDNO：111)。MS26++大范围核酸酶命名为“TS-MS26”(SEQIDNO：113)的内源性玉米基因组靶位点被选择用于设计定制的双链断裂诱导剂MS26++，如美国专利申请13/526912(提交于2012年6月19日)所述的那样。TS-MS26靶位点是被定位于从玉米MS26基因的第五个外显子的5’端起第62bp的22bp多核苷酸，并具有以下序列：gatggtgacgtac^gtgccctac(SEQIDNO：113)。双链断裂位点和突出端区域以下划线表示，该酶在C13后切割，如^所指示。用于编码经工程改造的MS26++内切核酸酶的经工程改造的内切核酸酶的植物优化的核苷酸序列(SEQIDNO：114)被设计成在所选TS-MS26靶位点处结合并使双链断裂。实施例6玉米未成熟胚的转化可通过各种已知在植物中有效的方法来完成转化，包括粒子介导的递送、农杆菌属介导的转化、PEG介导的递送和电穿孔。a.粒子介导的递送如下使用粒子递送进行玉米未成熟胚的转化。培养基配方见下文。将穗去壳并在30％Clorox漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚分离，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内对准以准备进行轰击。另选地，将分离的胚放置在560L(起始培养基)上，并在暗处在26℃至37℃范围内温度下放置8至24小时，然后在560Y上26℃放置4小时后如上所述进行轰击。使用标准分子生物学技术构建含有双链断裂诱导剂和供体DNA的质粒并与含有发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)的质粒进行共轰击；US20090328252A1)和Wushel(US2011/0167516)。如下使用水溶性阳离子类脂TfxTM-50(Cat#E1811，Promega，Madison，WI，USA)，使质粒和目的DNA沉淀到0.6μm(平均直径)金小球上。使用1μg的质粒DNA和任选的其它构建体在冰上制备DNA溶液以进行共轰击，诸如50ng(0.5μl)含有发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)的每种质粒；US20090328252A1)和Wushel。为了预混合DNA，将20μl制备的金颗粒(15mg/ml)和5μlTfx-50添加到水中并小心混合。使金颗粒在微量离心管中以10,000rpm沉淀1min，并去除上清液。小心地用100ml的100％EtOH漂洗所得的小球而无需重悬小球，小心地去除EtOH洗液。添加105μl的100％EtOH，并且通过简单的超声处理使颗粒重悬。接着，将10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中心上，并且在轰击前使之干燥约2分钟。另选地，使用氯化钙(CaCl2)沉淀过程，通过混合100μl在水中制备的钨颗粒、10μl(1μg)DNA/TrisEDTA缓冲液(1μg总DNA)、100μl2.5MCaC12、和10μl0.1M亚精胺，将质粒和目的DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨小球上。每种试剂依序加到钨颗粒悬浮液，同时进行混合。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且使其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期间，将管短暂离心，去除液体，并将颗粒用500ml100％乙醇洗涤，然后进行30秒离心。再次去除液体，将105μL100％乙醇加至最终的钨颗粒小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒进行短暂超声处理。将10μl的钨/DNA颗粒点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中心上，然后在轰击前使点滴的颗粒干燥约2分钟。用Biorad氦枪以水平#4对样品板进行轰击。所有样品接受450PSI的单次射击，每管的所制备颗粒/DNA共取十个等分试样。在轰击后，将胚在560P(保持培养基)上在26℃至37℃范围内的温度下温育12至48小时，然后置于26℃下。在5至7天后，将胚转移到含有3mg/L双丙氨磷的560R选择培养基，每隔2周在26℃下进行传代培养。在进行大约10周的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(insertsinflats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1周，随后在温室中另外生长1-2周，然后转移到Classic600盆(1.6加仑)并生长至成熟。对植物进行监测并进行转化效率的打分和/或进行再生能力的改变的打分。初始培养基(560L)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)；以及8.5mg/L硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。保持培养基(560P)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l2，4-D和0.69g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)；以及0.85mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。轰击培养基(560Y)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)；以及8.5mg/L硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)；以及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨磷(两者均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。植物再生培养基(288J)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(MurashigeandSkoog，(1962)Physiol.Plant.(《植物生理学》)15：473)、100Mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(调至pH5.6后用精制去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(在将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素原液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(调节pH至5.6后用精制去离子水定容)；以及6g/lbacto-琼脂(在用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。b.农杆菌属介导的转化农杆菌属介导的转化基本上如Djukanovic等人，(2006)PlantBiotechJ4：345-57所述的那样进行。简单地讲，从经灭菌的种仁切下10-12日龄的未成熟胚(尺寸0.8mm-2.5mm)并置于液体培养基(4.0g/LN6基础盐(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson维生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L2，4-D、0.690g/LL-脯氨酸、68.5g/L蔗糖、36.0g/L葡萄糖、pH5.2)中。在收集胚后，用1ml浓度为0.35-0.45OD550的农杆菌替换培养基。将玉米胚与农杆菌在室温下温育5分钟，然后将该混合物倾注到培养基板上，该培养基板含有4.0g/LN6基础盐(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson维生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L2，4-D、0.690g/LL-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.85mg/L硝酸银、0.1nM乙酰丁香酮和3.0g/LGelrite，pH5.8。将胚以胚轴朝下在暗处20℃下温育3天，然后在暗处28℃下温育4天，然后转移到新的培养基板上，该培养基板含有4.0g/LN6基础盐(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson维生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L2，4-D、0.69g/LL-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.5g/LMES缓冲液、0.85mg/L硝酸银、3.0mg/L双丙氨磷、100mg/L羧苄西林和6.0g/L琼脂，pH5.8。将胚每隔三周进行传代培养，直到鉴定出转基因事件。通过将少量的组织转移到再生培养基(4.3g/LMS盐(Gibco11117)、5.0ml/LMS维生素原液、100mg/L肌醇、0.1μMABA、1mg/LIAA、0.5mg/L玉米素、60.0g/L蔗糖、1.5mg/L双丙氨磷、100mg/L羧苄西林、3.0g/LGelrite，pH5.6)来诱导体细胞胚形成，并在黑暗中于28℃温育两周。将所有具有可见苗和根的材料转移到包含4.3g/LMS盐(Gibco11117)、5.0ml/LMS维生素原液、100mg/L肌醇、40.0g/L蔗糖、1.5g/LGelrite(pH5.6)的培养基中并在人造光下于28℃进行温育。一周后，将小植株移至包含相同培养基的玻璃管中并生长，直至它们被取样和/或移植到土壤中。实施例7BBM的瞬时表达增强转化可对转化规程的参数进行修改以确保BBM活性是瞬时的。一种此类方法涉及例如使用化学品PEL以允许进行转录和表达的方式将含BBM的质粒进行沉淀，但又排除随后DNA释放。在一个实施例中，用PEI将BBM质粒沉淀到金颗粒上，同时使用标准的氯化钙方法将待整合的转基因表达盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT为玉米优化的PAT基因)沉淀到金颗粒上。简单地讲，如下使用PEI包覆金颗粒。首先，洗涤金颗粒。称取35mg平均直径为1.0的金颗粒(A.S.I.#162-0010)到微量离心管中，加入1.2ml无水乙醇并漩涡混合一分钟。将管在室温下温育15分钟，然后使用微量离心机在4℃下高速离心15分钟。弃去上清液，加入新鲜的1.2ml乙醇(EtOH)等分试样，漩涡混合一分钟，离心一分钟，再次弃去上清液(重复这一操作两次)。加入新鲜的1.2ml乙醇等分试样，将此悬浮液(金颗粒在乙醇中)在-20℃下保存数周。为用聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)包覆颗粒，将250μl的经洗涤的金颗粒/乙醇混合物离心，然后弃去乙醇。将颗粒在100μl双蒸水中洗涤一次以去除残余乙醇，加入250μl的0.25mMPEI，接着进行脉冲超声处理以使颗粒悬浮，然后将管投入干冰/乙醇浴中以将悬浮液快速冷冻，然后将悬浮液冷冻干燥过夜。此时，干燥的包覆颗粒可在-80℃下保存至少3周。在使用前，将颗粒用2.5mMHEPES缓冲液(pH7.1)的250μl等分试样漂洗3次，进行1次脉冲超声处理，然后每次离心前进行快速漩涡混合。然后将颗粒悬浮于最终体积250μl的HEPES缓冲液中。在连接DNA前将25μl颗粒等分试样加到新管中。为连接未包覆的DNA，将颗粒进行脉冲超声处理，然后加入1μg的DNA(在5μl水中)，接着用Pipetteman上下吹吸几次进行混合，然后温育10分钟。使颗粒简单地旋转(即10秒)，去除上清液，并添加60μlEtOH。将具有PEI沉淀的DNA-1的颗粒在60μl乙醇中洗涤两次。将颗粒离心，弃去上清液，然后将颗粒重新悬浮于45μl水中。为连接第二DNA(DNA-2)，使用TFX-50进行沉淀。将45μl的颗粒/DNA-1悬浮液简单进行超声处理，然后加入5μl的100ng/μlDNA-2和2.5μl的TFX-50。将溶液置于旋转摇荡器上10分钟，在10,000g下离心1分钟。去除上清液，将颗粒重悬于60μl的乙醇中。将溶液点滴到巨载体(macrocarrier)上，并且使用用于PDS-1000的标准规程将其上依序连接了DNA-1和DNA-2的金颗粒递送到10DAPHi-II未成熟胚的小盾片细胞中。对于这个实验，DNA-1质粒含有UBI：：RFP：：pinII表达盒，并且DNA-2含有UBI：：CFP：：pinII表达盒。轰击后两天，观察到CFP和RFP荧光标记两者的瞬时表达，因为在未成熟胚的表面上有多个红色&蓝色细胞。然后将胚置于非选择性培养基上，并且使其生长3周然后对稳定菌落进行打分。在这个3周期间后，观察到10个多细胞的稳定表达的蓝色菌落，相比之下只有一个红色菌落。这表明PEI沉淀可用于有效引入DNA进行瞬时表达，同时大大减少PEI引入的DNA的整合，从而减少表达RFP的转基因事件的恢复。这样，PEI沉淀可用于递送BBM和/或WUS2的瞬时表达。例如，首先使用PEI使颗粒包覆有UBI：：BBM：：pinII，接着使用TFX-50使颗粒包覆有UBI：：moPAT～YFP，然后轰击到未成熟胚的表面上的小盾片细胞中。PEI介导的沉淀导致未成熟胚的表面上的瞬时表达细胞的频率高，而稳定转化株的恢复频率极低(相对于TFX-50方法)。因此，预期PEI沉淀的BBM盒可在经轰击的组织表面(即小盾片表面)上瞬时表达和刺激一阵胚发生生长，但该质粒不发生整合。从Ca++/金颗粒释放的PAT～GFP质粒预期发生整合并以导致转基因事件的实质上改进的恢复的频率表达可选择标记。作为对照处理，将含有UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI沉淀的颗粒与PAT～GFP/Ca++颗粒混合。将来自两个处理的未成熟胚移到含有3mg/l双丙氨磷的培养基上。6-8周后，预期将在PEI/BBM处理中观察到的GFP+、双丙氨磷抗性愈伤组织的频率比对照处理(PEI/GUS)高得多。作为一个可供选择的方法，用PEI将BBM质粒沉淀到金颗粒上，然后引入到未成熟胚的表面上的小盾片细胞中，随后BBM基因的瞬时表达引发胚发生生长的快速增殖。在该诱导生长期间，使用用于玉米的标准方法(参见实施例1)，用农杆菌处理外植体，T-DNA递送到细胞中，引入转基因表达盒诸如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在进行了共培养后，使外植体在正常培养基上恢复，然后移到含有3mg/l双丙氨磷的培养基上。6-8周后，预期将在PEI/BBM处理中观察到GFP+、双丙氨磷抗性愈伤组织的频率比对照处理(PEI/GUS)高得多。通过瞬时表达BBM和/或WUS2多核苷酸产物来“启动”愈伤组织生长可能是可取的。这可通过递送BBM和WUS25′加帽的聚腺苷酸化RNA、含有BBM和WUS2DNA的表达盒、或者BBM和/或WUS2蛋白来完成。所有这些分子可用粒子基因枪来递送。例如，5′加帽的聚腺苷酸化BBM和/或WUS2RNA可容易地使用Ambion公司的mMessagemMachine试剂盒在体外制备。将RNA与含有目的多核苷酸和用于选择/筛选的标记诸如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII的DNA一起进行共递送。预期接收了RNA的细胞将立即开始更快速地分裂，并且这些细胞中的大部分将整合了该农学基因。这些事件可进一步被验证为转基因克隆菌落，因为它们也将表达PAT～GFP融合蛋白(从而将在适当的照明下显示绿色荧光)。然后可对从这些胚再生的植物筛选目的多核苷酸的存在。实施例8修饰ARGOS8基因以改善玉米植物的耐旱性和氮利用效率ARGOS是植物乙烯反应的负调节子(WO2013/066805A1，公布于2013年5月10日)。ARGOS蛋白质靶向乙烯信号转导途径。当在玉米植物中过表达时，ARGOS降低植物对乙烯的敏感性并促进器官生长，从而导致耐旱性(DRT)增大并且氮利用效率(NUE)得到改善(WO2013/066805A1，公布于2013年5月10日)。为了实现最佳的乙烯敏感性，已对驱动转基因玉米植物中Zm-ARGOS8过表达的启动子进行测试。田间试验示出，玉米启动子即Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON(SEQIDNO：460，US6,504,083专利，公布于2003年1月7日；Zm-GOS2为稻GOS2的玉米同源基因。稻GOS2代表来自于水稻(OryzaSativa2)的基因，提供了Zm-ARGOS8的有利表达水平和组织覆盖度，并且转基因植物在干旱胁迫和低氮条件下具有比非转基因对照高的谷物收率(WO2013/066805A1，公布于2013年5月10日)。然而，这些转基因植物包含两种ARGOS8基因——内源性基因和转基因。ARGOS8蛋白质水平因而由这两种基因确定。因为内源性ARGOS8基因在不同近交系中的序列和表达水平不同，所以当转基因整合进不同的品系中时，ARGOS8蛋白质水平将有所不同。此处我们示出诱变(基因编辑)方法来修饰内源性ARGOS8基因的启动子区域，以实现期望的表达模式并消除对转基因的需求。通过用向导RNA/Cas9系统将启动子Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON(SEQIDNO：460；US6,504,083专利，公布于2003年1月7日)插入到Zm-ARGOS8的5’-UTR(SEQIDNO：462)中。Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON片段还在其5’端包括启动子结合位点(SEQIDNO：459)以利于通过PCR进行事件筛选。我们还用Zm-GOS2PRO：：GOS2INTRON(SEQIDNO：460)置换Zm-ARGOS8的天然启动子(SEQIDNO：461)。得到的玉米品系携带新的ARGOS8等位基因，其表达水平和组织特异性将不同于原生形式。我们期望这些品系将重现耐旱性增大且NUE改善的表型，如在Zm-GOS2PRO：Zm-ARGOS8转基因植物中所观察的那样(WO2013/066805A1，公布于2013年5月10日)。这些玉米品系不同于得自常规转基因事件的那些：(1)在基因组中仅存在一个ARGOS8基因；(2)这修饰了位于其天然基因座处的Zm-ARGOS8的型式；(3)基因表达的ARGOS8蛋白质水平和组织特异性完全由编辑的等位基因控制。在诱变期间使用的DNA试剂，诸如向导RNA、Cas9内切核酸酶、转化选择标记以及其它DNA片段并非新生成的ARGOS8等位基因的功能所需要的，并且可通过标准育种方法经由分离从基因组除去。因为启动子Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON拷贝自玉米GOS2基因(SEQIDNO：464)并通过同源重组插入ARGOS8基因座中，该ARGOS8等位基因不能与自然突变体等位基因区分开。A.玉米-GOS2PRO：GOS2INTRON插入到玉米-ARGOS8启动子中为了将Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON插入到玉米ARGOS8基因的5’-UTR中，使用如本文所述的玉米U6启动子和终止子制备向导RNA构建体，gRNA1。向导RNA的5’-端包含19-bp可变靶向结构域，该结构域靶向Zm-ARGOS8的5’-UTR中的基因组靶序列1(CTS1；SEQIDNO；451)(图7)。多核苷酸修饰模板包含Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON，所述Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON侧接来源于CTS1的上游区域和下游区域的两个基因组DNA片段(HR1和HR2，长度分别为370bp和430bp)(图7)。通过用粒子轰击方法将gRNA1构建体、多核苷酸修饰模板、Cas9盒和转化选择标记磷酸甘露糖异构酶(PMI)引入玉米未成熟胚细胞中。用PCR筛选Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON插入的PMI-抗性愈伤组织(图8A和图8B)。鉴定多个愈伤组织事件并使植物再生。插入事件通过用PCR扩增T0植物中的Zm-ARGOS8区域并对PCR产物进行测序加以确认(图8C)。B.用Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON启动子替换Zm-ARGOS8启动子(启动子更换)为了用Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON置换(替换)Zm-ARGOS8的天然启动子，制备向导RNA构建体即gRNA3以靶向位于Zm-ARGOS8起始密码子的710-bp上游的基因组靶位点CTS3(SEQIDNO：453)(图9)。另一种向导RNA即gRNA2被设计成靶向位于Zm-ARGOSO8的5’-UTR中的基因组靶位点CTS2(SEQIDNO：452)(图9)。多核苷酸修饰模板包含源于CTS3的上游区域的400-bp基因组DNA片段，Zm-GOS2PRO：GOS2INTRON和源于CTS2的下游区域的360-bp基因组DNA片段(图9)。使用gRNA3和gRNA2、Cas9盒、多核苷酸修饰模板以及PMI选择标记来转化未成熟胚细胞。通过PCR筛选PMI-抗性愈伤组织来鉴定多个启动子更换(启动子替换)事件，并使植物再生。更换事件通过PCR分析T0植物中的Zm-ARGOS8区域加以确认(图10D)。C.Zm-ARGOS8启动子的缺失为了使Zm-ARGOS8的启动子缺失，我们对获自以上gRNA3/gRNA2实验的PMI-抗性愈伤组织进行筛选以寻找出产生1.1-kbPCR产物的事件(图11A)。鉴定多个缺失事件(图11B)并使植物再生。缺失事件通过用PCR扩增T0植物中的Zm-ARGOS8区域并对PCR产物进行测序加以确认。表2：Argos8cas9变体天然ARGOS8基因不在叶中表达。然而，GOS2表达模式包括叶。测量杂合和纯合的植物中的ARGOS8表达，纯合变体示出比对应的杂合变体高的基因表达。ACC处理增强了GR2HT野生型(WT)植物中支柱根的出现和生长。ACC-处理的ARGOS8-cm1纯合植物产生比WT少的支柱根，这表明乙烯敏感性降低。实施例9使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统使增强子元件缺失本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于使得来自于转基因(已有的、人工的)或内源性基因的启动子元件缺失。启动子元件，此类增强子元件或者通常以多个拷贝(3X＝增强子元件的3个拷贝，图11)引入在驱动基因表达盒的启动子中，以进行性状基因测试或产生转基因植物表达特异性性状。增强子可为但不限于35S增强子元件(Benfey等人，EMBOJ，1989年8月；8(8)：2195-2202，SEQIDNO：513)。在一些植物(事件)中，增强子元件可导致不希望的表型、收率降低、或不期望的目的性状的表达模式的变化。例如，如图11所示，对在其基因组DNA中包含多个位于两个性状盒(性状A和性状B)之间的增强子元件(3个拷贝，3X)的植物进行表征以示出不希望的表型。期望去除增强子元件的额外拷贝，同时使性状基因盒在其整合基因组位置处保持完整。本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于从植物基因组中去除不希望的增强元件。向导RNA可被设计成包含可变靶向区域，靶向邻近增强子中NGG(PAM)的12-30bp靶位点序列。如果Cas内切核酸酶靶位点序列存在于增强子元件的所有拷贝中(诸如三个Cas内切核酸酶靶位点35S-CRTS1(SEQIDNO：514)、35S-CRTS2(SEQIDNO：515)、35S-CRTS3(SEQIDNO：516))，则仅需要一种向导RNA来将Cas内切核酸酶导向至靶位点并立即诱导所有增强子元件中的双链断裂。Cas内切核酸酶可进行裂解以去除一个或多个增强子。向导RNA/CAS内切核酸酶系统可通过农杆菌属或粒子枪轰击引入。另选地，可使用两种不同的向导RNA(靶向两种不同的基因组靶位点)以类似于本文所述的去除(转基因或内源性的)启动子的方式从生物体基因组中去除所有的3X增强子元件。实施例10使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统利用ZmRap2.7减量调控经由操纵早开花表型来缩短成熟期可通过调节玉米ZmRap2.7基因经由调节植物的开花时间表型来缩短总体植物成熟期。植物成熟期的缩短可通过早开花表型获得。RAP2.7是与APETALA2.7相关的首字母缩略词。RAPL是指用作抑制开花转型的AP2-家族转录因子的RAP2.7LIKE和RAP2.7(SEQIDNO：520和521)。转基因表型在沉默或击倒Rap2.7时导致早开花、减小植株高度，但相比于野生型植物令人惊奇地发育出正常的雌穗和雄穗(PCT/US14/26279申请，提交于2014年3月13日)。本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于靶向并诱导位于RAP2.7基因内的Cas内切核酸酶靶位点处的双链断裂。可选择在RAP2.7基因内包含NHEJ的植物并评估缩短成熟期的表型的存在。实施例11使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统调节玉米NPK1B基因的表达以工程改造玉米耐霜性烟草属蛋白激酶1(NPK1)是涉及胞质分裂调控和氧化应激信号转导的分裂素活化的蛋白激酶。已针对玉米幼苗的耐霜性和生殖期测试了与稻NPKL3具有约70％氨基酸相似性的ZM-NPK1B(SEQIDNO：522和SEQIDNO：523)(PCT/US14/26279专利申请，提交于2014年3月13日)。包含由诱导型启动子Rab17驱动的ZM-NPK1B的转基因幼苗和植物具有显著高于对照幼苗和对照植物的耐霜性。基因似乎在冷适应之后并且在大多数事件中于-3℃处理期间被诱导，但水平较低。(PCT/US14/26279专利申请，提交于2014年3月13日)。本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于使NPK1基因的内源性的启动子被胁迫诱导型启动子诸如玉米RAB17启动子阶段(SEQIDNO：524；PCT/US14/26279专利申请，提交于2014年3月13日)替换，因此以胁迫响应的方式调节NPK1B表达并为经调节的玉米植物提供耐霜性。实施例12使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统利用FTM1表达经由操纵早开花表型来缩短成熟期通过表达转基因经由调节植物的开花时间表型来缩短总体植物成熟期。此类表型修饰也可采用另外的转基因或通过育种方法实现。FTM1代表开花转型MADS1转录因子(SEQIDNO：525和526)。其为MADS框转录因子并诱导开花转型。在组成型启动子条件下表达FTM1时，转基因植物表现出早开花和缩短的成熟期，但相比于野生型植物令人惊奇地正常发育出雌穗和雄穗(PCT/US14/26279专利申请，提交于2014年3月13日)。表达FTM1的玉米植物展示出，通过操纵开花转型基因，到开花的时间可显著缩短，从而导致植物成熟期的缩短。因为成熟期通常可描述为从播种到收获的时间，所以期望缩短的成熟期以确保作物可结束于大陆北部干燥气候环境(PCT/US14/26279专利申请，提交于2014年3月13日)。本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于引入增强子元件，诸如CaMV35S增强子(Benfey等人，EMBOJ，1989年8月；8(8)：2195-2202，SEQIDNO：512)，特别是靶向FTM1的内源性启动子的前面，从而增强FTM1的表达，同时保存天然表达的大部分组织特异性和时间特异性，为经调节的植物提供缩短的成熟期。实施例13在植物基因组中插入诱导型响应元件由外部刺激控制的诱导型表达系统对于细胞蛋白质的功能分析以及性状发展是期望的，因为目的基因的表达水平的变化可导致伴随的表型修饰。理想的是，此类系统将不仅介导基因表达的“开/关”状态，而且还允许基因以限定的水平受限表达。本文所述的向导RNA/CAS内切核酸酶系统可用于引入阻遏物/操纵子/诱导物系统的组分以调控生物体的基因表达。阻遏物/操纵子/诱导物系统及其组分在本领域中是公知的(US2003/0186281，公布于2003年10月2日；US6,271,348)。例如但不限于，已发现大肠杆菌的四环素(Tc)抗性系统的组分在真核细胞中起作用并且用于调控基因表达(US6,271,348)。不同类别的tet操纵子的核苷酸序列在本领域中是已知的，参见例如：A类、B类、C类、D类、E类TET操纵子序列表，如US6,271,348的SEQIDNO：11-15。也可将磺酰脲类-响应的阻遏物系统的组分(如描述于US8,257,956，公布于2012年9月4日)引入植物基因组中，以在所述植物中产生阻遏物/操纵子/诱导物系统，其中多肽可特异性结合至操纵子，其中特异性结合由磺酰脲类化合物调控。实施例14使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统通过表达ACS6基因中的反向重复序列经由基因沉默来在玉米中工程改造耐旱性和氮利用效率ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合酶(ACS)基因编码催化乙烯生物合成中的限速步骤的酶。针对改善的玉米的非生物胁迫耐受性，已广泛地测试了包含反向重复序列构型的玉米ACS基因中的一者(ZM-ACS6)的构建体(PCT/US2010/051358，提交于2010年10月4日；PCT/US2010/031008，提交于2010年4月14日)。在干旱和低氮田间条件两者下，由遍在蛋白组成型启动子驱动的包含ZM-ACS6RNAi序列的转多基因玉米事件相对于对照降低了乙烯产生量，并且谷物收率也随之增加(PlantBiotechnologyJournal：2014年3月12日，DOI：10.1111/pbi.12172)。在一个实施方案中，向导RNA/CAS内切核酸酶系统可与共递送的多核苷酸序列结合地使用以将反向ZM-ACS6基因片段插入到玉米基因组中，其中反向基因片段的插入允许反向重复序列(发夹)在体内生成并导致内源性乙烯生物合成基因沉默。在一个实施方案中，反向基因片段的插入可导致在ACS6基因的天然(或修饰的)启动子中和/或天然ACS6基因的天然5’端中形成体内形成的反向重复序列(发夹)。反向基因片段可进一步包括可导致靶向的乙烯生物合成基因的沉默增强的内含子。实施例15调节内源性丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的表达在一个实施方案中，对存在于植物中的内源性STPP的表达水平进行调节。例如，如US20140259225(以引用方式并入本文)中所公开的，玉米STPP通过选择性地影响或一个或多个存在于玉米内源性STPP的启动子区域中的调控元件来调节。在一个实施方案中，驱动编码包含US20140259225的SEQIDNO：1的STPP3多肽的多核苷酸的表达的内源性调控区域通过本文所公开的向导cas9技术来编辑。在另一个实施方案中，驱动编码包含选自US20140259225的SEQIDNO：1-8的序列的STPP的多核苷酸的表达的内源性调控区域通过本文所公开的向导cas9技术来编辑。控制玉米或另一种靶植物中的STPP内源性表达的启动子或其它调控区域的等位基因差异在本领域普通技术人员的技术范围内，从而基于本公开所提供的教导和指导以及在一般基因组编辑文献中可获得的那些来鉴定和设计适当的向导RNA。在一个实施方案中，使包括TATA框或等同形式的特征基序的天然启动子元件按照本文所公开的启动子更换方法被另一种期望的启动子，例如中等组成型启动子或组织优选的启动子替换。在另一个实施方案中，将一个或多个增强子元件插入STPP的编码序列的上游。在一个实施方案中，增强子元件来源于植物。实施例16通过改变显性雄性能育性增加玉米植物的农学特性在一个实施方案中，植物收率通过调节雄性能育性来改善。例如，以核显性方式降低雄性能育性的核苷酸序列的突变公开于US20150167013(以引用方式并入本文)。在一个实施方案中，雄性能育性的降低或使植物雄性不育通过在相对于US20150167013的SEQIDNO：13的第一Met密码子的第118位从G到A的单核苷酸置换来影响，从而导致由MS44基因编码的蛋白质(MS44多肽或MS44蛋白质)中的第37位氨基酸从丙氨酸变为苏氨酸，例如，由编码US20150167013的SEQIDNO：14的SEQIDNO：15表示的显性突变等位基因。玉米MS44基因的单个碱基变化可导致显性雄性不育表型。分泌性信号裂解位点的第38位或第39位的单个氨基酸的密码子变化能够生成所观察的雄性能育性降低的表型。使用本文所公开的Cas9和向导RNA技术，此类突变及其它突变可容易地引入野生型植物中。示例性gRNA靶位点，GCGCGCCGGACCCCAGCGCGG(SEDIDNO：551)，这些氨基酸残基的约70-bp下游，可与Cas9核酸酶一起使用以引入修饰的编码序列，并且重现雄性不育所需的显性突变。另外的向导RNA位点存在于这些残基的周围，诸如GCCTCGTCTTGTGGGGGCTGG(SEQIDNO：552)，约115bp上游；或GCTTACAGCAGTTGGCTTGG(SEQIDNO：553)，约200bp下游。这些位点可用于利用Cas9进行工程改造变化，在那些残基中具有小到一个碱基变化。例如，第38位丙氨酸的密码子可变为缬氨酸(从GCG到ACG)。又如，第39位谷氨酸可变为脯氨酸(从CAG到CCG)。这两种变化均能以核显性方式导致显性不育或雄性能育性降低。类似地，致使显性雄性不育或雄性能育性降低的其它突变可使用本文所提供的向导RNA和cas9技术掺入到植物基因组中。还可使用其它基因组编辑技术，诸如锌指核酸酶、TALEN、定制的大范围核酸酶和寡核苷酸方法。控制玉米或另一种靶植物的本文所公开的任何基因的内源性表达的编码区域或其它调控区域中的等位基因差异在本领域普通技术人员的技术范围内，从而基于本公开所提供的教导和指导以及在一般基因组编辑文献中可获得的那些来鉴定和设计适当的向导RNA。实施例17调节植物中的干旱蛋白质的表达在一个实施方案中，对存在于植物中的内源性XERICO基因的表达水平进行调节以增大耐旱性。例如，如WO2013056000A1(以引用方式并入本文)中所公开的，玉米XERICO基因通过选择性地影响一个或多个存在于玉米内源性XERICO基因的启动子区域中的调控元件来调节。在一个实施方案中，驱动编码XERICO多肽的多核苷酸的表达的内源性调控区域通过本文所公开的向导cas9技术来编辑，XERICO多肽包含选自以下的序列：SEQIDNO：2(ZmXERICOI)、SEQIDNO：m4(ZmXERIC02)、或SEQIDNO：6(ZmXERICOIA)，WO2013056000A1的所有SEQID。在另一个实施方案中，驱动编码XERICO蛋白质的多核苷酸的表达的内源性调控区域通过本文所公开的向导cas9技术来编辑，以用异源性调控元件诸如例如GOS2或稻肌动蛋白启动子元件替换内源性启动子。控制玉米或另一种靶植物中的XERICO内源性表达的启动子或其它调控区域中的等位基因差异在本领域普通技术人员的技术范围内，从而基于本公开所提供的教导和指导以及在一般基因组编辑文献中可获得的那些来鉴定和设计适当的向导RNA。在一个实施方案中，使包括TATA框或等同形式的特征基序的天然启动子元件按照本文所公开的启动子更换方法被另一种期望的启动子，例如中等组成型启动子或组织优选的启动子替换。在另一个实施方案中，将一个或多个增强子元件插入XERICO的编码序列的上游。在一个实施方案中，增强子元件来源于植物。实施例18调节内源性基因表达的同时保持天然表达模式在一个实施方案中，影响天然基因的内源性基因表达可能不利于例如除去天然基因的内源性表达模式的表达。在某些情况下，可能期望保持内源性基因的内源性表达模式，同时通过异源性调控元件经由提供附加或不同的表达来调节表达。例如，将异源性启动子序列插入不影响内源性表达模式的天然基因的上游区域。在一个实施方案中，此类插入可通过提供包含启动子元件和终止子并插入天然基因的非翻译区域的异源性调控盒来实现。在一个实施方案中，新的异源性启动子元件作为非增强内含子的一部分包括在内，并且新插入启动子和天然启动子之间具有足够的间距，由此使得天然启动子的表达模式基本得到保持并且插入的异源性启动子为内源性基因提供了另外的表达模式。在一个实施方案中，异源性启动子可为诱导型启动子。当前第1页1 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