肽核酸单体和低聚体的制作方法

本发明涉及新型肽核酸单体和肽核酸低聚物，其包含被膦酸酯基团取代的二烃基胺侧链，本发明还涉及其制备方法和用途。

背景技术：

肽核酸(pnas)是合成dna/rna的类似物，具有n-(2-氨乙基)甘氨酸结构-见通式(pna)。在通式中，nb表示核酸碱基；n是pna单元数量(n＝0-50)；f和g代表取代基。

pnas通过以下方式制备：在n-乙酰-n-(2-氨乙基)甘氨酸构件模块(pna单体)之间生成肽键。这些单个的n-乙酰-n-(2-氨乙基)甘氨酸构件模块中的每一个都代表pna单元。

pnas的优势是在生理条件下，他们抗水解(酶解)裂解，以序列特异性方式识别互补核酸序列(dna或rna)，并能够高亲和性地结合这些序列。pnas因此被视为生物技术和/或医疗应用中具有吸引力的化合物,例如诊断程序、或反义治疗。

如需作为反义治疗中成功使用的活性物质，在生物体内具有足够生物药效率是至关重要的。反义活性物质必须具有足够数量，从而在靶位点、目标rna或dna处具有疗效。这意味着反义活性物质在给药后必须有足够量首先渗透(i)组织，然后渗透(ii)组织细胞，最终(iii)进入细胞以及细胞隔室直至目标rna或dna，从而达到具有显著治疗程度的反义效应。

然而，pnas与dna相比具有缺点，其难溶于水并难以渗透细胞膜。因此，pnas作为活性物质在生物体反义治疗中的使用受到限制，如bethm.等在antisense&nucleicaciddrugdevelopment(2002)12:65-70)basedoninvestigationsintotheabsorptionorbioavailabilityofpnasinvariousorgansandtissues中阐述的。在他们的调查中，beth等人发现在小鼠腹腔注射给药后，pnas在24小时内又排泄出，其中90％未产生变化。仅2.5％-4.5％的肽核酸被肾脏吸收，而在其他所有器官中，数据实际上显著小于1％。

为了提高pnas的某些性能，例如水溶性、与互补dna或rna的结合性能或者细胞内吸收性能，尤其已被建议在下述通式(pna*)的pna单元的α位置通过引入r基团进行pnas修饰：

例如,天然氨基酸侧链已被建议作为pnas修饰的r基团(püschla.等人,tetrahedronletters39,(1998)4707-4710；us5719262)。尽管通过修饰增加了空间位阻，通过这种方式修饰的pnas与互补dna/rna的键的降解是很少的，如通过pna/dna杂交体熔点测量确定的(püschla.等,loc.cit.)。

具有赖氨酸修饰的基本结构(r＝-(ch2)4-nh2)的pnas展示出改善的水溶性和提高的pna/dna杂交体熔点(us5719262)。然而，这些赖氨酸修饰的pnas的缺点是在吸收后，它们仍然被困在细胞内的胞内核内体中(nielsenp.,quarterlyreviewsofbiophysics38,4(2005),345-350；koppelhusu.等人,antisense&nucleicaciddrugdevelopment(2002)12:51-63)。因此，pnas以这种方式修饰不足以在细胞内结合到rna,因此无法用于治疗性的应用。如r.corradini等人在currenttopicsinmedicinalchemistry,11(12),pp.1535-1554,(2011)观察到的，这类赖氨酸修饰的pnas，如us5719262中描述的，在一些细胞内不被吸收，它们经常被困在囊泡中。在研究细胞的选择中，没有观察到细胞核中的吸收(loc.cit.,p.1543)。

具有精氨酸修饰基本结构的pnas，称为基于胍的肽核酸(gpnas):

已被提议用于改善细胞内的pnas吸收(zhoup.等j.am.chem.soc.(2003)125:6878-6879)。细胞吸收之后，gpnas位于细胞内的内质网并因此能用于结合细胞自身的mrna。然而，在生物体内，系统性给药后，gpnaa仅通过肾脏、肝脏和肿瘤组织吸收(thomass.m.等,acschem.biol.2013february15；8(2):345-352)。这种有限的生物药效性阻碍了gpnas作为治疗剂的更广泛的应用。

ep1157031,ep2041161和poschw.等人，molmed.(2012)18:111-22公开了烷基膦酸酯修饰的pnas，具有r＝-(ch2)n-p＝o(oet)2,(n＝1,2)。用这种方式修饰的pnas能更好的进入细胞并具有比不含该修饰的pnas更好的水溶性。而且，用该方式修饰的pnas能够在hiv的两代病毒中显示药效性。与gpnas相比，这些烷基膦酸酯基团修饰的pnas也具有更好的生物药效性。但是烷基膦酸酯基团修饰的pnas也具有缺点，它们的水溶性取决于核酸碱基序列。因此，举例来说，在序列中包含大量的鸟嘌呤和胞嘧啶基会降低这些pnas的水溶性。这种取决于序列的水溶性使得医疗用途更困难。

为了允许pnas更广泛的作为治疗剂使用，它们必须结合一系列不同的特性：良好的依赖序列的水溶性；良好的细胞吸收性；良好的与dna和/或rna的结合性；良好的生物药效性(在各种组织中生物药效性越好，越可能存在医疗用途)；更长的半衰期(以达到将pna结合至也存在于生物体内的细胞内的dna和/或rna，以获得所需的基因表达调节的效果)；良好的结合至血浆蛋白以支持生物药效性并延长半衰期(结合至血浆蛋白的低聚体在肾脏中不会被快速从血流过滤并通过尿排出)；以及基因表达调节的强有力效果，对于此，良好的细胞吸收性和细胞内分布以及pna与dna和/或rna良好的结合特性也是必需的。

已知的经过修饰的pnas的缺点是它们仅具有以下重要性能的一部分：(i)良好的依赖于序列的水溶性，(ii)良好的细胞吸收性能和细胞内分布，(iii)在尽可能多的与治疗相关的组织中具有良好的生物药效性和较长的半衰期，(iv)与血浆蛋白的良好的结合性，和/或(v)调节基因表达的强有力效果，但它们不具有作为治疗剂广泛应用所需的所有性能。

技术实现要素：

因此，本发明的目标是提供新型的经过修饰的pna单体；以及提供新型的经过修饰的pna低聚体，其具有改善的性能框架，包含作为构件模块的新pna单体。该改善的性能涉及以下性能的组合：(i)良好的依赖于序列的水溶性，(ii)良好的细胞吸收性能和细胞内分布，(iii)在尽可能多的与治疗相关的组织中具有良好的生物药效性和较长的半衰期，(iv)与血浆蛋白的较强的结合性，和(v)调节基因表达的强有力效果。

本发明的另一目标是提供应用上述经过修饰的pna低聚物和包含所述经过修饰的pna低聚物的诊断和治疗性组合物的新方法。

本发明的这方面和其他方面将从下述详细说明和定义的考虑中变得清楚。

本发明涉及到:

[1].一种通式(i)的化合物：

其中，

k代表羧酸活性酯基团或-0-rm；其中rm是h原子、甲基、乙基、烯丙基、苄基、苯基、叔丁基或三甲基硅烷基；

pr代表h原子或氨基保护基团；

#表示是一种不对称c原子；

e是h原子、苯基、杂环、核酸碱基或被核酸碱基保护基团取代的核酸碱基；

r¹是由通式(ii)表示的基团:

其中，

r²是膦酸酯基或膦酸基；

r³是h原子或氨基保护基团；

m代表1到5的整数；以及

h代表0到4的整数；

假设在通式(ii)中m和h的总和:2≤x≤5。

将r¹基团结合至通式(i)的单体化合物骨架造成骨架中r¹和骨架结合点存在不对称中心(#)。在骨架中的每个这种不对称中心(#)可以是r构型或s构型。此处的非对称中心(#)的构型按照cahn-ingold-prelog序列规则定义，且具有进一步的条件，即配体的优先性按如下定义：在不对称中心的氮原子的优先性总为1。不对称中心的羧基的碳原子优先性总为2。不对称中心的r¹基团碳原子优先性总为3。不对称中心的h原子优先性总为4。

术语羧酸活性酯基团是指本领域技术人员已知的羧酸衍生物，其通常用于肽化学以增加羧酸官能团的偶联活性。例如，这类羧酸活性酯基团描述于:o.marder,f.albericio,chimicaoggi,2002,37；n.sewald,h.-d.jakubke,(eds),peptidechemistry,wiley-vchverlag,weinheim2002,chapter4.3peptidebondformation,page197.羧酸活性酯基团的实例是羧酸卤化物、酰基季鏻盐例如三(吡咯烷基)磷羧酸盐(通过与pybrop反应)、酸酐、苯硫基酯、氰甲基酯、硝基酯和二硝基苯基酯、五氟苯酯、氯苯酯、三氯苯酯、五氯苯酯和下述表中的活性酯。

术语氨基保护基指本领域技术人员已知的保护基团，用于有机合成氨基酸或肽，例如三氟乙酰基、羰基氨基甲酸酯(oxocarbamate)、硫代氨基甲酸酯、芴甲氧羰基(fmoc)、苄氧羰基(cbz)、单甲氧基三苯甲基(mmt)、邻苯二甲酰、叔丁氧羰基(boc)、二苯甲氧羰基(bhoc)或者丙烯基氧基羰基(alloc)保护基。

术语核酸碱基是指本领域技术人员已知的碱基，能够与dna碱基或rna碱基配对。核酸碱基的实例包括具有嘌呤基本结构的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和7-甲基鸟嘌呤；或者嘧啶基本机构，如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5,6-二氢尿嘧啶；以及其类似物和生物电子等排体。

术语核酸碱基保护基团是指本领域技术人员已知的保护基团，用于有机合成具有核酸碱基的化合物，例如，乙酰基、异丁酰基、苄氧羰基、二苯甲基、二苯甲氧基羰基(benzhydryloxycarbonyl)、甲氧苯酰、4-叔-丁基苯甲酰基、苄基或二苯基氨基甲酰基。

术语烷基是指饱和的线性或支链烃基，具有1-40个碳原子，优选1-20个碳原子，更优选1-12个碳原子，尤其优选1-6个碳原子，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、2,2-二甲基丁基或正辛基。

术语烯基和炔基(alkinyl)是指至少部分未饱和的线性或支链烃基，具有2-40个碳原子，优选2-20个碳原子，更优选2-12个碳原子，并特别优选的2-6个碳原子，例如乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、异平基或己-2-烯基。优选的，烯基具有一个或两个(尤其优选是一个)双键，炔基具有一个或两个(尤其优选是一个)三键。

术语芳基或ar指芳香基团，其具有一个或多个环，和6-14个环碳原子、优选6-10(特别是6)个环碳原子。具体的实例是苯、萘、联苯。

术语芳烷基是指根据上述定义的包含芳基和烷基、烯基、炔基和/或环烷基的基团，例如芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳环烷基、芳环烯基、烷基芳环烷基和烷基芳环烯基。芳烷基的具体实例为甲苯、二甲苯、均三甲苯(mesitylene)、苯乙烯、1h-茚、四氢化萘、二氢萘、2，3-二氢-i-茚酮、苯基环戊基、环己基苯基、芴以及1，2-二氢化茚。芳烷基优选包含一个或两个芳香环系统(1或2个环)以及一个或两个烷基、烯基和/或炔基，和/或环烷基，所述芳香环系统具有6-10个碳原子，所述烷基、烯基和/或炔基具有1或2至6个碳原子，所述环烷基具有5或6个环碳原子。

术语环烷基是指饱和或部分未饱和(例如环烯基)环基团，其具有一个或多个环(优选1或2个)，并包含3-14个环碳原子，优选是3-10(尤其是3、4、5、6或7)个环碳原子。环烷基的具体实例是环丙基、环丁基、环戊基、螺[4,5]癸烷基(spiro[4,5]decanyl)、降莰基、环己基、环戊烯基、环己二烯基、十氢萘基(decalinyl)、双环[4.3.0]壬基、环戊基环己基或环己-2-烯基基团。

术语烷基环烷基指包含根据上文定义的环烷基以及烷基、烯基或炔基的基团，例如烷基环烷基、环烷基烷基、烷基环烯基、烯基环烷基和炔基环烷基。烷基环烷基优选包含环烷基和一个、两个或三个，优选1或2个烷基、烯基或炔基，该环烷基包含一个或两个环和3-14个，优选3-10个，特别是3、4、5、6或7个环碳原子，所述烷基、烯基或炔基每个具有1或2至6个碳原子；其中优选是c4-c11烷基环烷基，特别优选是c4-c7烷基环烷基。烷基环烷基的具体实例是甲基环丙基(c4)、甲基环丁基(c5)、乙基环丙基(c5)、甲基环戊基(c6)、丙基环丙基(c6)、乙基环戊基(c7)、甲基环己基(c7)、乙基环戊基(c7)或者乙基环己二烯基(c8)。

术语烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基和环烷氧基是指如上所示的烷基、烯基、炔基、烷芳基或环烷基，包含一个或多个-o基团。实例是甲氧基、乙氧基、呋喃、四氢呋喃或4-甲氧基苄基。

术语杂环是指如上所示的环烷基、芳基或芳烷基的一个或多个，优选1、2或3个碳原子被氧、氮或硫原子取代。实例是哌啶基、哌嗪基、吗啉基、乌洛托品基(urotropinyl)、吡咯烷基、四氢苯硫基、四氢吡喃基、四氢呋喃基或2-吡唑啉基。术语杂环也包括例如芳香基，具有一个或多个环，并包含5-14个环原子，优选包含5-10个，尤其优选包含5或6个环原子，其中一个或多个，优选1、2、3或4个环原子是氧、氮或硫环原子。实例为4-吡啶基、2-咪唑基、3-苯基吡咯基、噻唑基、噁唑基、三唑基、四唑基、异噻唑基、吲唑基、吲哚基、苯并咪唑基、哒嗪基、喹啉基(chinolinyl)、嘌呤基、卡唑基、吖啶基、嘧啶基(pyrimidyl)、2，3'-二呋喃基、3-吡唑基和异喹啉基。

术语氨基酸是指羧酸，其中碳原子上的一个或多个氢原子被氨基取代。例如，氨基酸可以是一种α-氨基酸如甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、甲状腺素、dopa和l-鸟氨酸、5-羟基色氨酸、羊毛硫氨酸、β-氯代丙氨酸、2-甲基丙氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、茶氨酸、西瓜子氨酸，也可以是β-氨基酸如β-丙氨酸或γ氨基酸如γ氨基丁酸(gaba)。

*取代位置

其中

在所有情形下，x¹-x⁴分别代表h原子或核酸碱基保护基团；并且x⁵分别是h原子或boc或bhoc保护基团。

[10].在[9]中所述的化合物,其中x¹、x²和x⁴在所有情形下分别代表h原子、乙酰基(ac)、叔丁氧基羰基(boc)、异丁酰(ibu-co)、苄氧羰基(cbz)、(4-甲氧基苯基)-二苯甲基(mmt)、二苯甲氧基羰基(bhoc)、甲氧苯酰(an)或者4-叔-丁基苯甲酰基(tbubz)；

x⁵在所有情形下分别是h原子,或boc或bhoc保护基；和

x³在所有情形下分别是h原子,苄基(bn)或二苯基氨基甲酰基(dpc)。

[11]在[1]至[10]中描述的化合物,其中e表示胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、苯基、n2-乙酰-鸟嘌呤基、n2-异丁酰基-鸟嘌呤基、n2-苄氧羰基-鸟嘌呤基、n2-(4-甲氧苯基)-二苯甲基-鸟嘌呤基、n2-二苯甲氧基羰基-鸟嘌呤基、n2-二-二苯甲氧基羰基-鸟嘌呤基、n2-叔丁氧基羰基-鸟嘌呤基、n2-二-叔丁氧基羰基-鸟嘌呤基、n6-苄氧羰基腺嘌呤基、n6-(4-甲氧基苯基)-二苯甲基-腺嘌呤基、n6-甲氧苯酰-腺嘌呤基、n6-二苯甲氧基羰基-腺嘌呤基、n6-二-二苯甲氧基羰基-腺嘌呤基、n6-叔丁氧基羰基-腺嘌呤基、n6-二-叔丁氧基羰基-腺嘌呤基、o6-苄基鸟嘌呤基、n2-乙酰基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n2-异丁酰-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n2-苄氧羰基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n2-(4-甲氧基苯基)-二苯甲基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤、n2-二苯甲氧基羰基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n4-苯氧基羰基-胞嘧啶基、n4-(4-甲氧基苯基)-二苯基-甲基-胞嘧啶基、n4-4-叔丁基苯甲酰基-胞嘧啶基、n4-二苯甲氧基羰基-胞嘧啶基、n4-二-二苯甲氧基羰基-胞嘧啶基、n4-叔丁氧基羰基-胞嘧啶基、n4-二-叔丁氧基羰基-胞嘧啶基、n2-二苯甲氧基羰基-假异胞嘧啶基、n2-(4-甲氧基苯基)-二苯甲基-假异胞嘧啶基、n2-4-叔丁基苯甲酰基-假异胞嘧啶基、n2-二苯甲氧基羰基-假异胞嘧啶基、n2-二-二苯甲氧基羰基-假异胞嘧啶基、n2-叔丁氧基羰基-假异胞嘧啶基、n2-二-叔丁氧基羰基-假异胞嘧啶基。

[12].在[1]至[11]中描述的化合物,其中e表示胸腺嘧啶基、鸟嘌呤基、苯基、n2-苄氧羰基-鸟嘌呤基、n2-二苯甲氧基羰基-鸟嘌呤基、n2-叔丁氧基羰基鸟嘌呤基、n2-苄氧基羰基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n2-二苯甲氧基羰基-o6-二苯氨基甲酰基-鸟嘌呤基、n6-苄氧基羰基-腺嘌呤基、n6-二苯甲氧基羰基-腺嘌呤基、n6-叔丁氧基羰基-腺嘌呤基、n6-二-叔丁氧基羰基-腺嘌呤基、n4-苄氧羰基-胞嘧啶基、n4-二苯甲氧基羰基-胞嘧啶基、n4-二-叔丁氧基羰基-胞嘧啶基、n2-苄氧羰基-假异胞嘧啶基、n2-二苯甲氧基羰基-假异胞嘧啶基或n2-叔丁氧基羰基-假异胞嘧啶基。

[13].在[1]至[12]中描述的化合物,其中r²表示膦酸酯基团，通式为-p(＝o)(ov)2或-p(＝o)(ov)(oh)；并且每个v分别代表未被取代的c1-c7烷基、c3-c7环烷基,c4-c7烷基环烷基、苯基或苄基。

[14].在[13]中描述的化合物,其中每个v独立地代表甲基、乙基、环己基、或苄基。

[15].在[14]中所述的化合物,其中v在每种情况下都代表乙基。

[16].在[1]至[15]中所述的化合物,其中r³是h原子。

[17].在[1]至[15]中所述的化合物,其中r³代表羰基氨基甲酸酯(oxocarbamate)、硫代氨基甲酸酯、mmt保护基团。

[18].在[17]中所述的化合物,其中r³代表cbz,alloc,bhoc或boc保护基团。

[19].在[1]至[18]中所述的化合物,其中m是1、2、3或4。

[20].在[1]至[19]中所述的化合物,其中h是0、1、2或3。

[21].在[1]至[20]中所述的化合物,其中r¹代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

[22].在[1]至[15]、[19]或[20]中所述的化合物,其中r¹代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nr³-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nr³-ch2-ch2-p＝o(oet)2，并且r³如[17]或[18]中定义的。

根据本发明式(i)所示的化合物，如[1]至[22]中所述的，可以用于制备新型低聚化合物。因此,该发明还涉及到:

[23].一种化合物，包括通式(iii)的至少一个重复单元:

-[yd-zf-yg-zj]n-(iii)

其中，

每个y在每种情况下独立地代表通式(iv)的基团：

每个z在每种情况下独立地代表通式(v)的基团：

其中，

每个e在每种情形下独立的代表h原子、苯基、杂环或核酸碱基；

#表示是一种不对称c原子；

每个r⁴¹在每种情形下分别代表h原子,或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；

每个r¹¹代表基团-(ch2)m-nh-(ch2)h-ch2-r¹²；其中r¹²在每种情形下为膦酸酯基团或膦酸基团；m表示1-5的整数；h表示0到4的整数；假设m和h的总和:2≤x≤5；

d在每种情形下代表0到5的整数；

f在每种情形下代表0到5的整数；

g在每种情形下代表0到5的整数；

j在每种情形下代表0到5的整数；

n在每种情形下代表1到10的整数；

假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在通式(iii)中的总和≤40并且至少一个变量f或j是1到5的整数。

如果重复单元例如式(iii),基团例如z或y，或取代基或变量例如e、r¹¹或r⁴¹在上述式中出现不止一次，不管是否明确指出，每个重复单元、在重复单元中的每个基团、和每个取代基或每个变量分别独立于彼此。例如,在式(iii)中，每个基团z和y和每个变量e、r¹¹或r⁴¹，彼此独立。换言之,本发明通式(iii)包含至少一种单体单元z,如上文所述,或例如定义在[1]至[22]中的,并且最大总量为40个单元z或z和y。

例如,在通式(iii)中，每个基团y和z,以及每个变量d、f、g和j是独立选择的。因此,在组合[yd-zf-yg-zj]n且d、f、g和j＝1；n＝10中，例如代表单元y和z的下述组合:-[y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z-y-z]-,其中y和z单元的数量总和等于40。在组合[yd-zf-yg-zj]n且d＝3、f＝1、g＝1并且j＝3；n＝3中，例如代表单元y和z的下述组合:-[y-y-y-z-y-z-z-z-y-y-y-z-y-z-z-z-y-y-y-z-y-z-z-z]-,其中y和z单元的数量总和等于24。

但是，变量d、f、g和j在各自的重复单位[yd-zf-yg-zj]中也可能彼此是不同的。例如,下面的4个重复单元的[yd-zf-yg-zj]：(y1-z1-y1-z1),(y1-z1-y0-z0),(y5-z1-y0-z0),(y1-z1-y1-z1),即n＝4,可结合在下述y和z基团的组合中：-[y-z-y-z-y-z-y-y-y-y-y-z-y-z-y-z]-；y和z基团的总和等于16。例如,下面的3个重复单元[yd-zf-yg-zj]：(y5-z1-y1-z1),(y1-z1-y0-z0),和(y1-z1-y5-z0)(即n＝3)可以结合如下:-[y-y-y-y-y-z-y-z-y-z-y-z-y-y-y-y-y]-；y和z基团的总和等于17。在本文中，根据通式(iii)，不管是否明确指明，包含在重复单元中的每个基团，或者在重复单元中出现不止一次的基团或变量在每种情形下单独地选自上述定义。

本发明还包括:

[24].通式(vi)代表的化合物:

其中，

在每种情形下，e、y、z、d、f、g、j和n是独立的，如[23]所定义的；假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在通式(vi)中的总和≤40并且至少一个变量f或j代表1-5的整数；

r³¹代表h原子；或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；或者基团-(ch2)m-nh-(ch2)h-ch2-r¹²；其中r¹²是膦酸酯基团或膦酸基团；m表示1-5的整数；h表示0到4的整数；假设m和h的总和：2≤x≤5；

r⁴⁷在每种情形下分别代表h原子；下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；式(ixb)基团：

通式(ixc)基团:

通式(ixd)基团:

或通式(ixe)基团:

p在式(ixb)、(ixc)、(ixd)、和(ixe)代表数字3或4；

t代表0到10的整数；

l代表-nr^dr^e-nhnr^dr^e或-or^f；其中r^d，r^e和r^f在每种情形下独立代表h原子；或烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基或环烯基，在每种情形下多达20个碳原子；

u代表-nr^ar^b；-n^⊕r^ar^br^c；—nr^a(co)r^b；-nh(co)nhr^b；-nh(co)or^b；式(viiia)基团:

通式(viiib)基团:

通式(viiic)基团:

通式(viiid)基团:

或通式(viiie)基团:

q在式(viiib)、(viiic)、(viiid)、和(viiie)中表示数字3或4；

或通式(vii)基团:

其中，

b代表h原子、-nr^hrⁱ、-n^⊕r^hrⁱr^j、-nr^h(co)rⁱ-nh(co)nhrⁱ、-nh(co)orⁱ、苯基、或用1-3个取代基取代的苯基、取代基选自oh、f、cl、br、i和no2；

在每种情形下，每个r^a、r^c、r^h和r^j在每种情形下独立地代表h原子、甲基或氨基保护基；

在每种情形下每个r^b和rⁱ独立的代表h原子；氨基保护基；烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基或者环烷氧基，在每种情形下高达40个碳原子；其中在烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基或环烷氧基中，在每种情形下，一个或多个氢原子独立的被膦酸酯基团或膦酸基团、f、cl、br、i、-oh、o-ch3、s-ch3、no2、＝o、nh2、-s(o2)nh-、-nhch3、-n(ch3)2、c1-c6烷基,c2-c6烯基、c2-c6炔基、c3-c10环烷基、c6-c10芳基或者c7-c12芳烷基取代；

r⁴⁸和每个r⁴⁶在每种情形下分别代表h原子，或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，或式(ixb)、(ixc)、(ixd)或(ixe)基团；以及

s是从0到10的整数；

[25].在[23]或[24]中描述的化合物,假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在式(iii)或(vi)中的总和≤30。

[26].在[23]至[25]中描述的化合物,假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在式(iii)或(vi)中的总和：7≤x≤30。

[27].在[23]至[26]中描述的化合物，假设在式(iii)或(vi)中比率(重复单元zf和zj总和):(所有重复单元yd、zf、yg和zj总和)：0.1≤x≤1.0。

[28].在[23]至[26]中描述的化合物，假设在通式(iii)或(vi)中比率(重复单元zf和zj总和):(所有重复单元yd、zf、yg和zj总和)：0.1≤x≤0.8。

[29].在[23]至[26]中描述的化合物，假设在通式(iii)或(vi)中比率(重复单元zf和zj总和):(所有重复单元yd、zf、yg和zj总和)：0.1≤x≤0.6。

[30].在[23]至[26]中描述的化合物，假设在通式(iii)或(vi)中比率(重复单元zf和zj总和):(所有重复单元yd、zf、yg和zj总和)：0.1≤x≤0.5。

[31].在[23]至[26]中描述的化合物，假设在通式(iii)或(vi)中比率(重复单元zf和zj总和):(所有重复单元yd、zf、yg和zj总和)：0.1≤x≤0.4。

[32].在[23]至[31]中描述的化合物,其中每个e在每种情形下独立代表腺嘌呤基、胞嘧啶基、假异胞嘧啶基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基或苯基。

[33].在[23]至[32]中描述的化合物，其中每个r⁴¹在每种情形下分别代表h原子或下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸。

[34].在[23]至[33]中描述的化合物，其中每个r⁴¹在每种情形下分别代表h原子或下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

[35].在[23]至[34]中所述的化合物,其中每个r⁴¹在每种情形下代表h原子。

[36].在[23]至[34]中描述的化合物,其中每个r¹²在每种情形下表示膦酸酯基团，通式为-p(＝o)(ov)2或-p(＝o)(ov)(oh)；并且每个v在每种情形下分别代表未被取代的c1-c7烷基、c3-c7环烷基,c4-c7烷基环烷基、苯基或苄基。

[37].在[36]中描述的化合物,其中每个v在每种情形下独立地代表甲基、乙基、环己基、或苄基。

[38].在[36]或[37]中所述的化合物,其中v在每种情况下都代表乙基。

[39].在[23]至[38]中所述的化合物,其中每个m分别是1、2、3或4。

[40].在[23]至[39]中所述的化合物,其中每个h分别是0、1、2或3。

[41].在[23]至[40]中所述的化合物,其中每个r¹¹代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

[42].在[23]至[41]中所述的化合物,其中每个d分别是0、1、2、3或4。

[43].在[23]至[42]中所述的化合物,其中每个f分别是0、1、2、3或4。

[44].在[23]至[43]中所述的化合物,其中每个g分别是0、1、2、3或4。

[45].在[23]至[44]中所述的化合物,其中每个j分别是0、1、2、3或4。

[46].在[23]至[45]中所述的化合物,其中n是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

[47].在[24]至[46]中所述的化合物,其中r³¹代表h原子，下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸，下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

[48].在[24]至[47]中所述的化合物,其中r³¹代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

[49].在[24]至[47]中描述的化合物，其中r³¹代表h原子或下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

[50].在[24]至[47]或[49]中所述的化合物,其中r³¹代表h。

[51].在[24]至[50]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别代表h原子；下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸；或者式(ixb)、(ixc)、(ixd)或(ixe)基团。

[52].在[24]至[51]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别代表h原子；或下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

[53].在[52]中所述的化合物,其中r⁴⁷在每种情形下代表h原子。

[54].在[52]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别代表下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

[55].在[24]至[54]中所述的化合物,其中t是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

[56].在[24]至[51]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别代表h原子；或(ixb)、(ixc)、(ixd)或(ixe)基团；并且t＝1、2、3、或4。

[57].在[56]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别代表(ixb)、(ixc)、(ixd)或(ixe)。

[58].在[24]至[57]中描述的化合物，其中l代表-oh、-nh2、-nhnh2、-o(c1-c10)烷基、-o(c2-c10)烯基、-o(c2-c10)炔基、-o(c3-c10)环烷基、-o(c4-c11)烷基环烷基、-o(c6-c10)芳基、-o(c7-c12)芳烷基、-nh-(c1-c10)烷基、-nh(c2-c10)烯基、nh(c2-c10)环烯基、-nh(c3-c10)环烷基、-nh(c6-c10)芳基、或-nh(c7-c12)芳烷基。

[59].在[24]至[58]中所述的化合物，其中l代表-oh、-oet、-nh2或-nhnh2。

[60].在[24]至[59]中描述的化合物,其中u代表-nr^ar^b；-nr^a(co)r^b；-nh(co)nhr^b；或-nh(co)or^b；r^a在每种情形下代表h原子或甲基；并且r^b如[24]中所定义的。

[61].在[60]所述的化合物,其中r^b在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下具有多达30个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯基团或磷酸基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[62].在[60]所述的化合物,其中r^b在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下可具有多达20个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯、或磷酸、基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[63].在[60]所述的化合物,其中r^b在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下可具有多达12个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯基团或磷酸基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[64].在[24]至[59]中所述的化合物,其中u表示通式(vii)的基团；b-nr^hrⁱ、-nr^h(co)rⁱ、-nh(co)nhrⁱ、或-nh(co)orⁱ；r⁴⁸是h原子；每个r⁴⁶在每种情形下单独代表h原子、或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸；r^h和rⁱ如[24]所定义。

[65].在[24]至[59]中所述的化合物,其中u表示通式(vii)的基团；b-nr^hrⁱ、-nr^h(co)rⁱ、-nh(co)nhrⁱ、或-nh(co)orⁱ；r⁴⁸代表式(ixb)至(ixe)的基团；每个r⁴⁶在每种情形下单独代表h原子、或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸；r^h和rⁱ如[24]所定义。

[66].在[64]或[65]中所述的化合物,r^h代表h原子或甲基。

[67].在[64]至[66]中所述的化合物,其中rⁱ在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下具有多达30个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯基团或磷酸基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[68].在[64]至[66]中所述的化合物,其中rⁱ在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下具有多达20个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯基团或磷酸基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[69].在[64]至[66]中所述的化合物,其中rⁱ在每一种情况下表示h原子、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下可具有多达12个c原子；其中烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、烷基环烷基、环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、烷氧基芳基、或环烷氧基，在每种情形下，一个或多个h原子独立的被膦酸酯基团或磷酸基团、f、cl、br、i、-oh、或no2取代。

[70].在[24]至[59]中所述的化合物,其中u代表通式(vii)的基团；b代表h原子、苯基或用1-3个取代基取代的苯基、取代基选自oh、f、cl、br、i和no2；r⁴⁸是h原子；并且每个r⁴⁶在每种情形下单独的代表h原子或下述氨基酸的侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸。

[71].在[64]至[70]中所述的化合物，其中每个r⁴⁶在每种情形下分别代表h原子,或下述氨基酸的侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。

[72].在[64]至[70]中所述的化合物，其中每个r⁴⁶在每种情形下分别代表h原子,或下述氨基酸的侧链：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、或酪氨酸。

[73].在[64]至[72]中所述的化合物,其中s是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

[74].在[24]至[59]中所述的化合物,其中u代表通式(vii)的基团；b代表h原子、苯基或用1-3个取代基取代的苯基、取代基选自oh、f、cl、br、i和no2；r⁴⁸是h原子；每个r⁴⁶在每种情形下单独的代表h原子或式(ixb)至(ixe)的基团；且s＝1、2、3或4。

[75].在[74]中描述的化合物，其中r⁴⁶在每种情形下分别代表式(ixb)、(ixc)、(ixd)或(ixe)基团。

[76].在[24]至[59]中所述的化合物，其中u代表式(viiia)至(viiie)的基团。

[77].在[24]至[46]中所述的化合物，其中r³¹代表h原子或-(ch2)m-nh-(ch2)h-ch2-r¹²，其中r¹²代表式-p(＝o)(ov)2或p(＝o)(ov)(oh)的膦酸酯基团；每个v独立的是甲基、乙基、环己基、或苄基；m是1、2、3或4；并且h是0、1、2或3；假设m和h之和为：2≤x≤5。

[78].在[77]中描述的化合物，其中r⁴⁷在每种情形下分别是h原子；或下述氨基酸的侧链：赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸；

t＝0、1、2、3、4、5、6、7或8；

l代表oh、oet、nh2或-nhnh2；

u代表通式(vii)的基团:

其中b代表h原子、苯基或用1-3个取代基取代的苯基、取代基选自oh、f、cl、br、i和no2；r⁴⁸是h原子；并且

(i)每个r⁴⁶在每种情形下分别代表h原子,或下述氨基酸的一侧链：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸；s是0、1、2、3、4、5、6、7或8；或

(ii)每个r⁴⁶在每种情形下单独的代表h原子或者式(ixb)至(ixe)的基团；并且s＝1、2、3或4。

[79].在[24]、[25]、[27]至[78]中描述的化合物,假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在通式(vi)中的总和：7≤x≤25。

[80].在[24]、[25]、[27]至[78]中描述的化合物,假设所有重复单元yd、zf、yg和zj在通式(iii)或(vi)中的总和：7≤x≤22。

[81].在[77]至[80]中所述的化合物,其中每个r¹¹代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

[82].在[77]至[81]中所述的化合物,其中每个r³¹代表h原子或下式基团：-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2，或者代表下式基团：-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2。

如[23]至[76]或[77]至[82]所述的通式(iii)和(vi)的化合物，包含至少基团z。因此，本发明[23]至[76]或[77]至[82]所述的通式(iii)和(iv)的化合物在r¹¹结合到基础结构的结合位点具有至少一个不对称中心(#)。在r¹¹结合到基础结构的结合位点的不对称中心(#)优选具有r构型。

如[23]至[76]或[77]至[82]所述的通式(iii)和(vi)的化合物中存在两个或多个不对称中心(#)，至少50％的不对称中心(#)，优选66％、70％、75％或80％,更优选85％、90％或95％、最优选100％具有r构型。

或者，在具有两个或多个不对称中心(#)的通式(iii)和(vi)中，如[23]至[76]或[77]至[82]中所描述的，至少50％的不对称中心(#)，优选66％、70％、75％或80％,更优选85％、90％或95％、最优选100％具有s构型。

本发明也公开了药物组合物，包含至少一种(或多种)本发明的低聚化合物，并可选的包含至少一个载体，如果需要可结合常规的耐药非活性组分和/或填料，和/或至少一种赋形剂。

本发明的低聚化合物作为药物或药品的用途也是本发明的目的。通常而言，本发明的化合物使用已知的和可接受的方法单独或结合其他治疗工具给药。例如给药方式可以是以下方式中的一种：口服，例如作为糖衣丸、包衣片、药丸、半固体、软或硬胶囊、溶液、乳剂或悬浮液；肠道外给药例如作为注射溶液；直肠给药例如栓剂；通过吸入给药，例如粉剂或喷剂，经皮或鼻内给药。为了制备这些药片、药丸、半固体、包衣片、糖衣丸和硬胶质胶囊，药学上可用的产品可与药学惰性的、无机或有机载体混合，例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、胶质、麦芽、硅胶、淀粉及其衍生物、滑石、硬脂酸及其盐、干燥的脱脂乳粉等。为了生产软胶囊，可使用载体例如植物油、液状石蜡、动物或合成油、蜡、脂肪和/或多元醇。为了制备液体溶液和糖浆剂，可使用载体如水、醇、盐的水溶液、葡萄糖溶液、多元醇、甘油、植物油、液状石蜡、动物和/或合成油。为了生产栓剂，可使用载体例如植物油、液状石蜡、动物油和/或合成油、蜡、脂肪和/或多元醇。为了生产气雾剂，可使用适合于该目的的压缩气体，例如氧气、氮气、氯氟化碳、氯化氢、氯化烃类和二氧化碳。药学上可用的试剂可包含用于保存和稳定的添加剂、乳化剂、甜味剂、香料、用于调节渗透压的盐、缓冲液、封装剂和/或抗氧剂。

通过其结合至互补核酸序列的能力，本发明的低聚化合物或药物组合物可用于预防和/或处理许多不同的疾病。可利用本发明低聚化合物预防或治疗的疾病的实例是：由病毒引起的疾病，例如人免疫缺陷综合症(hiv)、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒或人乳头状瘤病毒(hpv)；癌症，例如皮肤癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、白血病或脑瘤、罕见神经肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良或脊髓性肌萎缩；炎症疾病例如哮喘、类风湿关节炎、或牛皮癣；自免疫疾病如克罗恩病或多发性硬化；神经疾病如帕金森病或代谢症状如高胆固醇或肥胖。

本发明的低聚化合物，即通式(iii)或(vi)的低聚化合物(本文也指n-p(n-phos)低聚物)，与ep2041161公开的具有烷基膦酸酯基团的低聚物(下文称为：ep2041161低聚物)相比，表现出意外的和改良的特性，例如在各种治疗相关的器官中具有明显改善的生物药效率和更长的半衰期。例如，这在比较组织分布研究中可以观察到，其中各小鼠被分别给予低聚化合物并且在18个治疗相关器官中测量其数量(见实例14和图1和2)。

还被观察到n-p低聚物与ep2041161低聚物相比具有更强的结合到血浆蛋白的能力(见实例15)；这对生物药效率是有利的，并延长了半衰期。

与ep2041161低聚物相比，本发明的n-p低聚物也具有显著改善的取决于序列的水溶性(见实例16)。

还进一步观察到本发明的n-p低聚物具有更好的与dna的结合特性(更高的熔点)(见实例17)。

与ep2041161低聚物相比，本发明的n-p低聚物还意外的展示出对基因表达调节的明显更大的影响。例如，对基因表达调控的更大的影响通过hela细胞中nfkb的下调(见实例18)以及thp1细胞中的tnfr2基因的剪接位点调控(见实例19)反映。

本发明n-p低聚物和ep2041161低聚物和us5719262低聚物对在thp1细胞中目标tnfr2的剪接位点调控方面的功效比较确认了本发明n-p低聚物在基因表达调控方面具有更大的影响。us5719262低聚物几乎没有影响，这与r.corradini等人(currenttopicsinmedicinalchemistry,11(12),pp.1535-1554,(2011))的观察一致，即us5719262低聚物展示出更强的在细胞囊泡积累趋势，因而没有充足的量用于胞液或核中的mrna目标位点的反义效应，(见实例21和图3)。

n-p低聚物对生物体基因表达的调控的强大效果从小鼠脾脏和淋巴结中的tnfr2基因的剪接位点调控也是显而易见的(实例20)。更强有力的影响也可在本发明各种n-p低聚物的肺(见实例22和图4和实例23和图5)、肾(见实例23和图5和实例24和图6)、肝脏(见实例23和图5)和肌肉(见实例25和图7)中观察到。在小鼠的肾中，与ep2041161低聚物相比，本发明n-p低聚物在tnfr2基因的剪接位点调控中展示出高达12.6倍的强有力效果(见实例24和图6)。在小鼠肌肉中，展示出了本发明n-p低聚物对肌营养不良基因(23号外显子跳跃)的基因表达调控的强有力影响(见实例25和图7)。

目标nf-kappab和tnfr2在免疫细胞tnf-α信号传导通路中起到重要作用。脾脏和淋巴结是免疫系统的重要器官。因此本发明的低聚化合物(n-p低聚物)适合免疫系统介导疾病的治疗，如炎性疾病、自免疫疾病或癌症。

本发明通式(i)的单体可通过本领域技术人员已知的反应制备。例如，本发明通式(i)的单体(其中不对称中心(#)具有r-构型并且r³是cbz保护基)可通过以下合成模式制备(更详细的描述见实例1-10)：

为了制备本发明通式(i)的在不对称中心(#)具有s构型的单体(本次也称为n-p单体)，在氢化过程中，使用(s,s)-me-duphos-rh(i)(cod)2otf催化剂而非(r,r)-me-duphos-rh(i)(od)2otf催化剂。

本发明具有通式(iii)或(vi)的低聚化合物可通过文献中描述的使本发明通式(i)反应的方法制备，或者可能的进一步与pna单体或氨基酸以其自身已知的方式反应的方法制备(例如，l.christensen,r.fitzpatrick,b.gildea,k.h.petersen,h.f.hansen,t.koch,m.egholm,o.buchardt,p.e.nielsen,j.coull,r.h.berg,j.pept.sci.3,1995,175-183.t.koch,h.f.hansen,p.andersen,t.larsen,h.g.batz,k.otteson,h.j.pept.res.49,1997,80-88.f.bergmann,w.bannwarth,s.tam,tetrahedronlett.36,1995,6823-6826)。在固相合成后，保护基团被分离，从而获得本发明低聚化合物，例如通式(iv)的化合物。

附图说明

图1：本发明³h标记的n-p低聚物和³h标记的ep2041161低聚物在14天内在各种组织中的生物药效率。从图可见，在所有组织中，在14天内，³h标记的n-p低聚物的生物药效率是³h标记的ep2041161低聚物的1.7-4.6倍。

图2：本发明³h标记的n-p低聚物和³h标记的ep2041161低聚物在14天内的半衰期。图2显示了在14天内，³h标记的n-p低聚物的半衰期在大多数组织中比³h标记的ep2041161低聚物大，在脾脏中大2倍。

图3：本发明n-p低聚物和ep2041161及us5719262低聚物在thp1细胞的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控中的效力比较。图3显示了相对于ep2041161低聚物，n-p低聚物在thp1细胞中的目标tnfr2的剪接位点调控中具有2.6倍的更强效果，而us5719262低聚物对thp1细胞中的目标tnfr2的调控几乎为零。

图4：本发明具有不同基团u的n-p低聚物对小鼠肺的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控的影响。图4显示了当本发明的具有通式vii的基团u或ixc(胆固醇衍生物)或ixd(叶酸衍生物)基团的通式(vi)的n-p低聚物作为r⁴⁶使用时，与pbs阴性对照相比，其对剪接位点调控的基因表达的影响增加了560倍(胆固醇衍生物)或378倍(叶酸衍生物)。

图5：本发明的n-p23-1,n-p23-2,n-p23-3和n-p23-4的n-p低聚物对小鼠肾、肝脏、肺中的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控的影响。本发明的n-p23-1,n-p23-2,n-p23-3和n-p23-4的n-p低聚物在核酸碱基序列、基团u、和通式(iv)和(v)的基团的数量和位置的不同。图5显示了本发明的n-p23-1,n-p23-2,n-p23-3和n-p23-4的n-p低聚物在各种小鼠组织(肾、肝脏和肺)中展示出对没有外显子7的mrna亚型的基因表达的影响。例如，在肾中，相对于pbs阴性对照，n-p23-1的影响增加了1983倍。

图6：在本发明n-p低聚物和ep2041161低聚物在小鼠肾中的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控中的效力比较。测试的低聚物首先yd、zf、yg和zj(15或14)所有重复单元之和不同，然后通式(iv)和(v)的基团的数量和位置不同。图6显示了n-p低聚物对没有外显子7的mrna亚型的基因表达的影响，通过与ep2041161低聚物的直接比较，n-p低聚物是ep2041161低聚物的12.6或6.7倍。

图7：本发明具有20个构件模块(通式(vi)的yd、zf、yg和zj所有重复单元之和为19)的n-p低聚物对mdx小鼠肌肉中的目标肌营养不良蛋白(外显子23跳跃)的剪接位点调控的体内影响。图7显示了本发明n-p低聚物在15天短期实验中，仅注射三次至肌肉中，其对没有外显子23的mrna亚型的基因表达的影响是pbs对照组的9倍。

具体实施方式

实例1：化合物1制备

描述：溶于300ml甲醇的66.52g(200mmol)2-n-cbz-氨基-2-(二甲氧基磷酰基)-乙酸甲酯与2.13gpd/c10％(相当于1mol％pd)混合并在室温下、在2bar的氢气压下搅动24小时。通过硅藻土(celite)过滤催化剂，然后从滤液中蒸发掉溶剂。获得的产品是浅黄色油，然后让其静置变成蜡状固体。

得率：39g,99％。¹h-nmr(dmso-d6):4.01(d,1h),3.66-3.73(m,9h),2.4-2.5(s,br,2h).³¹p-nmr(dmso-d6):23.6ppm。

实例2：化合物2制备

描述：将39g(198mmol,1eq)化合物1溶解在1000ml二氯甲烷中。加入56.178g(257mmol,1.3eq)boc2o和16.1ml(198mmol,1eq)吡啶。在室温下搅动该混合物48个小时。在旋转蒸发器中除去溶剂，残留物吸收于乙酸中并用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸钠溶液和饱和盐溶液洗涤。然后用碳酸镁干燥和蒸发。用急骤层析(硅胶、己烷/乙酸乙酯1:5)纯化剩余产物。得到黄色油。

得率：43.5g(146mmol,74％)。¹h-nmr(cdc13):5.35(d,br,1h),4.88(dd,1h),3.80-3.86(m,9h),1.46(s,9h).³¹p-nmr(cdc13):20.1ppm

实例3：化合物3制备

描述：将50g(319mmol，leq)4-氨基丁醛乙醛缩二乙醇在室温下溶解在200mlthf和51.5ml(372mmol，1.2eq)三乙胺中，然后滴加75.99g(310mmol,leq)二乙基-2-溴甲基磷酸酯。接下来，将溶液加热至70℃并在室温下搅动24小时。在旋转蒸发器上去除溶剂。用乙醚用力震荡剩余物并过滤。剩余固体再用乙醚提取两次。乙醚滤液合并并蒸发。获得的产物是黄色油，其无需进一步纯化直接用于下一反应。

¹h-nmr(dmso-d6):4.45(t,1h)；3.98(m,4h)；3.54and3.42(2m,2x2h)；2.5-2.8(m,4h)；1.90(m,2h)；1.25-1.60(m,4h)；1.22(t,6h)；1.10(2t,6h).³¹p-nmr(dmso-d6):30ppm。

在第一步中获得的中间产物溶解在400mlthf中，与85.94ml(620mmol,2eq)三乙胺混合，并冷却至0℃。然后滴加66.11ml(465mmol,1.5eq)氯甲酸苄酯，移除冷却装置在室温下搅动过夜。下一步，反应混合物用1m氢氯酸中和，并蒸发掉溶剂。剩余物用乙醚震荡并在冰箱中储存过夜。分离获得的固体并用乙醚彻底洗涤两次。合并乙醚溶液并蒸发。用硅胶柱层析法纯化剩余物。在此过程中，最初用己烷：乙酸乙酯2:1洗脱杂质，然后用乙醚洗脱产物。

得率：85.752g(60.2％)无色粘性油。¹h-nmr(dmso-d6):7.34(m,5h)；5.07(s,2h)；4.44(m,1h)；3.94(m,4h)；3.6-3.2(m,8h)；2.02(m,2h)；1.46(m,4h)；1.19(m,6h)；1.09(m,6h).³¹p-nmr(dmso-d6):28.93和28.57ppm。

实例4：化合物4制备

描述：溶于1000ml丙酮中的80g化合物3用0.98g(1.74mmol,lmol％)铟(iii)三氯甲磺酸酯在室温下搅动。用hplc(rp18,甲醇/水80:20)检测平衡反应的持续过程。时常蒸发溶剂并用新丙酮替代。这持续至反应完成超过95％。然后将溶剂蒸发。黄色油物质在高真空中粗略干燥并马上置于进一步用途。

¹h-nmr(dmso-d6):9.62(d,1h)；7.36(m,5h)；5.07(s,2h)；3.94(m,4h)；3.37and3.24(2m,4h)；2.41(m,2h),2.04(m,2h)；1.73(m,2h)；1.22(t,6h).³¹p-nmr(dmso-d6):29.51,29.14ppm

实例5：化合物5制备

描述：在氩气气氛中将350mlthf中的29.438g化合物2冷却至-70℃，然后滴加12.96ml(103mmol,1.04eq)n,n,n'n'-四甲基胍。在-70℃搅动10分钟后，滴加溶于60mlthf的38.170g(99.04mmol,1eq)化合物4。在-70℃进一步搅动一小时，然后允许制备反应缓慢达到室温并搅动过夜。

将溶剂蒸发。将剩余物溶解于近400ml乙酸乙酯中，用5％柠檬酸溶液洗涤两次，并用饱和nacl溶液清洗一次，用硫酸镁干燥和蒸发。获得黄色油。

得率：53,228g,95.6mmol,96.5％。¹h-nmr(cdc13):7.33(s,5h)；6.48(t,1h)；5.13(s,2h)；4.08(m,4h)；3.81和3.76(2s,总共3h)；3.49(m,2h)；3.30(t,2h)；2.21(m,2h)；2.04(m,2h)；1.71(m,2h)；1.48和1.46(2s,总共9h)；1.28(m,6h)。³¹p-nmr(cdc13):29.72和29.15ppm。

实施例6：化合物6制备

描述：在帕尔加氢装置的反应瓶中，在氩气中，将450mg(0.96mmol,lmol％)双(1,5-环辛二烯)铑(i)-三氟甲烷磺酸酯和306mg(0.96mmol,lmol％)(-)-1,2-双-[(2r,5r)-2,5-二甲基-膦烷基]-苯溶解在约50ml甲醇中，然后加入溶于250ml甲醇中的53.228g(96mmol)化合物5。瓶子安装于加氢装置上，排空三次并填充氢气。最终，设置氢气压为4.5-5bar，并且将瓶子搅动24小时。

释放多余的氢气，移除瓶子并通过硅藻土(celite)过滤反应溶液。蒸发滤液并真空干燥。获得浅棕色油。

得率：53.712g,96mmol,定量。¹h-nmr(cdc13):7.35(m,5h)；6.48和6.35(2m,总共1h)；5.13(s,2h)；4.27(m,1h)；4.07(m,4h)；3.73(s,3h)；3.48(m,2h)；3.27(m,2h)；2.25-1.95(m,4h)；1.75-1.55(m,4h)；1.45(s,9h)；1.28(m,6h)。³¹p-nmr(cdc13):29.78和29.23ppm。

实例7：化合物7制备

描述：将溶于二氧己环的240ml4mhcl溶液滴加至溶于120mlthf的53.94g(96.6mmol)化合物6。在室温下搅动。通过hplc(甲醇/水70:30)监测反应过程。boc拆分在2-3小时后完成。蒸发掉溶剂，剩余物用二乙醚洗涤并干燥。获得油腻的浅棕色油。

得率：47.83g，定量。¹h-nmr(dmso-d6):8.64(s,br,2h)；7.36(m,5h)；5.07(s,2h)；3.97(m,5h)；3.73(s,3h)；3.38(m,2h)；3.22(m,2h)；2.04(m,2h)；1.80(m,2h)；1.48-1.35(m,4h)；1.22(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.012和28.62ppm。

实例8：化合物8制备

描述：溶于100ml甲醇中的16.65g(29.8mmol,1eq.)化合物7冷却至0℃并与5.414g(66mmol,2.2eq)乙酸钠混合。然后滴加溶于150ml甲醇中的5.218g(32.8mmol,1.1eq)n-boc-氨基乙醛。在0℃下搅动1小时，然后分次加入2.074g(33mmol,1.1eq)氰基硼氢化钠。一旦泡沫减少，移除冷却槽并在室温下搅动过夜。

在旋转蒸发仪中移除溶剂，剩余物吸收于乙酸乙酯中，并用碳酸氢钠溶液(半饱和)和饱和氯化钠溶液进行洗涤。有机相用硫酸镁干燥，蒸发并真空干燥。粗产物通过硅胶柱(二氯甲烷/甲醇(5％，v/v))纯化。获得粘性黄色油。

得率：15.379g(25,6mmol,86％)。¹h-nmr(dmso-d6):7.36(m,5h)；6.69(m,1h)；5.06(s,2h)；4.02(m,4h)；3.4-3.15(3m,总共7h)；2.95(m,1h)；2.38(m,1h)；2.01(m,2h)；1.60-1.30(m,6h)；1.38(s,9h)；1.20(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.00和28.60ppm。

实例9：化合物9制备

e＝cbz-a,cbz-c,cbz-g,t

描述：溶于70ml乙腈的20.25mmol(1.5eq)乙酸组分(n6-cbz-腺嘌呤-9-基-乙酸,n4-cbz-胞嘧啶-l-基-乙酸,n2-cbz-鸟嘌呤-9-基-乙酸或胸腺嘧啶脱氧核苷-l-基-乙酸)、20ml吡啶和4.5ml(40,5mmol,3eq)n-甲基吗啉冷却至0℃并与7.186g(18.9mmol,1.4eq)hatu混合。移除冷却槽，在室温下搅动10min。缓慢将混合物加入溶于50ml乙腈的8.1g(13.5mmol,leq)化合物8。室温下搅动1小时，并在40℃下过夜。

混合物再次冷却至室温并用20ml水稀释。进一步搅动30min，将溶剂蒸发。用二氯甲烷蒸发剩余物两次，以尽可能去除吡啶。然后剩余物再次吸收于二氯甲烷并置于冰箱中过夜。获得的固体过滤，滤液经过蒸发并通过急骤层析(硅胶，2-5％甲醇溶于二氯甲烷)纯化，其中获得的产物是白黄色泡沫。

化合物9，e＝cbz-a:

得率：62％。¹h-nmr(dmso-d6):10.65(s,1h)；8.59(s,1h)；8.35和8.29(2s,总共1h)；1.47-7.24(m,10h)；6.90和6.72(2m,总共1h)；5.42-5.00(m,6h)；3.92(m,5h)；3.56和3.49(2s,总共3h)；3.50-2.95(m,8h)；2.12-1.30(m,8h)；1.38和1.35(2s,总共9h)；1.16(m,6h)；³¹p-nmr(dmso-d6):29.52和29.16ppm。

化合物9,e＝cbz-c:

得率：59％。¹h-nmr(dmso-d6):10.77(s,br,1h)；7.94(d,1h),7.42-7.33(m,10h)；7.01(d,1h)；6.91和6.80(2m,总共1h)；5.19(s,2h)；5.07(s,2h)；4.80-4.6(m,2h)；4.36(m,1h)；3.94(m,4h)；3.7和3.59(2s,总共3h)；3.5-2.8(m,8h)；2.05-1.3(m,8h)；1.38和1.37(2s,总共9h)；1.19(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.02和28.63ppm。

化合物9，e＝cbz-g:

得率：77.5％。¹h-nmr(dmso-d6):11.33(s,br,2h)；7.85(s,1h)；7.45-7.30(m,10h)；6.99和6.81(2m,总共1h)；5.26(s,2h)；5.06(m,4h)；4.58和4.31(2m,总共1h)；3.934(m,4h)；3.56(s,3h)；3.31-3.19(m,8h)；2.21-1.30(m,8h)；1.36和1.35(2s,总共9h)；1.19(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):28.98和28.59ppm。

化合物9，e＝t:

得率：78％¹h-nmr(dmso-d6):11.26(s,br,1h)；7.35(m,6h),6.90和6.79(2m,总共1h)；5.07(s,2h)；4.63-4.49(m,2h)；4.31(m,1h)；3.94(m,4h)；3.70和3.58(2s,总共3h)；3.46-3.12(m,8h)；2.11-1.30(m,8h)；1.76(s,3h)；1.38和1.35(2s,总共9h)；1.19(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.61和29.25ppm。

实例10：制备

e＝cbz-a,cbz-c,cbz-g,t

描述：2.31mmol化合物9(e＝cbz-a、cbz-c、cbz-g或t)在12ml水/甲醇1:1中冷却至0℃，然后滴加12ml2nnaoh溶液。在0℃搅动15min，然后在室温下搅动直至皂化完成(根据dc控制)(硅胶，甲醇：二氯甲烷为10％)(持续时间：约1小时)。然后用少量水进行稀释并将任何未溶解的物质进行初步离心。用水将清溶液稀释至约300ml，再次冷却至0℃。用1mhcl溶液将ph调至2.5，导致产生白色固体沉淀。溶液用二氯甲烷进行提取(约5次)，直到没有进一步的产物进入有机相(dc控制)。合并的有机相用硫酸镁干燥，蒸发并真空干燥。获得的产物为白黄色固体。

化合物10，e＝cbz-a:

得率：72％。¹h-nmr(dmso-d6):10.68(s,br,1h)；8.59(s,br,1h)；8.35和8.29(2s,br,总共1h)；7.49-7.33(m,10h)；6.98和6.85(2m，总共1h)；5.35-5.04(m6h)；4.62和4,22(2m,总共1h,)；3.93(m,4h,)；3.50-2.85(m,8h)；2.20-1.30(m,8h)；1.39和1.36(2s,共9h)；1.17(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.55和29.19ppm。

化合物10,e＝cbz-c:

得率：59％。¹h-nmr(dmso-d6):7.95(d,1h)；7.42-7.28(m,10h)；7.01(d,1h)；6.90和6.85(2m,总共1h)；5.19(s,2h)；5.07(s,2h)；4.81-4.65(m,2h)；4.33(m,1h)；3.933(m,4h)；3.45-3.15(m,8h)；2.15-1.30(m,8h)；1.38和1.35(2s,总共9h)；1.20(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.03和28.66ppm。

化合物10，e＝cbz-g:

得率：62％。^lh-nmr(dmso-d6):11.43(s,br,1h)；11.33(s,br,1h)；7.85(s,1h)；7.44-7.31(m,10h)；6.97和6.81(2m，总共1h)；5.24(s，2h)；5.10-5.00(m,4h)；4.51和4,28(2m,总共1h,)；3.91(m,4h,)；3.52-3.08(m,8h)；2.12-1.28(m,8h)；1.36和1.34(2s,共9h)；1.15(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.61和29.21ppm。

化合物10，e＝cbz-t:

得率：72％。¹h-nmr(dmso-d6):11.27(s,br,1h)；7.35(m,6h)；6.88(m,1h)；5.07(s,2h)；4.65-4.48(m,2h)；4.37和4.38(2m，共1h)；3.94(m,4h)；3.45-3.17(m,8h)；2.11-1.30(m,8h)；1.75(s,3h)；1.38和1.36(2s,共9h)；1.19(m,6h)。³¹p-nmr(dmso-d6):29.64和29.26ppm。

实例11：本发明通式(iii)或(vi)的低聚化合物的制备

通过通式(i)的合适化合物与单体单元的序列连接，通过固相肽合成制备本发明的低聚物，所述单体单元包括：n-乙酰-n-(2-氨乙基)甘氨酸构件模块、氨基酸、氨基酸衍生物、和基团b-ch(r⁴⁸)cooh。

为了便于表征通式(iv)的低聚化合物中的通式(v)的单元z，例如，使用下述缩略语：t^r,c^r,g^r,a^r,p^r,t^s,c^s,g^s,a^s和p^s。此处t、c、g、a和p(苯基)在每种情形下代表各自单体单元的碱基，并且上标r或s代表通式(v)的单元z的不对称中心(#)的r构型或s构型。

由n-乙酰-n-(2-氨乙基)甘氨酸构件模块组成的单体也简写为类似于上述通式(v)的单体，区别在于不使用大写字母代表碱基，也不使用上标代表构型(例如a^r)，而使用相应的小写字母。例如，具有c碱基的单体简写为c。

实例12：通式(iii)或(vi)具有作为b-ch(r⁴⁸)cooh基团的4-氟苯基-醋酸盐取代物的低聚物

为了通过固相肽合成制备本发明的化合物，使用下述合成方案：

步骤1：在二氯甲烷中将10mg树脂(mbha树脂，novabiochem，低载约0.5-06mmol/g)预浸3h。

步骤2：开始合成循环：用二氯甲烷洗涤4次(4xwashing))。

步骤3：中和树脂：用二氯甲烷/dipea(5％)洗涤3次。

步骤4：用二氯甲烷洗涤5次。

步骤5：用nmp洗涤5次

步骤6：在nmp/吡啶(2:1)中将4当量的相应受保护的化合物(通式(i)化合物/pna单体/氨基酸/氨基酸衍生物)与3.8当量的hatu和9当量的nmm预活化1min。

步骤7：将激活的受保护化合物(通式(i)/pna单体/氨基酸/氨基酸衍生物)与固体相反应(第一偶联；时间：60min)。

步骤8：用nmp清洗4次。

步骤9：重复步骤6-8(第二偶联)。

步骤10：用茚三酮测试偶联效率(kaiser测试；如果kaiser测试是阳性的，则必须将相应的受保护化合物(通式(i)化合物/pna单体/氨基酸/氨基酸衍生物)重复步骤6-8)。

步骤11：在kaiser测试呈阴性后，用ac2o/nmp/吡啶(1:25:25)溶液覆盖一次。

步骤12：用nmp清洗5次。

步骤13：将溶剂替换为二氯甲烷。用dcm清洗5次。

步骤14：通过与tfa/间甲酚(95:5)反应进行boc拆分。反应时间：每个2次，一次3min。

步骤15：用dcm清洗5次。

步骤16：将溶剂替换为nmp。用nmp清洗5次。

步骤17：重复合成循环(步骤6-16)用于与最后的相应受保护的化合物(通式(i)化合物/pna单体/氨基酸/氨基酸衍生物)进行偶联。下一步，如有必要重复合成循环(步骤6-16)用于与最后的相应受保护的化合物(通式(i)化合物/pna单体/氨基酸/氨基酸衍生物)进行偶联。

步骤18：用二氯甲烷清洗5次。

步骤19：通过与tfa/间甲酚(95:5)反应进行boc拆分。反应时间：每个2次，一次3min。

步骤20：用二氯甲烷清洗5次。

步骤21：用nmp清洗5次。

步骤22：在nmp/吡啶(2:1)中将具有5.7当量hatu的6当量的4-氟苯基-乙酸和13当量的nmm预活化1min。

步骤23：将活化的4-氟苯基-乙酸与固体相反应(时间：60min)。

步骤24：用nmp清洗4次。

步骤25：如有必要，重复步骤23-24(第二偶联)。

步骤26：用二氯甲烷清洗5次。

步骤27：干燥：用二乙醚清洗5次。

获得通式(iii)或(vi)的化合物，其结合至树脂的c末端。

将本发明通式(iii)或(vi)的化合物从树脂拆分：

将具有本发明化合物的树脂在三氟乙酸、三氟甲烷磺酸、茴香硫醚和乙二硫醇(85/12.5/1.7/0.8,v/v/v/v)溶液中振荡2小时。过滤液体相，通过加冷乙醚将粗产物沉淀。粗产物排阻色谱去盐。粗产物通过制备型hplc，通过含甲醇/水的rp-c18柱进行纯化。获得本发明的化合物，是一种无色固体，得率约为50％。本发明化合物质量通过hplc-esi表征。

实例13：制备的本发明通式(iii)或(vi)的化合物的实例

根据实例12的大致方法获得通式(iii)或(vi)的低聚化合物，其缩写如下：

例如，制备通式(i)具有r构型不对称中心的单体和其他pna单体和氨基酸l-赖氨酸(缩写为lys^l)的低聚化合物，并在最后步骤中赖氨酸的ɑ氨基官能团用乙酰覆盖，并且最终低聚化合物作为初级氨基化合物从树脂分离，缩写为ac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2。

例如，制备通式(i)具有r构型不对称中心的单体和其他pna单体和氨基酸甘氨酸(缩写为gly)的低聚化合物，并在最后步骤中甘氨酸的ɑ氨基官能团用乙酸苯酯(缩写为pac)覆盖，并且最终低聚化合物作为初级氨基化合物从树脂分离，缩写为pac-gly-agccct^saact^sgcact^st^sccat^s-nh2。

例如，制备通式(i)具有r构型不对称中心的单体和其他pna单体和氨基酸d-赖氨酸(缩写为lys^d)的低聚化合物，并在最后步骤中赖氨酸的ɑ氨基官能团用4氟乙酸苯酯(缩写为flupac)覆盖，并且最终低聚化合物作为初级氨基化合物从树脂分离，然后赖氨酸的ε氨基官能团偶联至荧光染料atto647，缩写为flupac-lys^d(atto647)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2。

其他荧光染料的实例是atto、megared、alexa、bodipy和tamra。

制备的本发明通式(iv)的化合物的实例如下：

pac-lys^l-agccct^raact^rgcact^rt^rccat^r-nh2

pac-lys^l-t^rt^rccat^rcct^rt^rggagct^rt^rggct^r-nh2

pac-lys^l-ct^raact^rgcact^rt^rccat^rcct^rt^r-nh2

pac-lys^l-t^rt^rcccagccct^raact^rgcact^r-nh2

pac-lys^l-gaccct^rt^rcccagccct^raact^r-nh2

pac-lys^l-ggt^ragaccct^rt^rcccagccct^r-nh2

pac-lys^l-t^rt^rcgt^rccat^rggccggggt^rcc-nh2

pac-lys^l-t^rt^rcgt^rccagt^rgccggggt^rcc-nh2

flupac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcccgg^rgg^rgc^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rat^rgg^rccgggg^rtc^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-gt^rtc^rgt^rccatgg^rcc^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-gg^rgg^rga^racagtt^rcg^rtc^r-nh2

flupac-lys^l-ga^rgg^rgg^rggaacag^rtt^rcg^r-nh2

flupac-lys^l-cg^rgg^raa^rgatgag^rgg^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rag^rgc^rctgggc^rtg^rgc^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rac^rat^raggggc^rca^rga^r-nh2

flupac-lys^l-tt^rgg^rgc^rtgctca^rat^rga^r-nh2

flupac-lys^l-cg^rcg^rga^rgcgccc^rct^rcg^r-nh2

flupac-lys^l-tg^rgg^rgt^rgggtct^rtg^rgt^r-nh2

flupac-lys^l-gt^rcg^rct^rgtctcc^rgc^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rct^rga^rccctga^rag^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rct^rga^rcctgca^rag^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rga^r-nh2

flupac-lys^l-gc^rcg^rgg^rgtcgca^rgc^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rat^rgg^rtcaggg^rtc^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-gc^rct^rgg^rgctggc^rtc^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rac^rat^raaggcc^rca^rga^r-nh2

flupac-lys^l-tg^rgt^rgg^rtatctg^rtg^rct^r-nh2

flupac-lys^l-tt^rga^rtc^rttgatg^rgt^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-tg^rgg^rgt^rgggtct^rtg^rgt^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rtatc^rac^rga^rttagca^rtt^raa^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rcatg^rga^rat^rtcagtt^rct^rca^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rtatc^rac^rga^rtatgct^rat^raa^r-nh2

ac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

tml-lys^l-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2(tml＝ε-三甲基-赖氨酸)

flupac-lys^l-gt^rcg^rct^rgtctcc^rgc^rtt^r-nh2

ac-lys^l-gt^rcg^rct^rgtctcc^rgc^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtgccag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rggg^rgtgcca^rgctg^rg-nh2

flupac-lys^l-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-lys^l-ca^rgt^rcc^rtagaaa^rga^raa^r-nh2

flupac-lys^l-ac^rtt^rtt^rcacctg^rgg^rtc^r-nh2

flupac-lys^l-ca^rat^rac^rtattgc^rac^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-gc^rtt^rtg^racaata^rct^rat^r-nh2

flupac-lys^l-tg^rac^raa^rtactat^rtg^rca^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rta^rtt^rggaccc^rtt^rac^r-nh2

flupac-lys^l-ga^rac^rag^rtattgg^rac^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-ga^racag^rta^rtt^rggaccc^rtt^rac^r-nh2

flupac-lys^l-tc^rag^rtc^rtgataa^rgc^rta^r-nh2

flupac-lys^l-tc^raa^rca^rtcagtc^rtg^rat^r-nh2

flupac-lys^l-ac^rat^rca^rgtctga^rta^rag^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rgg^rgg^rtc^rgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(atto647)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(megared)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(atto647)-cc^rgg^rgg^rtc^rgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(megared)-cc^rgg^rgg^rtc^rgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-gg^rccaa^rac^rct^rcggctt^rac^rct^r-nh2

flupac-gg^rccaa^rac^rct^rgcgctt^rac^rct^r-nh2

flupac-lys^l(atto)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(atto)-cc^rgg^rgg^rtc^rgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(atto)-cc^rgg^rgg^rtgccag^rct^rgg^r-nh2

ac-lys^l(atto)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

ac-lys^l(atto)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rg-nh2

flupac-lys^l(atto)-gt^rcg^rct^rgtctcc^rgc^rtt^r-nh2

flupac-lys^l(atto)-cc^rggg^rgtgcca^rgctg^rg-nh2

flupac-lys^l(atto)-c^rcgggg^rtc^rgc^ragctgg^r-nh2

flupac-lys^l(alexa)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l(bodipy)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-g^rgc^rcaaa^rcctcgg^rcttacc^rtg^raa^rat^r-nh2

flupac-lys^l-g^rgc^rcaaa^rcctgcg^rcttacc^rtg^raa^rat^r-nh2

flupac-lys^l-a^rcc^rat^ragcgag^rgt^rga^r-nh2

flupac-lys^l-g^rac^rga^raccata^rgc^rga^r-nh2

flupac-lys^l-g^rag^rgc^ragacga^rac^rca^r-nh2

flupac-lys^l-a^rag^rca^rgcccca^rga^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-a^rgc^rgg^rtcagea^rag^rca^r-nh2

flupac-lys^l-g^rat^rgg^racagcg^rgt^rca^r-nh2

flupac-lys^l-c^rta^raa^raacaga^rat^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-g^rac^rct^raaaaac^rag^raa^r-nh2

flupac-lys^l-g^rat^rgg^racctaa^raa^rac^r-nh2

flupac-lys^l-t^rgg^rtt^rctggat^rgg^rac^r-nh2

flupac-lys^l-t^rtt^rtc^rtctgca^rtg^rca^r-nh2

flupac-lys^l-c^rtg^rtt^rtttctc^rtg^rca^r-nh2

flupac-lys^l-a^rgg^rta^rctgttt^rtt^rct^r-nh2

flupac-lys^l-a^rtt^rgg^ragaaga^rag^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-t^rga^rca^r11111c^rga^raa^r-nh2

flupac-lys^l-t^rgt^rcc^raagggt^rga^rca^r-nh2

flupac-lys^l-c^rtt^rgt^rccaagg^rgt^rga^r-nh2

flupac-lys^l-a^rcc^rtt^rgtccaa^rgg^rgt^r-nh2

flupac-lys^l-a^rta^rcc^rttgtcc^raa^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-c^rtt^rat^racc11g^rtc^rca^r-nh2

flupac-lys^l-a^rct^rgc^raacctc^rca^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-t^rca^rct^rgcaacc^rtc^rca^r-nh2

flupac-lys^l-c^rag^rct^rcactgc^raa^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-c^rtc^rag^rctcact^rgc^raa^r-nh2

flupac-lys^l-a^rtc^rtc^ragctca^rct^rgc^r-nh2

flupac-lys^l-c^rga^rtc^rtcagct^rca^rct^r-nh2

flupac-lys^l-c^rgc^rga^rtctcag^rct^rca^r-nh2

flupac-lys^l-g^rgc^rgc^rgatctc^rag^rct^r-nh2

flupac-lys^l-g^rtg^rgc^rgcgatc^rtc^rag^r-nh2

flupac-lys^l-c^rtc^rag^rctcact^rgc^raa^r-nh2

flupac-lys^l-g^rat^rgg^rcaaaca^rgg^rat^r-nh2

flupac-lys^l-c^rac^rca^ragagga^rtg^rgc^r-nh2

flupac-lys^l-a^rga^rcc^ragcacc^raa^rga^r-nh2

flupac-lys^l-a^rct^rca^rctgata^raa^rga^r-nh2

flupac-lys^l-c^rct^rga^rggactc^rac^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-t^rcc^rcc^racctga^rgg^rac^r-nh2

flupac-lys^l-t^rgg^rcc^raccttt^rtc^rta^r-nh2

flupac-lys^l-t^rtc^rtt^rggccac^rct^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-t^rtg^rgc^rttcttg^rgc^rca^r-nh2

flupac-lys^l-t^rtg^rgt^rtggctt^rct^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-t^rac^rct^rtattgg^rtt^rgg^r-nh2

flupac-lys^l-c^rct^rac^rcttatt^rgg^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-t^rga^rcc^rtacctt^rat^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-g^rgg^rtg^racctac^rct^rta^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rag^rcagaac^rct^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rc-nh2

flupac-lys^l-ag^ragc^ragaacc^rttac^rt-nh2

flupac-lys^l-agagca^rga^rac^rct^rtact-nh2

flupac-lys^l-gc^rta^rtt^racctta^rac^rcc^r-nh2

flupac-lys^l-ca^rat^rca^rgaccta^rgg^raa^r-nh2

flupac-lys^l-tt^rct^rgc^rtctcgt^rcc^rtg^r-nh2

flupac-lys^l-gt^rcg^rcg^ragacac^rgc^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^l-gt^rcg^rct^rgtctcc^rgc^rtt^r-nh2

flupac-lys^l-cc^rtatc^rac^rga^rtatgct^rat^raa^r-nh2

mn-lys^l-tg^rcc^rta^rggactc^rca^rgc^r-nh2

mn＝4-羟基-3-硝基-乙酸苯酯-基团

mn-lys^l(tamra)-tg^rcc^rta^rggactc^rca^rgc^r-nh2

mn-lys^l(atto)-tg^rcc^rta^rggactc^rca^rgc^r-nh2

flupac-gly-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rc-nh2

flupac-lys^d-ct^rga^raa^rttttcg^raa^rgt^r-nh2

flupac-lys^d-tt^rac^rct^rgaaatt^rtt^rcg^r-nh2

flupac-lys^d-cg^rgc^rtt^racctga^raa^rtt^r-nh2

flupac-lys^d-ct^rcg^rgc^rttacct^rga^raa^r-nh2

flupac-lys^d-ac^rct^rcg^rgcttac^rct^rga^r-nh2

flupac-lys^d-aa^rac^rct^rcggctt^rac^rct^r-nh2

flupac-lys^d-cc^raa^rac^rctcggc^rtt^rac^r-nh2

flupac-lys^d-aa^rgg^rcc^raaacct^rcg^rgc^r-nh2

flupac-gly-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

flupac-gly-ag^ragca^rgaacctta^rct-nh2

flupac-gly-ag^raa^rga^rcgttcc^raa^rct^r-nh2

flupac-gly-ag^rcg^raa^rgcatat^rat^rcc^r-nh2

flupac-gly-ac^rag^rga^rcgagag^rca^rga^r-nh2

flupac-gly-ac^rct^rta^rcttttc^rct^rct^r-nh2

flupac-gly-cac^rag^ratgaca^rtt^rag^r-nh2

flupac-gly-ca^rat^rca^rgaccta^rgg^raa^r-nh2

flupac-gly-ac^rac^rcc^racaatc^rag^rtc^r-nh2

flupac-gly-ac^rcc^rac^raatcag^rtc^rct^r-nh2

flupac-gly-ac^raa^rtc^ragtcct^rag^raa^r-nh2

flupac-gly-aa^rtc^rag^rtcctag^raa^rag^r-nh2

flupac-gly-tc^rag^rtc^rctagaa^rag^raa^r-nh2

flupac-gly-ag^rtc^rct^ragaaag^raa^raa^r-nh2

flupac-gly-gg^rat^rgg^ractctt^rac^rtt^r-nh2

flupac-gly-at^rgg^rac^rtcttac^rtt^rtt^r-nh2

flupac-gly-ac^rtc^rtt^ractttt^rca^rcc^r-nh2

flupac-gly-tc^rtt^rac^rttttca^rcc^rtg^r-nh2

flupac-gly-tt^rac^rtt^rttcacc^rtg^rgg^r-nh2

flupac-gly-tt^rtt^rca^rcctggg^rtc^rat^r-nh2

flupac-gly-tc^rca^rac^raatcag^rac^rct^r-nh2

flupac-gly-ca^rac^raa^rtcagac^rct^rag^r-nh2

flupac-gly-ac^raa^rtc^ragacct^rag^rga^r-nh2

flupac-gly-aa^rtc^rag^racctag^rga^raa^r-nh2

flupac-gly-tc^rag^rac^rctagga^raa^rac^r-nh2

flupac-gly-ag^rac^rct^raggaaa^rac^rgg^r-nh2

flupac-gly-ac^rga^rga^rgcagaa^rcc^rtt^r-nh2

flupac-gly-ga^rga^rgc^ragaacc^rtt^rac^r-nh2

flupac-gly-ga^rgc^rag^raacctt^rac^rtt^r-nh2

flupac-gly-gc^rag^raa^rccttac^rtt^rtt^r-nh2

flupac-gly-ag^raa^rcc^rttactt^rtt^rcc^r-nh2

flupac-gly-aa^rcc^rtt^ractttt^rcc^rtc^r-nh2

flupac-gly-ca^rgt^rcc^rtagaaa^rga^raa^r-nh2

flupac-gly-aa^rac^rct^rcggctt^rac^rct^r-nh2

flupac-lys^d-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

ac-lys^d-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^d-cc^rggggtcgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^d-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

ac-lys^d-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^d-ag^ragcagaac^rct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^d-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

ac-lysd-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-lys^d-cc^racaatcag^rtc^rat^rag^r-nh2

flupac-gly-ac^rat^rca^rgtctga^rta^rag^r-nh2

flupac-gly-gg^rgg^rtc^ratcaag^rgg^rtg^r-nh2

flupac-gly-cc^rac^rag^ratgaca^rtt^rag^r-nh2

flupac-gly-c^rcac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-gly-c^rcac^raa^rtcagtc^rct^rag-nh2

flupac-gly-ccac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-gly-ccac^raa^rtcagtc^rct^rag-nh2

flupac-gly-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

ac-lys^d(atto)-cc^rgg^rgg^rtcgcag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-cc^rggggtcgc^rag^rct^rgg^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

ac-lys^d(atto)-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-ag^ragcagaac^rct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

ac-lys^d(atto)-cc^rac^raa^rtcagtc^rct^rag^r-nh2

flupac-lys^d(atto)-cc^racaatcag^rtc^rct^rag^r-nh2

flupac-lys^d(chol)-ga^rga^rgc^ragaacc^rtt^rac^r-nh2

flupac-lys^d(fol)-ga^rga^rgc^ragaaccc^rtt^rac^r-nh2

flupac-lys^d(dans)-ga^rga^rgc^ragaacc^rtt^rac^r-nh2

flupac-gly-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rc-nh2

flupac-gly-ag^rag^rca^rgaacct^rta^rct^r-nh2

flupac-lys^d-ga^rgc^rag^raacctt^rac^rtt^r-nh2

flupac-lys^d-ga^rgag^rcagaac^rctta^rc-nh2

ac-lys^d-ga^rgag^rcagaac^rctta^rc-nh2

flupac-gly-ga^rgca^rgaacct^rtact^rt-nh2

flupac-gly-cagtcct^rag^raa^ragaaa-nh2

flupac-gly-gg^rccaa^rac^rct^rcggctt^rac^rt^r-nh2

flupac-gly-cagtcct^rag^raa^ragaaa-nh2

实例14：在各种器官/组织中生物药效率的提升和半衰期的延长

³h标记的n-p低聚物和³h标记的ep2041161低聚物在每种情形下溶于pbs(ph7.1)并通过大剂量静脉注射以10mg/kg的浓度给药给小鼠。在各个时间点(20min、1.5h、3h、6h、24h、2天、4天、8天和14天)将血液和18个不同的器官/组织(肾、肝脏、脾脏、骨髓、淋巴结、肺、大肠、小肠、胰腺、膀胱、心脏、胸腺、胃、肌肉、大脑、小脑、前列腺和皮肤)从小鼠移除并测量各个组织内的³h浓度。通过经过验证的专业winnonlin软件(版本号4.0.1)(pharsight公司，山景城，usa)进行药物动力学分析。在各个器官/组织(每个取样点平均3只动物)中测量随时间(无需预先设定时间间隔)的放射性，以计算器官/组织中的生物药效性(通过曲线下的面积表达)和半衰期。

发现在14天内，³h标记的n-p低聚物的生物药效率在所有组织中比³h标记的ep2041161低聚物增加1.7-4.6倍。结果见图1。

发现在14天内，³h标记的n-p低聚物的半衰期在大多数组织中比³h标记的ep2041161低聚物大，在脾脏中大2倍。结果见图2。

实例15：结合血浆蛋白能力的提升

在chromtech的5cmhplc柱(4.0x50mm,5μm)上测定与人血清蛋白的结合。将人血清蛋白固定至该柱子上，使得在保留时间内可测定与人血清蛋白的亲合力。将30％异丙醇/乙酸铵缓冲液(ph7)作为洗脱液。

亲合常数根据厂家的下述公式进行计算：

k'＝(tr-tm)/tm

tr＝使用的样品的保留时间

tm＝对乙酰氨基酚的保留时间

使用该值可计算与人血清蛋白的结合(用％表示)：

p＝100(k'/(k'+1))

值越高，表明体内分布越有利。下表阐明了与ep2041161低聚物相比，n-p低聚物具有明显更强的与血清蛋白的结合能力。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝0(oet)2

实例16：改善的取决于序列的水溶性

各种n-p低聚物和ep2041161低聚物称重并加入尽可能多的pbs(ph7.2)理论上提供l00μm溶液。测量获得的溶液的od值。然后比较n-p低聚物和ep2041161低聚物的od值，其中od值越高，对应的溶解分子数量越多，因此溶解性越好。然而，序列包含大量鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的ep2041161低聚物不允许制备低聚化合物完全溶解的l00μmpbs溶液，但当制备l00μm溶液时，n-p低聚物完全溶解于pbs中。下述表格阐明了n-p低聚物与ep2041161低聚物相比，取决于序列的水溶性意外的明显增加。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^cm＝称量数量[mg]

^dod-值＝在制备理论上的100μmpbs溶液后测量的od值；

实例17：与互补dna的较强结合力

n-p低聚物或ep2041161低聚物和序列互补dna低聚物溶于等摩尔比值的无镁无钙pbs生理缓冲液中。将溶液稀释至在uv光谱仪中测量的od值为0.8。通过加热池将uv光谱仪中的比色皿以1℃梯度逐渐从室温加热至95℃。在每增加1℃后确定od值。在获得的曲线的拐点为熔点。

下表阐明了n-p低聚物具有比相应的ep2041161低聚物更高的熔点。因此n-p低聚物与序列互补dna低聚物形成更稳定的连接。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2)

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝o(oet)2)

实例18：nfkb在hela细胞中的下调。

hela细胞(来自dsmz)培养两天后，以800细胞/孔的密度接种于greinerμclear384w板中，加入溶于pbs的n-p低聚物或者ep2041161低聚物，使得在每种情形下在完全培养基中的最终浓度为0.5、2.5和l0μm。在细胞接种后第5天,添加20μl/孔的新鲜完全培养基。在第7天，换成0.1％fcs的饥饿培养基。在第8天，为了刺激细胞，在培养基(0.1％fcs，无抗生素)中添加10ng/mltnfα(peprotech)，30分钟后固定细胞用于形态分析(4％pfa)并表征大多数重要的亚细胞结构如细胞核和细胞质，用合适的染料和抗生素染色。在imagexpress微自动显微镜(mdc)中进行图像处理。用metamorph(mdc)软件可视化进行图像分析然后用自动图像分析软件definiensxd(definiens)使用特定算法进行图像定量分析。这样，通过hoechst染料染色，确定细胞核数量，其作为细胞增殖程度的替换物，因而用于通过低聚化合物进行nfkb下调。

下表阐明了基于细胞核数量的较低值，尤其在浓度为2.5μm和10μm的浓度，n-p低聚物基于增加对nfkb下调而对基因表达的影响优于ep2041161低聚物。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝o(oet)2

实例19：目标tnfr2(外显子7跳跃)在thpl细胞中更强的剪接位点调节。

低聚化合物的效力测试在来自atcc的thp1细胞培养物中实行。thpl来自急性单核白血病病人的人单核细胞。测试时，thpl细胞培养物(含10％fcs的rpmi1640培养基)不使用抗生素。经常进行支原体测试(使用minerva的venorgem-kit)。

第一天，使用多液滴分配器在greinercollageni384w板(#781956)中放置thpl细胞，添加pma，浓度为13000细胞/孔。在这一步中，细胞用具有10％血清和青霉素/链霉素的完全培养基处理。在接种后，添加l00nm的pma(sigma#p8139)。在第4天，在交换培养基后，添加低聚物，浓度为0.2、2和20μm。在第6天，添加浓度为100u/ml的thplinfg(peprotech)以及ifn-γ并培养细胞24小时。在第7天，在交换细胞培养基后，添加含5μg的lps(sigma)的饥饿培养基(0.1％fcs)，并将培养物刺激24小时。在第8天，在裂解缓冲液stratecs(#7061311700)中裂解thpl细胞并将裂解物在-80℃下储存。在第9天，使用rnastratecinvitraprna提取试剂盒提取细胞(#7061300400)并在-80℃储存用于进一步分析。

使用lifetechhighcapacitycdna试剂盒(#4368813)用rnase抑制剂(#n8080119)进行rt反应。用11μl反应量进行qpcr，使用biolinesensimixsybrqpcrmastermix(#qt605-20)，使用用于人tnfr2亚型的特定引物，含有或不含外显子7。

在abiprism7900ht系统中进行qpcr反应。对照扩增曲线人工检测每孔中的rt-qpcr数据。目标基因的相关mrna归一化为rpll3a内标基因的mrna数量。

对于测试的低聚化合物的每个浓度，确定不含外显子7的诱导型tnfr2亚型的表达与含有外显子7的tfnr2亚型的表达(在每种情形下，二者都相对于内标基因rpl13a的表达)的比例(用百分数表述)。用excelxlfit.5add-in(idbs)，在具有个体浓度数据的最佳统计拟合(二次匹配)的曲线函数的基础上计算基于等效浓度ec50。

下表阐明了在tnfr2剪接位点调节中n-p低聚物具有明显低于ep2041161低聚物的ec50。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝o(oet)2

实例20：小鼠中的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调节

在第1、3和5天，含有5只balb/c(jackson实验室)株的小鼠的处理组静脉注射50mg/kgn-p低聚物或等量pbs。在第8天，进行15mg/kglps(大肠杆菌血清型苯酚-lps，sigma型号#l3129内毒素值不少于500,000eu(内毒素单位)/mg))炎症反应刺激。在lps刺激3小时后，杀死动物，准备30mg脾脏和肠系膜淋巴结并立即冷冻于液态氮中。组织样品储存于–80℃冰箱中直到进一步处理。为了提取rna，略少于30mg的组织碎片(用解剖刀剔除多余组织)立即转移到含300μlqiazol和不锈钢珠(qiagen型号69989)的管中用于裂解。根据操作说明，用qiagenrneasy96universaltissuekit(qiagen#74881)从组织样品中提取rna。获得的rna储存在-80℃直至进一步使用。在qpcr分析中，根据使用程序，使用具有rnase抑制剂的高容量cdna反转录试剂盒invitrogen(型号：#4374966)进行rt反应。用biolinesensimixsybrmastermix(#qt605-20)，11ul反应量，使用基于sybrgreen的鉴定和预先验证的转录特异性引物对，制备qpcr反应混合物，三个重复。用abiprism7900ht系统进行实时pcr反应。人工检测rt-qpcr数据，以及基于rna内标基因rpl13a的mrna的数量归一化的目标mrna数量。确定目标mrna(小鼠不含外显子7的tnfr2基因的mrna亚型)的表达水平，作为脾脏或肠系膜淋巴结3个重复的5个中值的中值，在每种情形下，归一化为rpl13a，用于测试组5只小鼠。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

实例21：本发明n-p低聚物和ep2041161及us5719262低聚物在thp1细胞的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控中的效力比较。

实验过程如实例19中所描述的。结果见下表和图3。

相对于ep2041161低聚物，n-p低聚物在thp1细胞中的目标tnfr2的剪接位点调控中具有2.6倍的更强效果，而us5719262低聚物对thp1细胞中的目标tnfr2的调控几乎为零。

^an-p低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^bep2041161低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-p＝o(oet)2

^cus5719262低聚物:r¹＝-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2

实例22：本发明具有不同基团u的n-p低聚物对小鼠肺的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控的影响。

实验过程如实例20中所描述的。

具有通式vii的基团u和式ixc(胆固醇衍生物)或ixd(叶酸衍生物)基团作为r⁴⁶的本发明通式(vi)的受测n-p低聚物展示了对目标tnfr2的剪接位点调节中的基因表达的强有力影响。

例如，使用胆固醇衍生物时，在肺中的影响是pbs阴性对照的560倍，使用叶酸衍生物时是378倍。结果见图4。

实例23：本发明具有不同碱基序列、基团u和根据通式(vi)的不同数量和位置的通式(iv)和(v)基团的n-p低聚物对小鼠肾、肝脏和肺中的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调节的影响。

用本发明n-p低聚物n-p23-1、n-p23-2、n-p23-4进行实验(见图5)。实验过程如实例20中所描述的。

本发明受测的所有n-p低聚物在各种小鼠组织(肾、肝脏和肺)中展示出对没有外显子7的mrna亚型的基因表达的显著影响。例如，在肾中，相对于pbs阴性对照，n-p23-1的影响是其1983倍。结果见图5。

实例24：在本发明n-p低聚物和ep2041161低聚物在小鼠肾中的目标tnfr2(外显子7跳跃)的剪接位点调控中的效力比较。

对n-p低聚物的2个变体(变体1：通式(vi)的所有重复单元yd、zf、yg和zj的总和等于15或14；变体2：根据通式(vi)的通式(iv)和(v)的基团的位置和数量)和相应的ep2041161低聚物的变体进行测试。测试的变体见图6。实验如实例20所描述，区别在于在该实验中，所有动物在lps刺激后两小时即被杀死。

n-p低聚物对没有外显子7的mrna亚型的基因表达的影响，通过与ep2041161低聚物的直接比较，n-p低聚物是ep2041161低聚物的12.6或6.7倍。结果见图6。

实例25：本发明具有20个构建模块的n-p低聚物对mdx小鼠肌肉中的目标肌营养不良蛋白(外显子23跳跃)的剪接位点调控的体内影响。

该实验通过本发明具有20个构件模块的n-p低聚物(通式(vi)的所有重复单元yd、zf、yg和zj的总和为19)开展。测试化合物显示于图7中。该实验如实例20所述，区别在于在该实验中，使用c57bl/10scsn-dmdmdx/j(jackson实验室)株小鼠，动物未使用lps刺激，而且动物在第15天杀死。确定目标mrna(小鼠不含外显子23的肌营养不良蛋白基因的mrna亚型)的表达水平，作为肌肉3个重复中测量的5个中值的中值，归一化为rpl13a。

本发明具有20个构建模块的n-p低聚物在肌肉中对没有外显子23的mrna亚型的基因表达的体内影响是pbs对照组的9倍。结果见图7。