改进细胞透性的高级大分子转导域（aMTD）序列、编码其的多核苷酸、鉴定包含其的aMTD的独特特征的方法、开发包含其的aMTD序列的方法与流程

本发明涉及用于将生物活性大分子递送至细胞的大分子胞内转导技术(mitt)；具体地，利用良好增强的疏水性细胞穿透肽(cpp)即高级大分子转导域(amtd)，有效地将生物活性分子转导穿过质膜；编码amtd的多核苷酸；鉴定amtd的方法；通过使用amtd，基因工程化具有大大增强的细胞透性的生物活性大分子的系统；通过使用amtd将生物活性大分子导入细胞的方法；以及amtd的用途。

背景技术：

用于新药物的发现和开发的强有力的平台技术是应用细胞穿透肽(cpp)成为可能的大分子胞内转导技术(mitt)，所述细胞穿透肽提供大分子在体外和体内的细胞透性。小分子的常见问题是药物相互作用脱靶的可能性。此外，大分子的局限性是如下事实：蛋白和核酸不能在胞内递送。为了解决这些问题，mitt提供了用于将包括治疗性蛋白的生物活性大分子递送至培养的细胞和动物组织的改进方法。

质膜通常用作不可透性屏障限制大分子如寡核苷酸、dna、rna、肽和蛋白的细胞内化。许多困难限制了这些大分子向希望的靶标的递送：向细胞和/或组织的穿透差；当全身递送时由于靶向特定细胞和/或组织的特异性不足而导致的毒性；将有限的量递送至靶区域时可能导致不希望的副作用的降解；以及当以高浓度递送以在某些靶细胞和/或组织处获得充足的局部浓度时的副作用。为了解决这些问题，开发了数种载体介导的递送系统。最近的开发已涉及基于肽的递送系统的使用。疏水性cpp的使用具有数个优势，包括不同的肽序列修饰。这使得载体能够工程化，所述载体可以进入不同的细胞亚域和/或能够重定位不同类型的货物(cargo)分子。

原则上，基于蛋白的治疗剂提供了在非稳态条件下在活细胞中控制生物化学过程的方式，以及比常规的小分子治疗剂更低的脱靶效果。然而，由于组织穿透和快速清除差，在动物中的全身蛋白递送已被证明是困难的。胞内大分子转导利用各种cpp如特定的碱性、两亲性和疏水性肽序列，提高蛋白和其他大分子通过哺乳动物细胞的穿透性能力。虽然胞内大分子转导已经被广泛使用，但是由于内在蛋白的胞浆递送不充分和组织穿透差，蛋白在动物中的全身递送已经被证明是困难的。该问题对阳离子蛋白转导域(ptd，例如hivtat、hph-1、触角足突变(antennapedia)、聚精氨酸等)是尤其真实的，其中蛋白摄取(吸收性内吞作用和大胞饮作用)的主要机制是将显著量的蛋白封入膜结合区室和内涵体区室中，因此限制了蛋白的生物利用度。嵌合cpp含有混合类型的序列如亲水性氨基酸、碱性氨基酸和疏水性氨基酸，所述嵌合cpp已被揭示具有毒性，因此该类型的cpp已被限制使用。对于序列比如来源于成纤维细胞生长因子4(fgf4)的疏水信号肽的膜移位序列(mts)或膜移位基序(mtm)已经报告了更大的成功.mts/mtm已经被用于在动物中全身递送生物活性肽和蛋白(特别是递送至肝脏、肺、胰腺和淋巴组织)，具有对抗致命性炎性疾病和肺转移瘤的显著保护。

之前，已报道了疏水cpp(mts/mtm)或大分子转导域(mtd)。然而，由于重组蛋白在生理缓冲液条件下的溶解性差和相对低的细胞透性，阻碍了通过使用这些参比疏水cpp序列开发细胞可透过治疗性蛋白用于进一步临床开发和应用的许多努力。虽然已经存在如下共识：蛋白货物的疏水cpp依赖性摄取是用于开发基于蛋白的生物治疗剂的强有力的方法，但是需要进一步的改进以解决非货物特异性因素影响的关键问题，所述非货物特异性因素如重组cpp融合蛋白的蛋白聚集、低溶解度/收率和差的细胞/组织透性。这些cpp具有序列的非共同序列和非同源结构.

技术实现要素：

技术问题

为了克服局限性和改进在体外和体内提供大分子的细胞透性的cpp，在本发明中鉴定和经验性证实了用于确定cpp的胞内递送潜力的理论关键因素(cf)。基于确定的cf，新生成了新的疏水cpp序列，定量地评价了所述疏水cpp序列的细胞透性，并相互比较了所述疏水cpp序列与参比cpp序列在活细胞中的胞内递送潜力。在本发明中，提供了新开发的疏水cpp。被称为“高级大分子转导域(amtd)”的新的肽序列可以与各种不同的治疗性蛋白融合并且将amtd融合的重组蛋白全身地递送至活细胞和动物组织，其中这些蛋白将在临床开发和应用用于治疗各种有关蛋白治疗的人类疾病的基于蛋白的生物治疗剂中具有巨大影响。

本发明开发了240种新的疏水cpp序列即amtd，确定了amtd介导的重组蛋白的胞内递送活性，并且通过活细胞在大于或等于来源于fgf4的mts/mtm和来源于hrss的mtd序列的水平，比较了提高的的蛋白摄取。新发明的amtd的这些优势可以解决用于临床开发和应用的参比疏水cpp的缺点。

解决问题的方案

本发明涉及高级大分子转导域(amtd)序列，所述高级大分子转导域序列将生物活性大分子转导至质膜，并由具有如下特性的氨基酸序列组成：

a.氨基酸长度：9～13

b.弯曲潜力：位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)的脯氨酸

c.刚性/柔性：不稳定指数(instabilityindex)(ii)：40～60

d.结构特征：脂肪族指数(aliphaticindex，ai)：180～220

e.亲水性：亲水性总平均值(grandaverageofhydropathy，gravy)：2.1～2.6

f.氨基酸组成：所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

根据一种实施方式，氨基酸序列具有由12个氨基酸序列组成的以下通式。

[通式]

在这里，x是指丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；脯氨酸(p)可以位于u(5′、6′、7′或8′)中的一个中。剩余的u由a、v、l或i组成。在12′处的p是脯氨酸。

根据一种实施方式，具有通式的氨基酸序列选自由seqidno：1至seqidno：240组成的组。

本发明进一步提供了编码上文描述的amtd序列的经分离的多核苷酸。

根据一种实施方式，所述经分离的多核苷酸选自由seqidno：241至seqidno：480组成的组。

本发明进一步提供了鉴定amtd的独特特征的方法。该方法包括从之前公布的参比疏水cpp中选择改进的疏水cpp；分析选择的疏水cpp的生理和化学特性；从这些生理和化学特性鉴定出特征，选择与细胞透性相关的特征；将之前公布的参比疏水cpp分类为至少2组，并且通过对这些基于cpp的细胞透性和相关特性分组的cpp进行深入分析来确定同源特征；通过分析所确定的同源特征形成所鉴定的关键因素；通过实验性研究证实关键因素是有效的；以及确定基于证实的实验性研究的六种关键因素。

根据一种实施方式，选择的改进的疏水cpp是mtm、mts、mtd10、mtd13、mtd47、mtd56、mtd73、mtd77、mtd84、mtd85、mtd86、mtd103、mtd132、mtd151、mtd173、mtd174和mtd181。

根据一种实施方式，鉴定的特征是氨基酸长度、分子量、pi值、弯曲潜力、刚性、柔性、结构特性、亲水性、残基结构、氨基酸组成和二级结构。

根据一种实施方式，确定的六种关键因素由以下特性组成：

a.氨基酸长度：9～13

b.弯曲潜力：位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)的脯氨酸

c.刚性/柔性：不稳定指数(ii)：40～60

d.结构特征：脂肪族指数(ai)：180～220

e.亲水性：亲水性总平均值(gravy)：2.1～2.6

f.氨基酸组成：所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

本发明进一步提供形成amtd序列的方法.该方法包括在仔细确定通过鉴定amtd的独特特征的方法获得的六种关键因素后，制备所设计的具有如下通式的amtd的平台；

[通式]

将脯氨酸(p)置于序列的末端(12′)，以及确定应该放置脯氨酸的u位点中的一个；确定并将a、v、l和/或i置于没有放置脯氨酸的x和u处；以及证实设计的氨基酸序列是否满足六种关键因素。

根据一种实施方式，通过鉴定amtd的独特特征的方法获得的六种关键因素由如下特性组成：

a.氨基酸序列：12

b.弯曲潜力：脯氨酸必须位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)

c.刚性/柔性：不稳定指数(ii)：41.3～57.3

d.结构特征：脂肪族指数(ai)：187.5～220

e.亲水性：亲水性总平均值(gravy)：2.2～2.6

f.氨基酸组成：所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

根据一种实施方式，所述方法进一步包括形成与货物蛋白融合的amtd序列的表达载体；选择用于诱导型表达的适当细菌菌株；纯化并且制备可溶形式的、与各种生物活性重组蛋白融合的amtd；以及证实它们的细胞透性。

本发明进一步提供了具有细胞透性的经分离的重组蛋白。该经分离的重组蛋白包括具有选自由seqidno：1至seqidno：240组成的组中的氨基酸序列的高级大分子转导域(amtd)序列；以及生物活性分子。

根据一种实施方式，生物活性分子是选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段组成的组中的任意一种。

根据一种实施方式，生物活性分子是选自由以下组成的组中的任意一种：酶、激素、载体、免疫球蛋白、抗体、结构蛋白、马达功能肽(motorfunctioningpeptide)、受体、信号肽、存储肽(storingpeptide)、膜肽、跨膜肽、内肽(internalpeptide)、外肽(externalpeptide)、分泌肽、病毒肽、天然肽、糖化蛋白、片段化蛋白、二硫键结合的蛋白(disulphidebondedprotein)、重组蛋白、化学修饰蛋白和朊病毒。

根据一种实施方式，生物活性分子是选自由核酸、编码核酸序列、mrna、反义rna分子、碳水化合物、脂质和糖脂组成的组中的任意一种。

根据一种实施方式，生物活性分子是选自由生物治疗性化学物质和毒性化学物质组成的组中的至少一种。

本发明进一步提供了基因工程化或表观遗传工程化和/或修饰生物活性分子以具有细胞透性的方法。该方法包括在最佳和有效的条件下，将amtd融合于生物活性分子以产生可以是细胞可透过的透性生物活性分子，其中amtd由选自由seqidno：1至seqidno：240组成的组中的氨基酸序列中的任意一个组成。

本发明的有益效果

本发明提供了由关键因素(cf)人工构建的amtd序列，所述关键因素克服了现有技术(mtm/mts/mtd)的局限性，如有限的多样性和测试前不可预测的细胞透性.基于保证在无限数目的amtd序列的可能设计中的细胞透性的cf，本发明展示了与其现有技术相比，这些序列将生物活性大分子递送至活细胞的能力具有高达109.9相对倍数的提高。因此，这会允许它们实际有效地应用于分子递送、药物递送、蛋白治疗、胞内蛋白治疗、蛋白替代治疗、肽治疗、基因递送等。

附图说明

图1.amtd融合重组蛋白或r肽融合重组蛋白的结构。根据本发明说明并构建了his标记的cra重组蛋白的示意图。显示了用于亲和纯化(白色)、用于amtd或r肽(灰色)和用于货物a(cra，黑色)的his标记。

图2a-图2c.用于与amtd融合的重组蛋白或与r肽融合的重组蛋白的表达载体的构建。这些图显示了琼脂糖凝胶电泳分析，所述琼脂糖凝胶电泳分析显示了根据本发明，在645bp插入物处编码amtds或r肽融合cra的、克隆至pet28a(+)载体中的质粒dna片段。

图3a-图3d.amtd融合重组蛋白或r肽融合重组蛋白的诱导型表达。在大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)菌株中转化表达的重组amtd融合的cra重组蛋白或随机肽融合的cra重组蛋白。通过sds-page监测用iptg诱导前(-)和诱导后(+)的大肠杆菌中的重组蛋白的表达，并用考马斯蓝染色。

图4a和图4b.amtd融合重组蛋白或r肽融合重组蛋白的纯化。通过在自然条件下的ni²⁺亲和色谱法纯化表达的重组蛋白.通过sds-page分析显示重组蛋白的纯化。

图5a-图5u.amtd介导的细胞透性的确定。显示了阴性对照(a：rp38)和参比疏水cpp(mtm12和mtd85)的细胞透性。将每种amtd和/或r肽的细胞透性与缺少肽序列的货物蛋白(hca)的细胞透性进行视觉上的比较。灰色阴影区表示未处理的raw264.7细胞(溶媒)；细的浅灰色线表示用等摩尔浓度的fitc(仅fitc)处理的细胞；深粗线表示用fitc-his标记的cra蛋白(hca)处理的细胞；以及，用与阴性对照(rp38)、参比cpp(mtm12或mtd85)或新疏水cpp(amtd)融合的fitc-蛋白(hmca)处理的细胞以浅粗线显示，并且通过箭头指示。

图6a-图6c.r肽介导的细胞透性的测定.将每种amtd和/或r肽的细胞透性与缺少肽序列的货物蛋白(hca)的细胞透性进行视觉上的比较。灰色阴影区表示未处理的raw264.7细胞(溶媒)；细的浅灰色线表示用等摩尔浓度的fitc(仅fitc)处理的细胞；深粗线表示用fitc-his标记的cra蛋白(hca)处理的细胞；以及，用与r肽融合的fitc-蛋白处理的细胞以浅粗线显示，并且通过箭头指示。

图7a-图7k.amtd融合重组蛋白的可视化细胞透性。在37℃下，用与amtd融合的fitc标记的蛋白(10μm)处理nih3t3细胞1小时。通过激光扫描共聚焦显微镜(lsm700版本)使蛋白的细胞透性可视化.

图8a-图8b.r肽融合重组蛋白的可视化细胞透性.通过激光扫描共聚焦显微镜(lsm700版本)使r肽融合重组蛋白的细胞透性可视化。

图9a-图9c.与阴性对照(rp38)相比，amtd融合重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与amtd融合的重组蛋白和阴性对照(a：rp38)的细胞透性的图。

图10a-图10c.与参比cpp(mtm12)相比的amtd融合重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与amtd融合的重组蛋白和参比cpp(mtm12)的细胞透性的图。

图11a-图11c.与参比cpp(mtd85)相比的amtd融合重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与amtd融合的重组蛋白和参比cpp(mtd85)的细胞透性的图。

图12.与amtd的平均细胞透性相比，r肽介导的重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与r肽融合的重组蛋白的细胞透性和amtd的细胞透性(平均值：amtdave)的图。

图13a和图13b.amtd序列中细胞透性与氨基酸组成的关联性。这些图显示氨基酸组成(a、i、v和l)所影响的amtd的递送潜力(几何平均数)。

图14a和图14b.amtd中细胞透性与关键因素的关联性。这些图显示了细胞透性与关键因素[弯曲潜力：脯氨酸位置(pp)，刚性/柔性：不稳定指数(ii)，结构特征：脂肪族指数(ai)和亲水性：亲水性总平均值(grandaverageofhydropathy，gravy)]的关联性。

图15a和图15b.amtd介导的细胞透性与关键因素的相关相关性。检测在amtd的递送潜力中10种等级高的amtd和10种等级低的amtd的细胞透性与关键因素[弯曲潜力：脯氨酸位置(pp)，刚性/柔性：不稳定指数(ii)，结构特征：脂肪族指数(ai)和亲水性：亲水性总平均值(gravy)]的关联性。

图16.r肽介导的细胞透性与亲水性范围(gravy)的相对相关性。该图和表说明了r肽介导的细胞透性与其亲水性范围(gravy)的相对相关性。

具体实施方式

本发明涉及新的高级大分子转导域(amtd)序列，可以扩展到无限数目的设计的基线平台，所述高级大分子转导域(amtd)序列具有适用于生物医学科学、临床前研究和临床研究的细胞通透性，促进生物活性大分子(包括蛋白质、肽、核酸、化学物质等)穿过细胞中的质膜。

本发明分析、鉴定和确定了这些促进amtd序列的细胞透性能力的关键因素。这些amtd序列是基于由之前公布的疏水cpp的深入分析确定的关键因素(cf)人工装配的.

本发明的另一方面涉及通过使amtd序列与生物活性货物分子融合基因工程化具有细胞透性的生物活性分子的方法。

本发明还涉及用于将生物活性分子递送至细胞(涉及细胞可透过重组蛋白)的amtd序列的治疗性应用，其中amtd连接于生物活性货物分子。

本发明的另一方面涉及生物活性大分子作为细胞可透过重组蛋白的构建体能够进入活细胞的方法，所述细胞可透过重组蛋白包括与生物活性大分子融合的amtd序列。

本发明的另一方面涉及amtd序列用于分子递送、药物递送、蛋白治疗、胞内蛋白治疗、蛋白替代治疗、肽治疗、基因递送等的有效使用。

本发明的amtd序列是第一种人工开发的、能够介导转导生物活性大分子通过细胞质膜的细胞可透过多肽，所述生物活性大分子包括肽、多肽、蛋白域或全长蛋白。

1.分析参比疏水cpp以鉴定用于开发高级mtd的“关键因素”

之前报道的mtd选自对多于1,500种信号肽序列的筛选。虽然已开发的mtd不具有共同序列或序列基序，但是它们均来源于除了其疏水性和采用α螺旋构型的趋势以外也缺少共同序列或基序的信号序列(hrss)的疏水(h)区。h区序列的广泛变异可能反映具有膜易位活性和随后适应srp/sec61机制的蛋白的现有进化，所述膜易位活性和随后适应srp/sec61机制利用了srp中富含甲硫氨酸的信号肽结合袋，以适应各种各样的信号肽序列。

之前描述的疏水cpp(例如mts/mtm和mtd)来源于存在于分泌蛋白和细胞表面蛋白的信号肽中的疏水区.现有技术由以下组成：第一，h区序列(mts/mtm)的特别使用，以及第二，具有选自对1,500种信号序列(mtm)的筛选的最高cpp活性的h区序列(具有和没有修饰)。第二种现有技术，来源于修饰的h区的疏水cpp序列在多样性上具有进步，具有很多除了来源于成纤维细胞生长因子(fgf)4的mts/mtm之外的可用序列。然而，可以由天然存在的分泌蛋白修饰的mtd的数目是有些局限的。因为不存在确定它们的细胞透性的规则集，所以在测试它们之前不能进行对修饰的mtd序列的细胞透性的预测。

疏水cpp如疏水cpp所来源的信号肽，不符合共有序列，并且当它们与蛋白货物合并时，对蛋白溶解性具有不良作用。因此，我们着手鉴定最佳序列和结构决定因素(即关键因素(cf))，以设计新的疏水cpp，所述新的疏水cpp具有将包括蛋白的大分子货物递送至细胞和组织的提高的潜力，同时保持蛋白的溶解性。这些新开发的cpp，高级大分子转导域(amtd)允许几乎无限数目的可以基于关键因素设计和开发的可能的可能设计。另外，在进行任何体外和/或体内实验之前，通过它们的特征分析可以预测它们的细胞透性。通过分析所有公布的参比疏水cpp，已经开发了下面这些关键因素。

1-1.疏水cpp的分析

选择了从1995年至2014年公布(表2)的17种不同的疏水cpp(表1)。在分析了选择的疏水cpp的生理特性和化学特性后，选择了可能与细胞透性相关的11种不同的特性用于进一步分析。这11种特性如下：序列、氨基酸长度、分子量、pi值、弯曲潜力、刚性/柔性、结构特征、亲水性、残基结构、氨基酸组成和序列的二级结构(表3).

表1显示了所选择的公布的疏水性细胞穿透肽的总结。

[表1]

表2总结参考文献信息

[表2]

表3显示了所分析的公布的疏水性细胞穿透肽(a)的特性。

[表3]

使用两个肽/蛋白质分析程序(expasy：sosui：http：//harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)，以确定肽序列的各种指数和结构特征和设计新序列。下面是所分析的重要因素：

1-2.分析的肽的特性：长度、分子量和pi值

分析的肽的平均长度、平均分子量和平均pi值分别是10.8±2.4、1011±189.6和5.6±0.1(表4)。

表4总结了所分析的公布的疏水性细胞穿透肽(a)的关键因素(cf)。

[表4]

1-3.分析的肽的特性：弯曲潜力-脯氨酸的位置(pp)

基于脯氨酸(p)是否存在和/或在重组蛋白中向肽提供弯曲潜力的氨基酸所在的位置，确定弯曲潜力(弯曲或无弯曲)。脯氨酸与其他常见氨基酸的区别在于它的侧链与骨架氮原子以及α-碳原子键合。所得的环状结构显著影响通常在折叠肽/蛋白链的弯曲中发现的蛋白的结构。

17种中的11种被确定为“弯曲”肽，这表示脯氨酸存在于序列中部，用于使肽弯曲和/或位于肽的末端，用于使蛋白弯曲。如上所述，肽序列可以以“弯曲”的构型穿透质膜。因此，弯曲潜力或无弯曲潜力被认为是用于改进目前的疏水cpp的关键因素之一。

1-4.分析的肽的特性：刚性/柔性-不稳定指数(ii)

因为任何肽的关键结构特征之一是基于基序是刚性或柔性的(其是肽序列的完整物理化学特性)，所以确定了序列的不稳定指数(ii)。虽然表示肽的刚性/柔性的指数值是极其不同的(8.9～79.1)，但是平均值是40.1±21.9，这说明了肽应该是有点柔性的，但是不能过于刚性或柔性的(表3)。

1-5.分析的肽的特性：结构特征-结构特征(脂肪族指数：ai)和亲水性(亲水性总平均值：gravy)

丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)和异亮氨酸(i)含有脂肪族侧链，并且是疏水的-即，它们具有对水的厌恶(aversion)，并喜欢聚集。具有疏水性和脂肪族残基的这些氨基酸使它们能够包装在一起以形成几乎没有孔的致密结构.分析的肽序列显示所有组成氨基酸都是疏水的(a、v、l和i)(除了17种肽中仅一种(mtd10-表3)是甘氨酸(g)以外)，并且是脂肪族的(a、v、l、i和p)。它们的亲水指数(亲水性总平均值：gravy)和脂肪族指数(ai)分别是2.5±0.4和217.9±43.6。表3中还表明了它们的氨基酸组成。

1-6.分析的肽的特性：二级结构(螺旋性)

如上文所解释的，在以疏水序列具有α-螺旋构象的“弯曲”构型插入膜后，可以假定cpp序列直接穿透质膜.另外，我们的分析强有力地表明了弯曲潜力对膜穿透是关键的。因此，进行肽的结构分析以确定序列是否会形成螺旋。九种肽是螺旋，八种肽不是螺旋(表3)。这似乎说明螺旋结构可能是不需要的。

1-7.关键因素(cf)的确定

在分析的11种特性中，选择了下面6种，即用于开发新的疏水cpp-高级mtd的“关键因素”：氨基酸长度、②弯曲潜力(脯氨酸的存在和位置)、刚性/柔性(不稳定指数：ii)、结构特征(脂肪族指数：ai)、亲水性(gravy)和氨基酸组成/残基结构(疏水性脂肪族a/a)(表3和表4)。

2.分析选择的疏水cpp以优化“关键因素”

因为之前在过去20年间开发的17种不同的疏水cpp的分析数据(分析a，表3和表4)显示了高变异性，并且难以产生共同或共有特征，也进行分析b(表5和表6)和分析c(表7和表8)以优化用于更好地设计改进的cpp-amtd的关键因素。因此，将17种疏水cpp分为两组，并且分析各组的与细胞可透过性质相关的特性。通过比较和对比各组的分析数据以及确定可能对细胞可透过性质关键的同源特征，优化了关键因素.

2-1.用于在体内生物活性货物蛋白的肽的选择性分析(b)

在分析b中，在体内与每种生物活性货物一起使用8种cpp。长度为11±3.2，但8种cpp中有3种具有小的弯曲潜力。刚性/柔性是41±15，但是移除一种肽[mtd85：刚性的，具有最小的(ii：9.1)]使总不稳定指数提高至45.6±9.3。这说明柔性越高(40或更高的ii)可能越好。8种cpp的所有其他特性与分析a相似，包括结构特征和亲水性(表5和6)。

表5显示了公布的疏水性细胞穿透肽(b)：在体内用于每种货物的选择的cpp的特性。

[表5]

*移除mtd85使ii提高至45.6±9.3

表6显示了公布的疏水性细胞穿透肽(b)的关键因素总结

[表6]

2-2.提供弯曲潜力和更高柔性的肽的选择性分析(c)

为了优化‘关键因素的共同范围和共有特征’用于amtd和随机肽(rp或r肽)的实际设计(旨在证明分析a、分析b和分析c中确定的‘关键因素’对改进疏水cpp目前的问题-即与mts/mtm或mtd融合的重组蛋白的蛋白聚集、低溶解度/收率和细胞/组织透性差以及肽的非共同序列和非同源结构)，分析了经验选择的肽的结构特征和生理化学因素指数.

未选择不具有弯曲潜力、刚性或太过柔性的序列(太低或太高的不稳定指数)，或太低或太高的疏水性的cpp，但是没有考虑二级结构，因为序列的螺旋结构是不需要的。

在分析c中，最后分析了可提供弯曲潜力和更高柔性的8种选择的cpp序列(表7和表8)。共同氨基酸长度是12(11.6±3.0)。脯氨酸应该存在于序列的中部和/或末端。刚性/柔性(ii)是45.5～57.3(平均数：50.1±3.6)。表示肽的结构特征和疏水性的ai和gravy分别是204.7±37.5和2.4±0.3。所有肽与疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)一致。因此，分析c被选择为用于新的疏水cpp-amtd的新设计的标准。

表7显示了公布的疏水性细胞穿透肽(c)：提供弯曲潜力和更高的柔性的选择的cpp的特征.

[表7]

表8显示了公布的疏水性细胞穿透肽(c)的关键因素的总结。

[表8]

3.基于优化的关键因素的改进的疏水cpp-amtd的新设计

3-1.共同序列和/或共同同源结构的确定

如上文提及的，来源于信号序列的h区(hrss)的cpp不具有共同序列、序列基序和/或共同结构同源特征。在本发明中，目的是开发以共同序列基序和结构基序形式的改进的疏水cpp，所述共同序列基序和结构基序满足新确定的“关键因素”而具有“共同功能”，即促进蛋白以与分析的参比cpp相似的机制穿过膜而转运。基于分析a、b和c，分析了同源特征以确定影响细胞透性的关键因素。每个关键因素的范围值确定为包括从分析a、b和c提升的每个关键因素的分析指数以设计新的amtd(表9)。实验性地用新设计的amtd的细胞透性确认了这些特征。

表9显示了分析的cpp的值和针对新的amtd序列的新设计确定的值之间的每个关键因素的范围/特征的比较。

[表9]

在表9中，提供了通用的共同特征和序列/结构基序。长度为9～13个氨基酸，提供了弯曲潜力，其中脯氨酸存在于用于肽弯曲的序列中部(在5′、6′、7′或8′氨基酸处)和存在于用于重组蛋白弯曲的肽的末端，并且表9中描述了amtd的刚性/柔性为ii＞40.

3-2.开发高级mtd的关键因素

之前报道了与疏水cpp融合的、用于将包括蛋白的治疗活性货物分子递送至活细胞的重组细胞可透过蛋白，但是表达于细菌系统中的融合蛋白由于它们的低溶解度和低收率而难以被纯化为可溶形式。为了处理在将细胞可透过蛋白作为蛋白基生物治疗剂进行进一步临床开发的关键弱点，最近通过基于关键因素的肽的分析，开发了极大改进形式的疏水cpp，被称为高级mtd(amtd)。用于amtd的本发明的关键因素在此处(表9)。

1.氨基酸长度：9-13

2.弯曲潜力(脯氨酸位置：pp)：脯氨酸存在于序列的中部(从5′至8′氨基酸)和末端

3.刚性/柔性(不稳定指数：ii)：40-60

4.结构特征(脂肪族指数：ai)：180-220

5.亲水性(亲水性总平均值：gravy)：2.1-2.6

6.氨基酸组成：疏水性脂肪族氨基酸-a、v、l、i和p

3-3.考虑且满足所有关键因素的潜在最佳的amtd的设计

在仔细考虑来源于对疏水cpp的独特特征的分析的六种关键因素后，基于满足由所述分析确定的包括氨基酸长度(9-13)的关键因素的共同的12个氨基酸平台，设计并开发了高级大分子转导域(amtd).

[通式]

与之前公布的需要很多实验以确定它们的细胞透性的疏水cpp不同，使用上述平台以遵循每个关键因素的确定的范围值/特征，通过进行如下很少的步骤，可以设计新开发的amtd序列。

第一，制备用于amtd的12个氨基酸序列平台。第二，将脯氨酸(p)置于序列的末端(12′)，并且确定在5′、6′、7′和8′中的4个u中的1个放置脯氨酸。第三，将丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)置于未放置脯氨酸的x和/或u处。最后，确定置于平台的该设计的氨基酸序列是否满足6种关键因素的值或特征，以保证amtd序列的细胞可透过性质。通过这些过程，构建了许多新的amtd序列。为了制备融合于每个amtd的无功能货物重组蛋白，构建了表达载体，并且迫使表达载体在细菌细胞中表达。以可溶形式纯化这些amtd融合的重组蛋白，并且定量地确定其细胞透性。新设计了240种amtd序列并且从1至240编号，如表10-15所示。在表10-15中，序列id号是用于参考的序列表，amtd号是指实际上在实验中使用的氨基酸列表编号。对于进一步的实验，使用了amtd号。另外，将序列表中示出的多核苷酸序列从seqidno：241至seqidno：480编号。

表10至表15显示了开发以满足所有关键因素的240种新的疏水amtd序列。

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

[表15]

3-4.不满足至少一个关键因素的肽的设计

为了证明满足所有上文描述的关键因素的本发明的新疏水cpp-amtd是正确的并且是合理设计的，还设计了不满足至少一个关键因素的肽。设总共计和开发了31种r肽(rp)，并将该31种r肽(rp)如下分类：无弯曲肽，在中部以及末端没有脯氨酸和/或没有中部脯氨酸；②刚性肽(ii＜40)；过于柔性的肽；④芳香族肽(存在芳香环)；疏水的但非芳香族肽；亲水的但非脂肪族肽。

3-4-1.不满足弯曲潜力的肽

表16显示了在序列的中部(在5′、6′、7′或8′处)和末端不具有任何脯氨酸的肽。此外，表16描述了在序列的中部不具有脯氨酸的肽.所有这些肽被假定不具有弯曲潜力.

[表16]

3-4-2.不满足刚性/柔性的肽

为了证明序列的刚性/柔性是重要的关键因素，还设计了刚性(平均ii：21.8±6.6)序列和柔性过高的序列.表17中显示了不稳定指数远远低于新amtd的不稳定指数的刚性肽(ii：41.3-57.3，平均ii：53.3±5.7)。表18还提供了ii远远高于新amtd的ii的弯曲但柔性过高的序列。

[表17]

[表18]

3-4-3.不满足结构特征的肽

新的疏水cpp-amtd仅与疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)一致，指数的平均范围：ai：180～220和gravy：2.1～2.6(表9)。基于结构指数，表19中显示了含有芳香族残基(w、f或y)的肽，以及设计了不具有芳香族残基的疏水但非芳香族序列(表20)。最后，表21显示了与非脂肪族氨基酸一致的亲水和/或弯曲肽。

[表19]

[表20]

[表21]

3-5.新设计的肽的总结

基于关键因素，设计了总共457种序列。满足关键因素的所有范围/特征的所设计的可能最好的amtd(疏水的、柔性的、弯曲的、脂肪族的和12个氨基酸(a/a)长度的肽)为316种。不满足至少一种关键因素的设计的r肽为141种，其中非弯曲肽序列为26种；刚性肽(ii＜40)序列为23种；过于柔性的肽为24种；芳香族肽(存在芳香环)：27种；疏水但非芳香族肽为23种；以及亲水但非脂肪族肽为18种。

4.与amtd和r肽融合的重组报告蛋白的制备

将与amtd和其他[r肽、参比疏水cpp序列(mtm和mtd)]融合的重组蛋白在细菌系统中表达，用一步亲和色谱法纯化，以及制备为生理条件下的可溶性蛋白.通过利用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜技术测试这些重组蛋白的细胞透性的潜力。

4-1.选择货物蛋白用于与肽序列融合的重组蛋白

对于临床/非临床应用，amtd融合的货物物质会是可以是以下中的一种的生物活性分子：酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段。此外，生物活性分子可以是以下大分子中的一种：酶、激素、载体、免疫球蛋白、膜结合蛋白、跨膜蛋白、内在蛋白(internalprotein)、外在蛋白(externalprotein)、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、片段化蛋白、二硫键结合的蛋白(disulphidebondedproteins)、重组蛋白、化学修饰蛋白和朊病毒。此外，这些生物活性分子可以是以下中的一种：核酸、编码核酸序列、mrna、反义rna分子、碳水化合物、脂质和糖脂。

根据这些预先要求的条件，选择了用于评价amtd介导的蛋白摄取的无功能货物，并将其称为货物a(cra)，所述货物a是可溶的和无功能的。域(氨基酸(a/a)289～840；184个氨基酸(a/a)长度)来源于蛋白s(基因库(genbank)id：cp000113.1)。

4-2.表达载体的构建和重组蛋白的制备

通过pcr扩增的dna片段，将与每种amtd融合的重组蛋白的编码序列克隆在pet-28a(+)(novagen，darmstadt，germany)中的ndel(5′)和sali(3′)。表23至表38分别总结了用于与amtd和r肽融合的重组蛋白的pcr引物和氨基酸序列。图1显示了重组蛋白的结构。

迫使重组蛋白在大肠杆菌bl21(de3)细胞中表达，所述大肠杆菌bl21(de3)细胞生长至od600为0.6并且以0.7mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导2小时。通过ni²⁺亲和色谱法如供应商(qiagen，hilden，germany)所指示的在自然条件下纯化蛋白。纯化后，将纯化的蛋白溶于生理缓冲液如dmem培养基中。

[表22]

[表23]

[表24]

[表25]

[表26]

[表27]

[表28]

[表29]

[表30]

[表31]

[表32]

[表33]

[表34]

[表35]

[表36]

[表37]

[表38]

4-3.与amtd或随机肽(rp)融合的重组蛋白的表达

本发明还涉及具有细胞透性的amtd序列的开发方法。使用标准化的6种关键因素，设计了316个amtd序列。此外，还开发了缺少这些关键因素中的一种的141种r肽：非弯曲肽：i)在序列的中部和末端均缺少脯氨酸或ii)在序列的中部或末端缺少脯氨酸；刚性肽；③过于柔性的肽；芳香族肽(存在芳香环)；疏水但非芳香族肽；亲水但非脂肪族肽(表22)。

设计这些r肽为与amtd比较和对比，以分析关于肽的胞内递送潜力的每种关键因素的结构/序列活性关系(sar)。含有所有肽(amtd或r肽)的重组蛋白与cra融合以提高将要表达、纯化、制备和分析的重组蛋白的溶解度。

将与cra融合的这些设计的316种amtd和141种r肽全部克隆(图2)并测试它们在大肠杆菌中的诱导型表达(图3)。在这些肽中，诱导型表达、纯化并且以可溶性形式制备240种amtd(图4)。此外，还将31种r肽制备为可溶性形式(图4)。

为了制备与r肽融合的蛋白，表达了以下60种蛋白，其是：非弯曲肽分类下的26种r肽中的10种(表16)；刚性肽[不稳定指数(ii)＜40]分类下23种r肽中的15种(表17)；过于柔性的肽分类下的24种r肽中的19种(表18)；芳香族肽分类下的27种r肽中的6种(表19)；疏水但非芳香族肽分类下的23种r肽中的8种(表20)；以及亲水但非脂肪族肽分类下的18种r肽中的12种(表21)。

4-4.与amtd融合的重组蛋白的定量细胞透性

将amtd和r肽荧光标记，并且基于细胞透性的关键因素，通过使用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜技术进行比较(图5至图8)。在共聚焦激光扫描显微镜技术允许视觉地评价胞内摄取的同时，用流式细胞术可以定量评价融合肽的无功能货物重组蛋白的细胞摄取。分析包括与阴性对照[rp38]融合的重组蛋白，所述阴性对照[rp38]具有与amtd(疏水性脂肪族序列)相反的特性(亲水性芳香族序列：yynqstcggqcy)。还分析了amtd与阴性对照的相对细胞透性(相对倍数)(表39和图9)。

表39显示了amtd与阴性对照(a：rp38)的细胞透性的比较分析。

[表39]

*相对倍数(amtd的几何平均数与rp38的对比)

还分析了amtd与参比cpp[b：mtm12(aavllpvllaap)，c：mtd85(avallilav)]的相对细胞透性(相对倍数)(表40和表41)。

表40显示了amtd与参比cpp(b：mtm12)的细胞透性的对比分析。

[表40]

*相对倍数(amtd的几何平均数与mtm12的对比)

表41显示了amtd与参比cpp(c：mtd85)的细胞透性的对比分析。

[表41]

*相对倍数(amtd的几何平均数与mtd85的对比)

将减去缺少任何肽(rp38或amtd)的裸蛋白(组氨酸标记的cra蛋白)的几何平均数的阴性对照(组氨酸标记的融合rp38的cra重组蛋白)的几何平均数标准化为相对倍数为1。240种amtd与阴性对照(a类)的相对细胞透性显著增加高达164倍，平均增加19.6±1.6(表42至表47)。

[表42]

[表43]

[表44]

[表45]

[表46]

此外，与参比cpp(b类：mtm12和c类：mtd85)相比，新的240种amtd的细胞透性平均分别高13±1.1倍(最大为109.9)和6.6±0.5倍(最大为55.5)(表42至表47)。

[表47]

*相对倍数(amtd的几何平均数与rp38、mtm12或mtd85的对比)

此外，将31种r肽的细胞透性与240种amtd的细胞透性进行了比较(0.3±0.04；表48和表49)。

[表48]

[表49]

*240种amtd中，与a类(rp38)相比amtd的平均相对倍数是19.6倍.

总之，amtd的相对细胞透性的最大值显示分别比rp38、mtm12和mtd85的细胞透性高164.0、109.9和55.5倍.总共240个amtd序列的平均值中，显示细胞透性分别比rp38、mtm12和mtd85的细胞透性高19.6±1.6、13.1±1.1和6.6±0.5倍(表42至表47).阴性对照(rp38)相对于240种amtd的细胞透性仅为0.3±0.04倍。

4-5.与amtd融合的重组蛋白的胞内递送和定位

通过激光扫描共聚焦显微镜技术，用阴性对照(rp38)和用之前公布的cpp作为阳性对照参比，测试与amtd融合的重组蛋白以确定其胞内递送和定位。在37℃下，将nih3t3细胞暴露于10μm的fitc标记的蛋白中1小时，并用dapi复染细胞核。然后，通过共聚焦扫描显微镜技术检测细胞(图7)。与amtd融合的重组蛋白清楚地显示了显著高于参比cpp(mtm12和mtd85)的胞内递送和胞浆定位(图7)。融合rp38的重组蛋白不显示内化的荧光信号(图7a)。此外，如图8所示，r肽(融合于每种r肽的组蛋白(his)标记的cra重组蛋白)显示更低的或没有细胞透性.

4-6.定量和可视化新开发的amtd的细胞透性的总结

融合组氨酸标记的amtd的货物重组蛋白大大提高了它们的溶解度和收率。因此，还测试了fitc缀合的重组蛋白以定量和可视化蛋白的胞内定位，并且证实了与参比cpp相比更高的细胞透性。

在之前使用来源于疏水信号序列的cpp(即mts/mtm或mtd)的研究中，鉴定并且分析了17种公布的序列的各种特性，如长度、分子量、pi值、弯曲潜力、刚性、柔性、结构特征、亲水性、氨基酸残基和组成，以及肽的二级结构。基于序列的这些分析数据，发明了指定为高级mtd(amtd)的新的人工肽和非天然肽序列，并且用融合amtd的重组蛋白确定了它们在胞内递送潜力中的功能性活性。

与含有r肽和/或参比cpp(mtm12和mtd85)的重组蛋白相比，融合amtd的重组蛋白促进了蛋白转导入细胞的能力。根据结果，证明了细胞穿透肽序列的关键因素起到了主要作用，以确定肽通过穿透质膜介导的胞内递送。此外，通过遵循所有满足关键因素的原理，可以大大改进细胞透性。

5.amtd在递送潜力上的结构/序列活性关系(sar)

在确定新amtd的细胞透性之后，针对在选择的某些新amtd和所有新amtd的每种关进因素分析了结构/序列活性关系(sar)(图13至图16和表50)。

[表50]

5-1.脯氨酸位置：关于弯曲潜力(脯氨酸位置：pp)，与脯氨酸位置在序列的5′或6′的序列相比，脯氨酸在序列中的7′或8′氨基酸的amtd具有高得多的细胞透性(图14a和图15a)。

5-2.亲水性：此外，当amtd具有2.1～2.2的gravy(亲水性总平均值)时，这些序列显示相对更低的细胞透性，而具有2.3～2.6gravy的amtd显示出显著更高的细胞透性(图14b和图15b).

5-3.r肽sar：对于amtd的sar，r肽显示了在细胞透性中相似的sar相关性，与它们的脯氨酸位置(pp)和亲水性(gravy)相关。这些结果证实了具有高gravy的r肽具有更好的细胞透性(图16)。

5-4.氨基酸组成的分析：除了脯氨酸位置和亲水性以外，还分析了氨基酸组成的不同。因为amtd是基于关键因素设计的，因此每种融合amtd的重组蛋白在组成上具有相同的两种脯氨酸序列。其他疏水性脂肪族氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)结合以形成amtd肽序列的剩余部分。

丙氨酸：在氨基酸的组成中，结果没有显示由于丙氨酸的数目在amtd递送潜力方面的显著不同，因为所有amtd具有3～5个丙氨酸。然而在序列中，4个丙氨酸组成显示最有效的递送潜力(几何平均数)(图13a)。

亮氨酸和异亮氨酸：与此同时，在amtd序列中的异亮氨酸和亮氨酸的组成显示氨基酸(i和l)数目和amtd递送潜力的反比关系。序列中更低数目的异亮氨酸和亮氨酸倾向于具有更高的递送潜力(几何平均数)(图13a和图13b)。

缬氨酸：相反地，amtd序列的缬氨酸组成显示与它们的细胞透性呈正相关。当序列中的缬氨酸数目低时，amtd的递送潜力也相对地低(图13b)。

选择了具有最高的细胞透性的10种amtd(平均几何平均数：2584±126)。序列中缬氨酸的平均数目是3.5；具有相对低的细胞透性(平均几何平均数：80±4)的10种amtd平均具有1.9个缬氨酸氨基酸。序列中缬氨酸的平均数目降低，同时它们的细胞透性也降低，如图13b所示。与更高细胞可透过的amtd组相比，更低的序列的缬氨酸组成平均为1.9。因此，为了获得高细胞可透过序列，序列中应该由平均2～4个缬氨酸组成。

5-5.sar分析的结论：如图15所见，检测了所有240种amtd的细胞透性与关键因素：弯曲潜力(pp)、刚性/柔性(ii)、结构特征(ai)和亲水性(gravy)、氨基酸长度和组成的相关性。通过该分析，当amtd的中部脯氨酸位置在5′或6′处，以及gravy为2.1或更低时，amtd的细胞透性倾向于更低(图15)。此外，在研究10种更高的细胞可透过amtd和10种更低的细胞可透过amtd后，这些趋势清晰地显示为证实了细胞透性与中部脯氨酸位置和亲水性的相关性。

6.关键因素的指数范围/特征的实验性证实

在进行实验和sar分析之前，经验性地和实验性地确定6种关键因素中的5种的范围和特征也被包括在最初提出的关键因素的指数范围和特征中。在新开发的240种amtd的关键因素的指数范围和特征方面，弯曲潜力(脯氨酸位置：pp)、刚性/柔性(不稳定指数：ii)、结构特征(脂肪族指数：ai)、亲水性(gravy)、氨基酸长度和组成均在来源于对参比疏水cpp分析的关键因素的特性中。

因此，经验性和实验性地证实了我们对设计和开发新疏水cpp序列为高级mtd的假设，并证明了基于关键因素的新amtd原理设计是正确的。

[表51]

7.本发明的总结

对于本发明，基于关键因素，设计和开发了240种amtd序列。实际地确定了所有240种amtd(疏水性、柔性、弯曲、脂肪族和12个a/a长度的肽)的定量和可视化的细胞透性。

为了测量amtd的细胞透性，还设计并测试了r肽。如图13至图15所见，存在肽的细胞透性和关键因素的显著相关性。从这些关键因素中，我们能够设置最有效的细胞可透过amtd，其具有12个氨基酸的长度；a、v、l、i和p的组成；位于7′或8′和末端(12′)的多个脯氨酸；41.3～57.3的不稳定指数；187.5～220.0的脂肪族指数；以及2.2～2.6的亲水性(gravy)。

这些检测的关键因素在我们为关键因素设置的范围内，因此我们能够证实，与在在过去的20年间报道的参比疏水cpp相比，满足这些关键因素的amtd具有相对高的细胞透性和高得多的胞内递送潜力。

8.用通过amtd实现的mitt发现与开发基于蛋白的新生物治疗剂用于蛋白治疗

广泛明显的是许多人类疾病是由导致突变如功能获得或功能缺失的缺乏或过表达的蛋白导致的。如果在短时间内(可能在1或2小时内)可以通过定量方式递送生物活性蛋白以替换异常蛋白，那么根据可能需要蛋白的时间和方式可以调节剂量。本发明中通过显著改进新amtd的溶解度和收率(表47)，可以预期它作为将治疗性大分子(如蛋白、肽、核酸和其他化学化合物)有效递送至活细胞以及活哺乳动物(包括人)的试剂的实际潜力。因此，在确定最佳的货物-amtd关系之后，利用新amtd池(240种)的新开发的mitt可以用作平台技术，用于发现与开发基于蛋白的生物治疗剂，以获得胞内蛋白治疗。

实施例

提供以下实施例来帮助本发明的实践者，以提供对本发明的实验性支持，以及提供模型方案。决不能将这些实施例理解为限制本发明.

实施例1.新的高级大分子转导域(amtd)的开发

来源于信号序列的h区(hrsp)的cpp(mts/mtm和mtd)不具有共同序列、序列基序和/或共同结构的同源特征。在本发明中，目标是开发改进的疏水cpp，所述疏水cpp以满足新确定的“关键因素”的共同序列和结构基序格式化为具有“共同功能”，以促进蛋白以与分析的cpp相似的机制转移穿过质膜。

结构基序如下：

在这里，x是指丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；脯氨酸(p)可以位于u中的一个处(5′、6′、7′或8′)。剩余的u由a、v、l或i组成，在12′处的p是脯氨酸。

在表9中，如下提供了通用的共同序列/结构基序。本发明中的肽的氨基酸长度为9～13个氨基酸，大多数是12个氨基酸，并且它们的弯曲潜力依赖于用于重组蛋白弯曲的脯氨酸在序列的中部(5′、6′、7′或8′氨基酸)和肽的末端(12′)的存在和定位。针对amtd的刚性/柔性的不稳定指数为ii＜40，针对亲水性的亲水性总平均值(gravy)为约2.2，针对结构特征的脂肪族指数(ai)为约200(表9)。基于这些标准化的关键因素，开发了本发明中的新的疏水肽序列(称为高级大分子转导域肽(amtd))，并总结于表10至表15中。

实施例2.用于与amtd融合的重组蛋白的表达载体的构建

我们新开发的技术使我们能够扩展用于制备细胞可透过重组蛋白的方法。设计表达载体用于与amtd或r肽融合的组氨酸标记的cra蛋白.为了构建用于重组蛋白的表达载体，设计了聚合酶链式反应(pcr)以扩增每种设计的与cra融合的amtd或r肽。

将pcr反应物(100ng基因组dna、10pmol每种引物、0.2mmdntp混合物、1×反应缓冲液和2.5upfu(+)dna聚合酶(doctorprotein，korea))在ndei(5′)和sali(3′)之间的限制性酶切位点消化，该pcr反应包括变性(95℃)、退火(62℃)和延伸(72℃)各30秒，共35个循环。对于最后一个延伸循环，pcr反应物在72℃下保持5分钟。然后，将它们克隆在pet-28a(+)载体(novagen，madison，wi，usa)的位点上。使用t4dna连接酶在4℃下过夜进行dna连接。将这些质粒与大肠杆菌dh5α株的感受态细胞于冰上混合10分钟。在42℃的水浴中热激混合物90秒后，将该混合物置于冰上2分钟.然后将添加了lb肉汤培养基的混合物在37℃振荡培养箱中复苏1小时。将转化体铺于含卡那霉素(50μg/ml)(biopure，johnson，tn)的lb肉汤琼脂平板上之后，在37℃下温育过夜。从单个菌落中，提取质粒dna，在用ndei和sali限制性酶消化后，通过使用1.2％琼脂糖凝胶电泳在645bp处证实消化的质粒dna(图2)。表23至表30中总结了与amtd和随机肽(r肽)融合的cra重组蛋白的pcr引物。表31至表38中显示了amtd和r肽引物的氨基酸序列。

实施例3.与amtd和r肽融合的重组蛋白的诱导型表达、纯化和制备

为了表达重组蛋白，在大肠杆菌bl21(de3)株中转化用于表达与阴性对照[r肽38(rp38)]、参比疏水cpp(mtm12和mtd85)和amtd融合的cra蛋白的pet-28a(+)载体。细胞在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中于37℃下，在强烈振荡下生长，在od600＝0.6时通过添加0.7mmiptg(biopure)在37℃下诱导该细胞2小时。将诱导的重组蛋白加样于15％sds-page凝胶上并且用考马斯亮兰(instantblue，expedeon，novexin，uk)染色(图3).

通过在5000×rpm下离心10分钟收获大肠杆菌培养物，并且丢弃上清。将沉淀物重悬于裂解缓冲液(50mmnah2po4，10mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)中。使用配备有探头的超声波仪(sonicsandmaterials，inc.，newtowen，ct)在冰上对细胞裂解物进行超声处理.在5000×rpm下将细胞裂解物离心10分钟以沉淀细胞碎片后，用裂解缓冲液平衡的ni-nta树脂(qiagen，hilden，germany)轻柔地通过空心柱系统(bio-rad，hercules，ca)温育上清。在用200ml洗涤缓冲液(50mmnah2po4，20mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)洗涤结合蛋白的树脂之后，用洗脱缓冲液(50mmnah2po4，250mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)洗脱结合的蛋白。

在15％sds-page凝胶上分析在自然条件下纯化的重组蛋白，并且用考马斯亮兰将所述重组蛋白染色(图4)。将所有重组蛋白对生理缓冲液透析8小时以及过夜，所述生理缓冲液是细胞培养基(杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco′smodifiedeagle′smedium)：dmem，hyclone，logan，ut)和杜氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco′sphosphatebufferedsaline)(dpbs，gibco，grandisland，ny)的1∶1混合物。由克隆的316种amtd和141种r肽，诱导、纯化和制备了240种融合amtd的重组蛋白和31种融合r肽的重组蛋白，并且分析了这些重组蛋白的细胞透性。

实施例4.重组蛋白的定量细胞透性的确定

为了定量细胞透性，根据制造商说明书(sigma-aldrich，st.louis，mo)，使融合amtd的重组蛋白或融合r肽的重组蛋白缀合于异硫氰酸荧光素(fitc)。将raw264.7细胞用10μmfitc标记的重组蛋白在37℃下处理1小时，用冷pbs洗涤三次，用0.25％胰蛋白酶/edta(sigma-aldrich，st.louis，mo)在37℃下处理20分钟以移除细胞表面结合蛋白。通过流式细胞术(guava，millipore，darmstadt，germany)使用flowjo细胞计数分析软件分析这些重组蛋白的细胞透性(图5至图6)。测量amtd的相对细胞透性，并且与阴性对照(rp38)和参比疏水cpp(mtm12和mtd85)比较(表47)。

实施例5.重组蛋白的细胞透性和胞内定位的确定

对于细胞透性的可视化参比，在24孔室载玻片中盖上盖玻片培养nih3t3细胞24小时，用10μmfitc缀合的重组蛋白在37℃下处理，并且用冷pbs洗涤三次。将处理过的细胞用4％多聚甲醛(pfa，junsei，tokyo，japan)在室温下固定10分钟，用pbs洗涤三次，并且用vectashield封固介质(vectorlaboratories，burlingame，ca)封固，并且用dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)复染。通过共聚焦激光扫描显微镜技术确定荧光信号的胞内定位(lsm700，zeiss，germany；图7和图8)。