包含非结构蛋白的片段的登革热病毒嵌合多表位及其在抗登革热病毒感染的免疫原性组合物中的用途的制作方法

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包含非结构蛋白的片段的登革热病毒嵌合多表位及其在抗登革热病毒感染的免疫原性组合物中的用途的制造方法与工艺

发明领域

本发明涉及包含非结构蛋白的片段的登革热病毒嵌合多表位及其在抗登革热病毒感染的免疫原性组合物中的用途。本发明提供工具(means)，特别是多核苷酸、载体、细胞和方法以制备表达所述嵌合多表位的载体，特别是由重组麻疹病毒(也称作mv)颗粒组成的载体。本发明还涉及所述重组mv颗粒，特别是在组合物或疫苗形式下的重组mv颗粒在预防和/或治疗登革热病毒感染中的用途。

发明背景

登革热病毒(denv)属于有包膜的正链rna病毒的黄病毒科(flaviviridaefamily)，并且通过伊蚊(aedesmosquitoes)传播。denv感染是最重要的节肢动物传播的病毒疾病，每年有约3.9亿例感染，其可以导致登革热(df)，并且在1-5％的情况下导致登革出血热(dhf)和登革休克综合征(dss)，特征在于血管渗漏导致低血压休克(worldhealthorganization(who)press2009,who/htm/ntd/den/2009.1ed.；bhatts等人,nature2013,496(7446):504-507)。估计每年发生超过200万例的严重登革热疾病和超过20000例死亡(gublerdj,theamericanjournaloftropicalmedicineandhygiene2012,86(5):743-744)。

有在氨基酸水平上67-75％相同的4种主要的denv血清型(命名为denv1-4)。病毒rna基因组翻译为单一多聚蛋白，其通过病毒和宿主蛋白酶切割为3个结构蛋白(壳体(c)、前膜(prm)和包膜(e))和7个非结构(ns)蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。4种登革热病毒血清型的参考基因组的完整核苷酸序列可以分别在登录号nc_001477.1、nc_001474.2、nc_001475.2和nc_002640.1下从genbank数据库访问。感染期间，e蛋白与细胞受体相互作用，并且病毒摄入通过受体介导的胞吞作用发生(heinzfx等人,archivesofvirologysupplementum1994,9:339-348；mukhopadhyays等人,natrevmicrobiol2005,3(1):13-22)。e蛋白在黄病毒中是结构上保守的，并且由3个结构域(edi、edii和ediii)组成(reyfa等人,nature1995,375(6529):291-298)。值得注意的是，ediii结构域诱导最有效的中和且血清型特异性抗体(beltramellom等人,cellhost&microbe2010,8(3):271-283；shresthab等人,plospathog2010,6(4):e1000823；sukupolvi-pettys等人,jvirol2010,84(18):9227-9239；wahalawm等人,plospathog2010,6(3):e1000821；dealwisr等人,plosneglectedtropicaldiseases2011,5(6):e1188；yauchle等人,advancesinvirusresearch2014,88:315-372)。

以前已描述了包含融合至膜蛋白胞外域(ectom)的来自4种denv血清型的4个包膜结构域iii(ediii)的单一最小四价denv抗原(brandler等人,plos2007,1(3),e96；brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)。当通过源自减毒活mv疫苗的复制型病毒载体表达时，这种抗原诱导抗4种血清型的登革热病毒的中和抗体(brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)。但是，在denv感染的非人灵长类模型中评价，表达四价ediii-ectom抗原的重组mv载体仅提供部分保护。这个观察表明缺少额外的denv抗原，而不能提供完全保护。

ns蛋白参与病毒复制和组装，并且通常不并入成熟病毒颗粒。惊人的是，虽然通过一种denv血清型原发感染诱导针对相同血清型再感染的持久保护性免疫，但是其不仅不防止感染其他血清型，而且还增加在继发感染时发展更严重疾病的风险，这是归因于非中和或亚中和(sub-neutralizing)抗体和称作抗体依赖性增强作用(ade)的现象(halsteadsb等人nature1977,265(5596):739-741；dejnirattisaiw等人science2010,328(5979):745-748)。为支持ade假说，提出原发感染之后产出的低水平的血清型交叉反应抗体可以通过形成结合至骨髓细胞上的fcγ受体(fcγr)的denv-抗体复合物来增强继发感染。这个过程导致较高的病毒负荷和较高的负责血管通透性的炎症介质的生成(halsteadsb等人nature1977,265(5596):739-741；morensdm等人,clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheinfectiousdiseasessocietyofamerica1994,19(3):500-512；halsteadsb等人,advancesinvirusresearch2003,60:421-467)。

从机理上看，已表明ade极其依赖于在刺激时产生大量细胞因子(tnf-α和il-6)和趋化因子(mip-1α)的单核细胞、巨噬细胞和树突细胞(dc)所表达的fcγriia受体的激活(wongkl等人,plosone2012,7(5):e36435；boonnakk等人,jimmunol2013,190(11):5659-5665；guilliamsm等人,natrevimmunol2014,14(2):94-108)。还已表明，ade中增加的病毒负荷是由免疫复合物(病毒和亚中和抗体之间)结合至人初级单核细胞上的白细胞ig样受体b1(lilr-b1)所致，导致抑制激活的fcγriia介导的早期抗病毒应答(chankr等人,procnatlacadsciusa2014,111(7):2722-2727)。

因此，根据denv特异性抗体应答的性质，适应性免疫可以诱导防止感染或者增强感染和疾病发展。

还提出在继发感染期间病毒特异性t细胞的致病作用，如同b细胞。称作“原始抗原痕迹”的假说假设在原发感染之后，对继发感染的血清型具有低亲和力的交叉反应性记忆t细胞支配并掩盖特异性t细胞应答，导致较低效率地杀死感染的靶细胞(mongkolsapayaj等人natmed2003,9(7):921-927)。这些交叉反应性cd8+t细胞，在继发感染时用不同血清型刺激，还表现出它们对交叉反应性表位或改变的肽配体的应答的定量和定性差异(bashyamhs等人,jimmunol2006,176(5):2817-2824)。

但是，尽管这些研究，仍然缺少denv特异性t细胞的致病作用的直接证明，并且最近的报道不支持交叉反应性cd8+t细胞在继发感染期间登革出血热的发病机理中的致病作用。实际上，在经历继发感染的成人中的研究未显示t细胞应答的数量级和特异性与临床疾病级别之间的任何关联(simmonscp等人,jvirol2005,79(9):5665-5675)，并且还在小鼠模型中鉴定了cd8+t细胞在原发denv感染期间的重要保护作用(yauchle等人jimmunol2009,182(8):4865-4873)。更惊人的是，在来自高发区的供体中的hla-限制性t细胞应答的详细分析甚至加强了cd8+t细胞在denv感染期间的保护作用(weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053)。看来尽管血清型特异性应答是原发感染的标志，但是在继发感染之后出现向针对保守表位的应答的转变，但是在血清型特异性应答或保守应答中cd8+t细胞的亲和力或功能性方面没有任何差异。此外，在弱t细胞应答和疾病易感性之间建立了显著相关性(weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053)。总的来说，这些研究强调了cd8+t细胞在登革热病毒感染中针对疾病发展的有益作用。

附图说明

图1.denv1的非结构蛋白ns3、ns4a、ns4b和ns5的免疫原性以及denv的血清型内和血清型间氨基酸序列保守。a.weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053；b.rivinol等人,jvirol2013,87(5):2693-2706.

图2.nsdenv1多表位联合的多表位抗原的氨基酸序列和二级结构(seqidno:3)。以下对序列中氨基酸位置的列举指示二级结构类型，其中氨基酸包括在如关于ns4b所预测的或者在已公开的关于ns3和ns5的晶体学研究中所描述的相应全长蛋白中(分别为pdbid2vbc,jvirol.2008jan；82(1):173-183和2j7w,jvirol.2007may；81(9):4753-65)。特别地，在以下氨基酸片段观察到α-螺旋：35-45；57-66；94-103；123-138；181-185；189-198；232-241；247-254；307-318；342-360；371-372；374-375；396-398；406-419；455-460；468-473；480-489；500-517。在以下氨基酸片段观察到β链：20-23；50-54；72-74；112-116；142-146；164-168；276-277；280-281；283-285；291-293；366-370；376-380；436-442；452-453。在以下氨基酸片段观察到弯曲：16；55-56；70；80；86-87；89-93；105；111；117；122；140；148-49；156-157；161-162；173-174；178-179；221；243；260-261；287-288；297-298；305-306；433-35；449-450；479；492；519-520。在以下氨基酸片段观察到转角：17-18；27-29；32-34；46-47；67-69；77-78；118-119；139；151-152；186-187；199-200；204-205；223-226；230-231；242；255-257；264-267；278-279；304；319；329-332；420-423；428-429；474；490-491；518；528-538。此外，在以下氨基酸片段观察到3/10螺旋：213-218；271-273；301-303；462-466；并且在氨基酸188和300观察到β桥。具有保守氨基酸的位置(在包括4种血清型的2033个序列的代表组的超过99.9％中发现)以深灰色突出显示。

图3.denv2-ns、denv3-ns和denv4-ns多表位(分别为seqidno:146、147和148)的氨基酸共有序列。

图4.比较denv1-ns、denv2-ns、denv3-ns和denv4-ns共有多表位的氨基酸序列(分别为seqidno:3、146、147和148)的比对。

图5.编码denv1-ns多表位的多核苷酸的天然核苷酸序列(seqidno:1)。

图6.编码denv1-ns多表位的多核苷酸的优化的核苷酸序列(人密码子优化的，麻疹优化的)(seqidno:2)。

图7.表达denv抗原的重组mv载体的示意图。将ns多表位合成序列插入mv载体的atu位置2或3，与denvediii四聚体抗原联合或不联合。mv基因指示如下：核蛋白(n)、磷蛋白和v/c辅助蛋白(pvc)、基质(m)、融合(f)、血凝素(h)以及聚合酶(l)。t7rna聚合酶启动子(t7)、t7rna聚合酶终止子(t7t)、肝炎δ病毒核酶锤头状核酶(hh)。在mvdvax9中，插入atu位置2的联合抗原包含融合至分泌的ns多表位序列的分泌的denvediii四聚体蛋白，具有插入的弗林蛋白酶位点(具有如seqidno:152中定义的氨基酸序列rrdkr)以分开不同组分。在mvdvax11中，相反地，ns多表位合成序列不是分泌的(无肽前导序列)，并且以3’融合至输出的denvediii四聚体蛋白(从肽前导序列开始)。

图8.通过蛋白印迹检测mv-denv重组病毒感染的vero细胞或用pcdna3-ns质粒转染的hek293细胞的细胞裂解物中的denvns多表位抗原(上)和denvediii四聚体抗原(下)的表达。用特异性mab探测denv蛋白。

图9.用于cd46-ifnar小鼠中的elispot测定的denvns多表位肽。序列1-36是覆盖整个denvns多表位抗原的5个氨基酸的15-聚体肽重叠。利用预测算法鉴定肽37-41结合cd46-ifnar小鼠中表达的h2-db和h2-kbt细胞受体的能力。这些肽具有如seqidno:98-138中定义的氨基酸序列。

图10.通过mv-denv载体免疫的cd46-ifnar小鼠中t细胞应答的elispot定量。用mvdvax10、mvdvax8或空mv免疫6只小鼠的组。在单一免疫后7天收集的脾细胞中定量elispots。示出对denvns肽、mv和作为阳性对照的伴刀豆球蛋白a的应答。

图11.通过mv-denv载体免疫的cd46-ifnar小鼠中t细胞应答的elispot定量。示出对不同肽池或覆盖ns多表位抗原的单独肽的应答。

图12.通过mv-debnv载体免疫的cd46-ifnar小鼠中的elispot应答，累积对单独肽或池的应答。

图13.在h-2i类空/hlai类转基因小鼠中引发cd8+t细胞应答和通过elispot测定定量ifn-γ应答的方法。

图14.denv1-ns多表位构建体(seqidno:3)的免疫原性表位的鉴定和hla限制。

图15.通过elispot测定定量hla-a2、a24、b7和b35转基因小鼠中的t细胞应答。已进行3个独立的实验，其中分别总计10只和4只hla-a*02:01转基因小鼠接受denv1-ns多表位构建体(seqidno:3)和对照质粒，分别8只和4只hla-a*24:02转基因小鼠接受denv1-ns多表位构建体和对照质粒，分别5只和4只hla-b*07:02接受denv1-ns多表位构建体和对照质粒，以及分别5只和3只hla-b*35:01转基因小鼠接受denv1-ns多表位构建体和对照质粒。所有动物均通过皮内注射(100μgdenv1-ns多表位构建体或100μgpcdna3.1对照质粒)然后体内电穿孔来免疫。以3周间隔进行2次免疫，并且在第2次注射之后10天通过elispot测试脾细胞的ifn-γ分泌。用2μg/ml的不同肽和终浓度5μg/ml的伴刀豆球蛋白a(cona)平行测试单独的小鼠。

图16.a)ifn-γ和b)颗粒酶b(grb)elispot应答，累积对单独肽的应答。在这些测定中，使用的肽为：对于hla-a24转基因小鼠，肽p17、p32和p33(分别具有如seqidno:39、33和47中定义的氨基酸序列)用作同源物(cognate)，并且肽hbspa2-2(具有如seqidno:150中定义的氨基酸序列tlciphvav)作为对照。对于hla-a2转基因小鼠，肽p30、p53和p56用作同源物(分别具有如seqidno:18、51和55中定义的氨基酸序列)，并且肽hbspa2-2作为对照。对于hla-b7转基因小鼠，肽p15、p30和p36用作同源物(分别具有如seqidno:68、18和21中定义的氨基酸序列)，并且肽svb7-3(具有如seqidno:151中定义的氨基酸序列spflpllpi)作为对照。对于hla-b35转基因小鼠，肽p49、p50和p51用作同源物(分别具有如seqidno:28、32和45中定义的氨基酸序列)，并且肽svb7-3作为对照。

图17.来自用denv1-ns多表位构建体(seqidno:3)或对照质粒免疫的动物的t细胞的体内细胞毒性活性。对于hla-a24小鼠，将高染色的靶细胞用p17、p32和p33同源肽(分别具有如seqidno:39、33和47中定义的氨基酸序列)的混合物脉冲，而低染色的对照细胞不脉冲。对于hla-a2小鼠，将高染色的靶细胞用p30、p53和p56同源肽(分别具有如seqidno:18、51和55中定义的氨基酸序列)的混合物脉冲，而将低染色的对照细胞用hbspa2-2对照肽脉冲。对于hla-b35小鼠，将高染色的靶细胞用p49、p50和p51同源肽(分别具有如seqidno:28、32和45中定义的氨基酸序列)的混合物脉冲，而低染色的对照细胞不脉冲。

发明描述

发明人已分析了在来自柬埔寨的同龄组的无症状或有症状的感染供体的外周血单核细胞(pbmc)中差异表达的转录物，并且观察到与具有登革热(df)或登革出血热(dhf)的有症状供体相比，大量对应于cd8+t细胞激活的基因在无症状的个体中过量表达。在来自这些具有dhf和登革休克综合征(dss)的有症状患者的pbmc中还观察到更高数量的与th17和嗜中性粒细胞激活相关的转录物，与严重登革热病例中观察到的强炎症反应一致。合在一起，这些观察强烈支持cd8+t细胞在抗denv免疫中的hla相关性保护作用。

发明人设计了能够诱导对denv的cd8+t细胞免疫的抗原。最重要的是，与denv基因组的全长或denvns蛋白的全长相比，这种抗原具有小尺寸，从而可以将其插入任何疫苗载体中，例如，源自减毒活mv疫苗的复制型病毒载体。此外，这种设计的目的是提供富含高度抗原性表位的denv抗原，同时想限制免疫系统暴露于弱免疫原性表位，并且防止免疫应答的分散或稀释。这种抗原包含来自denv的ns蛋白的多表位区。利用搜集的抗denvt细胞表位分布和强度(simmonscp等人,jvirol2005,79(9):5665-5675；yauchle等人,jimmunol2009,182(8):4865-4873；weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053；imriea等人,jvirol2007,81(18):10081-10091；lundo等人,plosone2011,6(10):e26494；weiskopfd等人,jimmunol2011,187(8):4268-4279；bouchermar等人,jimmunol2013,191(2):583-593；nascimentoej等人,plosneglectedtropicaldiseases2013,7(10):e2497；rivinol等人,jvirol2013,87(5):2693-2706；rivinol等人,jimmunol2013,191(8):4010-4019；immuneepitopedatabase(iedb))，发明人选择了富含cd8表位的4个区域，总计539个氨基酸：ns3中的两个区域(分别为185和134个氨基酸)，ns4b中的一个区域(86个氨基酸)和ns5中的一个区域(135个氨基酸)(图1)。对于ns3和ns5利用晶体学数据(分别为pdbid2vbc和2j7w)，并且对于ns4b利用预测工具如jpred(colec,barberjd&bartongj.nucleicacidsres.2008.35(suppl.2)w197-w201)或goriv(gor二级结构预测方法版本iv，methodsinenzymology1996r.f.doolittleed.,vol266,540-553,garnierj,gibratj-f,robsonb)，基于各多聚蛋白的二级结构和氨基酸序列特性选择和4个区域的边界。值得注意的是，所述设计小心地避免了破坏二级结构元件如α-螺旋或β-链(图2)。利用muscle3.7(edgarrc,nucleicacidsres2004,32(5):1792-1797)以及根据氨基酸序列手动调整，比对总计2033个全长登革热基因组序列(血清型1为865个，血清型2为678个，血清型3为427个，并且血清型4为63个)。在核酸和氨基酸水平评价血清型内和血清型间的序列相似性。所关注的级联区的分析显示强的血清型内保守，以及与整个基因组相比一般更高程度的序列相同性，包括对于亚型间比较(图1和2)。基于denv的4种血清型的遗传多样性，并以t细胞表位在不同血清型之间是保守的，或者尽管有诱导交叉反应性cd8+t细胞应答的能力，仍是血清型特异性的这样的想法，选择了基于denv1的流行株的原型共有序列，即denv1nst细胞多表位(图1和2)。

选择血清型1共有序列，因为其显示最高的与4种血清型的平均遗传相同性(相对血清型1：99.48％；血清型2：83,48％；血清型3：89.39％；血清型4：76.96％)。

对每个血清型将平均遗传相同性估计为血清型的每个序列的配对的百分比序列相同性(在组成ns多表位的全部比对位置中相同位置的比例)，并且报告平均值。给出的这个百分比仅对应于所选的ns3、ns4b和ns5片段的串联。

因此本发明涉及具有少于600个氨基酸残基的嵌合多表位或者其多表位变体，所述嵌合多表位包含组装在融合多肽中的以下(a)、(b)和(c)的片段或由组装在融合多肽中的以下(a)、(b)和(c)的片段组成，其中所述(a)、(b)和(c)的片段以这个顺序直接或间接融合：

(a)登革热病毒(denv)血清型1(denv1)的非结构(ns)ns3蛋白的两个片段，其包含两个区域或由两个区域组成，其中第一区域具有如seqidno:6中定义的氨基酸序列，并且第二区域具有如seqidno:9中定义的氨基酸序列，

(b)denv1的ns4b蛋白的片段,其具有如seqidno:12中定义的氨基酸序列，

(c)denv1的ns5蛋白的片段，其具有如seqidno:15中定义的氨基酸序列，

所述多表位变体(i)包含融合多肽中的denvns片段集合或由融合多肽中的denvns片段集合组成，所述denvns片段的序列是通过(a)、(b)和(c)中列举的ns3denv1、ns4bdenv1、ns5denv1片段与denv2、denv3或denv4血清型病毒的ns蛋白各自的ns3、ns4b和ns5序列的比对获得的，或者(ii)由嵌合多表位组成，所述嵌合多表位具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度与由融合的片段(a)、(b)和(c)组成的融合多肽的序列(通过氨基酸残基突变由其衍生所述氨基酸序列)具有超过75％的相同性，特别是超过80％、超过85％或超过90％的相同性。

在一特定实施方案中，本发明涉及嵌合多表位，其具有少于600个氨基酸残基大小，特别是由539个氨基酸残基的链组成，并且包含此后命名为(a)、(b)和(c)的片段的融合物或由此后命名为(a)、(b)和(c)的片段的融合物组成，并且获得自或代表任何denv基因组的几个非结构(ns)蛋白，即由以下组成的片段：

(a)由denv1的多聚蛋白序列(genbank登录号np_059433.1)中的氨基酸1645-1829和1959-2092，或者denv2的多聚蛋白序列(genbank登录号np_056776.2)中的氨基酸1645-1828和1958-2091，或者denv3的多聚蛋白序列(genbank登录号yp_001621843.1)中的氨基酸1643-1827和1957-2090，或者denv4的多聚蛋白序列(genbank登录号np_073286.1)中的氨基酸1644-1827和1957-2090组成的ns3蛋白，

(b)由denv1的多聚蛋白序列(genbank登录号np_059433.1)中的氨基酸2262-2347，或者denv2的多聚蛋白序列(genbank登录号np_056776.2)中的氨基酸2260-2345，或者denv3的多聚蛋白序列(genbank登录号yp_001621843.1)中的氨基酸2260-2344，或者denv4的多聚蛋白序列(genbank登录号np_073286.1)中的氨基酸2259-2341组成的ns4b蛋白，以及

(c)由denv1的多聚蛋白序列(genbank登录号np_059433.1)中的氨基酸2766-2899，或者denv2的多聚蛋白序列(genbank登录号np_056776.2)中的氨基酸2765-2898，或者denv3的多聚蛋白序列(genbank登录号yp_001621843.1)中的氨基酸2763-2896，或者denv4的多聚蛋白序列(genbank登录号np_073286.1)中的氨基酸2761-2894组成的ns5蛋白，

其中每个片段(a)、(b)和(c)包含多个适合引发免疫应答，特别是针对所有denv血清型的免疫t细胞应答的表位，所述多表位由多个所述片段的直接或间接融合产生，特别地，所述片段源自独特的登革热病毒血清型。

在一特定实施方案中，本发明涉及嵌合多表位，其具有539个氨基酸大小，并且包含此后命名为(a)、(b)和(c)的片段的融合物或由此后命名为(a)、(b)和(c)的片段的融合物组成，并且获得自或代表任何denv基因组的几个非结构(ns)蛋白，即由以下组成的片段：

(a)denv1的核苷酸序列(genbank登录号nc_001477.1)中的核苷酸5027-5581和5969-6370，或者denv2的核苷酸序列(genbank登录号nc_001474.2)中的核苷酸5026-5580和5968-6369，或者denv3的核苷酸序列(genbank登录号nc_001475.2)中的核苷酸5021-5575和5963-6364，或者denv4的核苷酸序列(genbank登录号nc_002640.1)中的核苷酸5028-5582和5970-6371编码的ns3蛋白，

(b)denv1的核苷酸序列(genbank登录号nc_001477.1)中的核苷酸6878-7135，或者denv2的核苷酸序列(genbank登录号nc_001474.2)中的核苷酸6874-7131，或者denv3的核苷酸序列(genbank登录号nc_001475.2)中的核苷酸6872-7126，或者denv4的核苷酸序列(genbank登录号nc_002640.1)中的核苷酸6876-7124编码的ns4b蛋白，以及

(c)denv1的核苷酸序列(genbank登录号nc_001477.1)中的核苷酸8390-8791，或者denv2的核苷酸序列(genbank登录号nc_001474.2)中的核苷酸8389-8790，或者denv3的核苷酸序列(genbank登录号nc_001475.2)中的核苷酸8381-8782，或者denv4的核苷酸序列(genbank登录号nc_002640.1)中的核苷酸8382-8783编码的ns5蛋白，

其中每个翻译片段(a)、(b)和(c)包含多个适合引发免疫应答，特别是针对所有denv血清型的免疫t细胞应答的表位，所述多表位由多个所述片段的直接或间接融合产生，特别地，所述片段源自独特的登革热病毒血清型。

如本文定义的，术语“多表位”指有利地具有denv1ns3、ns4b和ns5蛋白中鉴定的至少3个，特别是至少5个，优选超过10个或超过13个表位的多肽，特别是图1中提供的denv1ns3、ns4b或ns5共有序列的t细胞表位。本发明内的表位是线性或构象的，优选线性的，并且是参与诱导细胞介导的免疫应答的任何肽或多肽，尤其是针对denv，特别是针对denv1、denv2、denv3、denv4中的任一种或针对多种，特别是所有denv血清型的t细胞免疫应答。因此，本文所述表位包括通过宿主中的apc(抗原呈递细胞)加工的那些表位，特别是与i类mhc(主要组织相容性复合物)分子联合识别的t表位，例如靶细胞是cd8+t淋巴细胞的表位，或者与ii类mhc分子联合识别的t表位，例如靶细胞是cd4+t淋巴细胞的那些表位。

术语“嵌合多表位”表示包含在ns3、ns4b和ns5蛋白中选择的不同denvns蛋白的子部分的任何多表位多肽，例如，如本文定义的源自第一denvns蛋白的多表位和源自第二denvns蛋白的多表位。如果多表位包括源自来自相同denvns蛋白的不同多表位的子部分，或者甚至源自来自不同denvns蛋白的相同多表位，也认为所述多表位是嵌合多表位。本发明的嵌合多表位包括多表位变体。因此，本文公开的每个定义或实施方案适用于变体多表位，除非其是技术上无关的。

在本发明的一特定实施方案中，所述嵌合多表位包含人白细胞抗原(hla)限制性表位。表述“hla限制性”指特定表位对这种类型的hla分子具有亲和力的能力。本发明中使用的hla分子涵盖i类分子(命名为hla-a、b或c)或ii类分子(命名为dp、dq或dr)。

在本发明的另一特定实施方案中，所述嵌合多表位引发针对denv1、denv2、denv3和denv4的人白细胞抗原(hla)限制性cd8⁺和/或cd4⁺t细胞应答。denvcd8t细胞表位的非穷举性列表在表1中提供。

表1.具有如seqidno:16-68中定义的氨基酸序列的denvcd8t+细胞表位。^a加下划线显示与所描述的表位不同的氨基酸；^b突出显示在elispot测试中具有阳性评分的cd8t细胞表位；^cnt：未测试。hla限制性的参考文献如下：(1)rivinol等人,jvirol2013,87(5):2693-2706；(2)simmonscp等人jvirol2005,79(9):5665-5675；(3)imriea等人jvirol2007,81(18):10081-10091；(4)bouchermar等人,jimmunol2013,191(2):583-593；(5)weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053；(6)lundo等人,plosone2011,6(10):e26494；(7)rivinol等人,jimmunol2013,191(8):4010-4019；(8)nascimentoej等人,plosneglectedtropicaldiseases2013,7(10):e2497；(9)immuneepitopedatabase(iedb)；(10)weiskopfd等人,jimmunol2011,187(8):4268-4279；(11)yauchle等人,jimmunol2009,182(8):4865-4873。

在本发明的另一特定实施方案中，所述嵌合多表位引发针对denv1、denv2、denv3和denv4的人白细胞抗原(hla)限制性cd4⁺t细胞应答。denvcd4t细胞表位的非穷尽性列表在表2中提供。

表2.具有如seqidno:69-97中定义的氨基酸序列的denvcd4t+细胞表位。

在一特定实施方案中，已显示ns嵌合多表位序列在小鼠中引发抗原应答，具有hla限制性如hla-a*02:01、hla-a*24:02、hla-b*07:02或hla-b*35:01。

在一特定实施方案中，本发明涉及嵌合多表位，其大小为539个氨基酸，包含以下或由以下组成：

(a)登革热病毒(denv)血清型1(denv1)的非结构(ns)ns3蛋白的两个片段，其分别具有如seqidno:6、seqidno:9中定义的氨基酸序列，

(b)denv1的ns4b蛋白的片段，其包含如seqidno:12中定义的氨基酸序列，

(c)denv1的ns5蛋白的片段，其包含如seqidno:15中定义的氨基酸序列，并且

其中每个ns片段(a)、(b)和(c)与所述多表位中的另一ns片段(a)、(b)和(c)直接或间接融合，优选以这个顺序。

denv1、denv2、denv3和denv4的多聚蛋白的核苷酸序列分别可以从genbank登录号np_059433.1、np_056776.2、yp_001621843.1和np_073286.1登录。

作为本发明的变体多表位的分别为seqidno:146、147和148的denv2-ns、denv3-ns和denv4-ns多表位的氨基酸序列在图3中公开。发明人已进行比对，显示denv1-ns、denv2-ns、denv3-ns和denv4-ns多表位的序列中的保守氨基酸残基(图4)。

在本发明的一优选实施方案中，所述嵌合多表位至少包含本文公开的p30、p451、p36、p453、p49、p50、p32、p17、p21、p51、p33、p56和p15表位。特别地，所述p30、p451和p56表位受hla-a*02:01限制，所述p17、p32和p33表位受hla-a*24:02限制，所述p15、p30和p36表位受hla-b*07:02限制，并且所述p21、p49、p50、p51和p453表位受hla-b*35:01限制。期望所述嵌合多表位包含至少等于现有hla的数量的许多额外的表位，其中现有hla的实例在表1和2中提供。

与在本发明的框架内，本发明的表位可以具有区别或差别在于针对denv1而确定的共有ns中的一个或多个氨基酸的氨基酸序列。可替代地或额外地，本发明的多表位的两个表位可以具有在一个ns片段中的重叠序列，因此共享一些氨基酸。

本发明的嵌合多表位可以化学合成，或者在编码所述多表位的核酸分子在细胞系统中表达之后，在体外(不含细胞的系统)或体内产生。

如本文定义的，术语“片段”指ns蛋白(即ns3、ns4b或ns5蛋白)的份或部分，特别是具有86-185个氨基酸的部分。对应于本发明片段的任何登革热病毒分离株的任何序列或序列组合(如通过利用保藏在genbank中的denv1参考序列(np_059433.1)上的核苷酸和氨基酸编号鉴定的ns蛋白中的位置界定或者如关于其seqidno.公开的)的长度比其源自的ns蛋白短。

根据本发明的一特定实施方案，将一ns片段与另一ns片段“直接”融合，即将ns片段的3’端与第二片段的5’端直接连接(等等)，对应于包含来自相同和/或不同ns蛋白(选自ns3、ns4b和ns5)的连续ns片段的嵌合多表位，特别是源自denv1的ns共有序列。根据一可选实施方案，片段的融合是“间接的”，因此包括非ns氨基酸残基片段的存在，即在提供所考虑的片段序列的ns蛋白上不阅读的氨基酸残基片段。

如本文定义的，术语“区域”指如本文定义的ns蛋白的连续氨基酸链，其具有至少86个氨基酸。对于ns3片段，ns蛋白的片段可以包含多个区域或由多个区域组成。

如本发明中使用的术语，两个比较的核苷酸序列或分别两个氨基酸序列之间的“百分比相同性”，表示最佳比对之后获得的所比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸的百分比，该百分比是纯粹统计的，并且所述两个序列之间的差异是随机分布和在它们整个长度中的。术语“最佳比对”或“最优比对”表示相同性百分比最高的比对。两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较通常通过在以最优方式比对它们之后比较这些序列来进行，利用比较片段或窗口进行所述比较以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的最优序列比对可以手工进行或者利用smith和waterman(1981)局部同源性算法，利用neddleman和wunsch(1970)局部同源性算法，利用pearson和lipman(1988)序列相似性搜索方法或者利用采用这些算法的软件(wisconsingeneticssoftwarepackage中的gap、bestfit、blastp、blastn、fasta和tfasta,geneticscomputergroup,575sciencedr,madison,wi)进行。为了获得最优比对，可以使用blast程序，用blosum62矩阵。还可以使用pam或pam250矩阵。利用muscle3.7(edgarrc,nucleicacidsres2004,32(5):1792-1797)以及根据氨基酸序列手动调整，比对了总计2033个全长登革热基因组序列(血清型1为865个，血清型2为678个，血清型3为427个，并且血清型4为63个)。

通过比较以最优方式比对的这两个序列来确定两个核酸或两个氨基酸序列之间的百分比相同性。百分比相同性是这样计算的，确定两个序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的相同位置的数量，将这个相同位置的数量除以所比较的位置的总数量并将所得结果乘以100以获得这两个序列之间的百分比相同性。

在本发明的一特定实施方案中，denv1的ns3的第一区域具有如seqidno:6中定义的氨基酸序列，denv1的ns3的第二区域具有如seqidno:9中定义的氨基酸序列，denv1的ns4b片段具有如seqidno:12中定义的氨基酸序列，并且denv1的ns5片段具有如seqidno:15中定义的氨基酸序列。

在本发明的另一特定实施方案中，编码denv1的ns3的第一区域的多核苷酸的天然和优化序列分别如seqidno:4和5中定义的，编码denv1的ns3的第二区域的多核苷酸的天然和优化序列分别如seqidno:7和8中定义的，编码denv1的ns4b片段的多核苷酸的天然和优化序列分别如seqidno:10和11中定义的，并且编码denv1的ns5片段的多核苷酸的天然和优化序列分别如seqidno:13和14中定义的。

如本文公开的，术语“变体”涵盖denv血清型2、3或4病毒的ns3、ns4b和ns5蛋白的其他片段的集合。

在本发明的一优选实施方案中，所述嵌合多表位包含具有选自seqidno:3、146、147和148的氨基酸序列的多肽或由具有选自seqidno:3、146、147和148的氨基酸序列的多肽组成。

本发明还涉及本发明的嵌合多表位与此后命名为四价ediii/ectom的不同免疫原性多肽的联合。在本发明的一特定实施方案中，所述不同免疫原性多肽(四价ediii/ectom)由嵌合denv抗原组成，所述嵌合denv抗原包含融合至denv1的ectom的代表4种denv血清型的ediii多肽的融合物组成，并且具有如seqidno:145中公开的氨基酸序列，而且由具有seqidno:144的多核苷酸编码。

所述多肽的联合可以因为来自如本文公开的载体的、编码每个所述嵌合多表位和不同免疫原性多肽的多核苷酸的表达而获得。或者，所述联合可以由涵盖所述嵌合多表位和不同免疫原性多肽的氨基酸构建体获得。

本发明还涉及病毒颗粒，特别是表达本发明的嵌合多肽或与所述四价ediii/ectom多肽联合的所述嵌合多肽的重组麻疹病毒(mv)颗粒。

本发明还涉及载体，其包含重组麻疹病毒(mv)颗粒或由重组麻疹病毒(mv)颗粒组成,所述重组麻疹病毒(mv)颗粒表达本发明的嵌合多表位和任选存在的所述四价ediii/ectom免疫原性多肽。

已证实如此产生的重组病毒颗粒，特别是麻疹病毒颗粒在单独使用时增强由denv抗原引发的免疫应答，特别是通过影响在向有此需要的宿主给药所述颗粒之后引发的免疫原性t细胞应答。

为了制备所述病毒颗粒，特别是表达与如本文公开的所谓的四价ediii/ectom多肽联合的本发明的嵌合多表位的mv颗粒，将编码所述多表位和多肽的多核苷酸重组入涵盖所述病毒的基因组，特别是所述麻疹病毒基因组的多核苷酸。

根据本发明的一优选实施方案，重组mv基因组被提供来做为编码减毒活schwarz或moraten病毒的全长rna基因组的cdna。

减毒活mv毒株指这样的毒株，已在所选细胞上连续传代，并且优选适应其他细胞如具有ifnα/β应答的原代细胞，即cef细胞，以便产生适合制备疫苗毒株的种子毒株，包含稳定的基因组，所述稳定的基因组不会允许回复致病性或整合入宿主染色体，特别是人宿主染色体。在本发明的一特定实施方案中，减毒活mv是已在原代细胞如cef细胞上选择的mv。

如本文定义的，表述“减毒活schwarz或moraten病毒”指这样的schwarz或moraten病毒，其源自这样的毒株，所述毒株在相同宿主，特别是人中无毒或比确定的母株毒性低，同时在宿主，特别是人中给药时保持感染特性和免疫原性以及可能的佐剂性(adjuvancy)。特别地，schwarz毒株或moraten毒株来自疫苗(aventis)。已证实schwarz毒株与moraten毒株具有完美的序列相同性(parks,c.l.等人,2001,jvirol,75(2):910-920；schwarz,a.j.,1962,amjdischild,103,386-389)。schwarz/moraten毒株目前广泛使用，因为它们诱导长期细胞和体液免疫应答，并且提供重要的遗传稳定性，因为尚未观察到回复为致病形式(hilleman,m.,2002,vaccine,20:651-665)。

麻疹病毒基因组是因为制备cdna分子而获得的，所述cdna分子编码如本领域，特别是wo2004/001051和wo2004/000876中公开的全长mv基因组。所述cdna分子已作为插入物包含在命名为ptm-mvschw的质粒中，所述质粒于2002年6月12日保藏在cncm的第i-2889号下(institutpasteur-paris-france)。编码所述基因组的mvcdna序列提供在附图中，其说明用本发明的嵌合多表位和不同的所谓的四价ediii/ectom多肽制备的构建体。mv序列的位置在所述附图中公开。

为了表达本发明的嵌合多表位和任选存在的不同的所谓的四价ediii/ectom多肽，利用本领域技术人员公知的方法和方案，将所述编码全长mv基因组的cdna分子与编码本发明的嵌合多表位的dna分子和任选存在的编码如本文公开的所谓的四价ediii/ectom多肽的dna分子重组。由技术人员根据已知技术制备编码所述多肽的dna分子。

在一特定实施方案中，对应于本发明的嵌合多表位的dna分子可以通过化学合成产生。优选地，这个序列是经密码子优化的以在哺乳动物细胞中表达，并且优选其长度满足规定核苷酸的总数量是6的倍数的“六位规则”，已知该规则影响来自mv基因组的mv蛋白的适当表达(calain,p.等人jvirol.,1993,67:4822-4830)。

在一特定实施方案中，插入到编码所述全长mv基因组的cdna中的所有核酸构建体，特别是嵌合多表位和所谓的四价ediii/ectom多肽的编码序列均具有是6的倍数的许多核苷酸。

因此，本发明涉及分离或纯化的多核苷酸，其编码本发明的嵌合多表位，并且优选具有遵守六位规则的核苷酸总数量。特别地，这种多核苷酸是dna或cdna。在一特定实施方案中，将编码本发明的多核苷酸的ns片段的序列的mv编辑和多腺苷酸化样序列突变(lamb,r.a.等人infieldsvirology,4thedition,1305–1340；schneider,h.等人virology,1997,227:314-322)。此外，为了允许其将来克隆入质粒如puc和哺乳动物表达质粒如pcdna3，或者克隆入mv载体，编码本发明的嵌合多表位的dna的两侧为限制性位点如bglii、apai、bsiwi和bsshii的序列。

因此本发明特别涉及编码denv1的嵌合多表位的天然的和密码子优化的核苷酸序列，其分别是如seqidno:1和seqidno:2公开的序列(图5和6)。denv1的嵌合多表位的氨基酸序列是如seqidno:3公开的序列。

本发明还涉及分离或纯化的编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸，其在进一步包含编码四价denv抗原的多核苷酸的核酸构建体中，所述四价denv抗原包含融合至denv1的ectom的、4种血清型的ediii多肽的融合物，其中获得的多核苷酸优选具有遵守六位规则的核苷酸总数量。在一特定实施方案中，这种多核苷酸具有seqidno:144的序列。这样的构建体可以特别地包含编码四价denv抗原的多核苷酸，所述四价denv抗原包含4种血清型的ediii多肽的融合物，所述ediii多肽融合至编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸上游的denv1的ectom。

本发明还涉及核酸分子，其包含本文公开的编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸并且任选包含编码四价denv抗原的多核苷酸，与编码全长mv基因组的cdna分子重组，所述四价denv抗原包含融合至denv1的ectom的4种血清型的ediii多肽的融合物。

如本文定义的，术语“分离或纯化的”表示已被人从它们的自然状态改变的分子，即如果所述分子天然存在，则它们已改变和/或脱离它们的初始环境。作为实例，天然存在并见于天然表达它的活生物体的生物环境中的多核苷酸在该语境中不是“分离的”。但是，在本发明中，相同的多核苷酸在从其天然环境分离和/或通过克隆、扩增和/或化学合成而获得时被认为是“分离的”。此外，通过转化、基因操作或任何其他重组方法引入生物体的多核苷酸是“分离的”，即使其存在于所述生物体中。

本申请中使用的术语“编码”定义当核酸分子被置于包括用于转录的启动子的表达控制序列下时，所述分子在所选细胞或细胞系中转录并其在适当时翻译以用于产物表达的能力。因此，根据本发明，“编码……的多核苷酸”局限于具有翻译为氨基酸序列的序列的核酸，或者可选地，当指明时还包含表达控制序列。

本发明还涉及载体。如本文所用，术语“载体”指被设计用于一种或多种细胞类型的转导/转染的多核苷酸构建体。载体可以是例如“克隆载体”，其设计用于插入的多核苷酸(命名为插入物)的分离、增殖和复制；“表达载体”，其被设计用于多核苷酸分子的表达，特别是用于宿主细胞中的插入物的表达；或者“病毒载体”，其被设计用于导致重组病毒颗粒或病毒样颗粒的产生；或者“穿梭载体”，其包含超过一种类型的载体的属性。

适合细胞的转导或转染，特别是适合细胞和细菌的稳定转染的许多载体是公众可获得的(例如质粒、病毒)，用于构建这类细胞系的方法也是如此。应当理解本发明涵盖包含本发明的任何多核苷酸的任何类型的载体。

因此本发明涉及载体，特别是表达载体，其可以是包含作为多核苷酸插入物的本文定义的一个或多个核酸分子的质粒。在一特定实施方案中，所述质粒包含作为插入物的编码如本文定义的本发明的嵌合多表位的多核苷酸，并且任选包含编码四价denv抗原的多核苷酸，所述四价denv抗原包含融合至denv1的ectom的4种血清型的ediii多肽的融合物。

在一特定实施方案中，本发明涉及质粒(命名为麻疹基因组载体)，其包含(i)编码麻疹病毒(mv)的全长rna基因组的cdna，所述cdna与以下重组：(ii)编码如本文定义的本发明的嵌合多表位的本发明的多核苷酸和任选存在的(iii)编码四价denv抗原的多核苷酸，所述四价denv抗原包含融合至如本文定义的denv1的ectom的4种血清型的ediii多肽的融合物。在一特定实施方案中，当(i)、(ii)和任选存在的(iii)的序列存在于mv基因组载体中时，它们一起遵守六位规则。

在一特定实施方案中，所述多核苷酸作为独立的插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间，或者所述mv基因组的h和l基因之间。任选地，所述插入物位于额外转录单元(atu)中，如具有构建体mdvvax6中说明的atu2或atu3的序列的atu。atu在源自mv的反基因组rna的cdna内的位置可以沿所述cdna变化。

在一特定实施方案中，本发明涉及重组麻疹病毒(mv)基因组载体，其为包含以下的质粒：(i)编码mv病毒的全长rna基因组的cdna以及(ii)编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸，所述多核苷酸作为插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间或者所述mv基因组的h和l基因之间，任选地在额外转录单元(atu)中，其中当重组于所述质粒中时，(i)和(ii)的序列一起遵守六位规则。

本发明还涉及重组mv基因组载体，其为包含以下的质粒：(a)编码mv病毒的全长rna基因组的cdna，(b)编码四价denv抗原的多核苷酸，所述四价denv抗原包含融合至denv1的膜蛋白的胞外域(ectom)的4种denv血清型的包膜结构域iii(ediii)多肽的融合物，特别是具有seqidno:145的序列的denv抗原，以及(c)本发明的多核苷酸，其中：

-所述多核苷酸(b)作为插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间，并且所述多核苷酸(c)作为插入物位于所述mv基因组的h和l基因之间，或者

-所述多核苷酸(b)作为插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间，并且所述多核苷酸(c)作为插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间，或者

-所述多核苷酸(b)作为插入物位于所述mv基因组的h和l基因之间，并且所述多核苷酸(c)作为插入物位于所述mv基因组的p和m基因之间，并且

其中当重组于所述质粒中时，(a)、(b)和(c)的序列一起遵守六位规则。

在一特定实施方案中，当(a)、(b)和(c)的序列重组于质粒中时，它们一起遵守六位规则。

包含两个多核苷酸的本发明的特定载体的核苷酸序列是如seqidno:139、seqidno:140、seqidno:141、seqidno:142、seqidno:143和seqidno:149公开的序列。

本发明还涉及用编码本发明的嵌合多表位的多核苷酸并任选地用编码本发明的四价ediii/ectom的多核苷酸，特别是编码四价denv抗原的多核苷酸遗传转化的宿主细胞，所述四价denv抗原包含融合至denv1的膜蛋白的胞外域(ectom)的4种denv血清型的包膜结构域iii(ediii)多肽的融合物。因此可以用本发明的载体，特别是用本发明的重组mv基因组载体转化特定宿主细胞。

通过本领域技术人员公知的方法，即通过化学转染(磷酸钙、lipofectamine)、基于脂质的技术(脂质体)、电穿孔、光穿孔、使用病毒载体…，用本发明的基因组载体转染本发明的宿主细胞。

在一特定实施方案中，以能够通过与同源细胞序列重组或通过插入细胞基因组使多核苷酸整合入细胞基因组的方式，用本发明的多核苷酸转化或转导细胞。转染、感染或转导可以离体，即在活生物体外的人工环境中发生。

如本文所用，术语“转染”、“转化”或“感染”指包含本发明的载体的细胞(瞬时表达)，而术语“遗传转化”指其基因组已通过本发明的多核苷酸决定性修改的细胞(永久表达)。

所述瞬时或稳定转化的细胞可以是任何原核(细菌)或真核(酵母、昆虫或动物，包括哺乳动物，特别是人)细胞。在一实施方案中，细胞为非人细胞。在一特定实施方案中，本发明的细胞是分离的人细胞，“分离”表示在它们的天然环境外。

在本发明的一特定实施方案中，所述细胞为hek-293-t7-mv细胞系。

更优选地，利用克隆入质粒ptm-mvschw的mvschwarz毒株的cdna制备适合进行本发明的感染性重组mv基因组载体，所述质粒于2002年6月12日由institutpasteur保藏在cncm(paris,france)的编号i-2889下，其序列由combredet(combredet,c.等人,2003,jvirol,77(21):11546-11554)描述，并且还公开于wo2004/000876中。质粒ptm-mvschw获得自bluescript质粒，并且包含置于t7rna聚合酶启动子的控制下的编码schwarz毒株的全长mv(+)rna链的多核苷酸，而且具有18967个核苷酸。可以从纯化自减毒活mv的病毒颗粒的核酸开始，类似地获得来自其他mv毒株的cdna。因此，本发明的重组mv基因组载体是如seqidno:139说明的ptm-mvdvax6、如seqidno:140说明的ptm-mvdvax7、如seqidno:141说明的ptm-mvdvax8、如seqidno:142说明的ptm-mvdvax9、如seqidno:143说明的ptm-mvdvax10或如seqidno:149说明的ptm-mvdvax11。

这样定义的包含重组mv基因组的质粒(基因组载体)适合用于制备重组麻疹病毒颗粒的拯救系统。

重组mv病毒的拯救可以如以前所述进行(combredet等人,jvirol.,2003,77(21):11546-11554)，特别是利用稳定的hek293-t7-mv辅助细胞(wo2004/000876)。

为了拯救待获得的重组mv颗粒并使得能够组装本发明的重组mv颗粒，使用辅助细胞(宿主细胞)，其表达rna聚合酶如t7rna聚合酶以及mv的n、p和l蛋白，并且将其用本发明的mv基因组载体遗传转化。可以这样实现通过辅助细胞表达mv蛋白：用额外的载体如反式互补质粒遗传转化辅助细胞，表达rna聚合酶如t7rna聚合酶以及mv的n、p和l蛋白。

在本发明的一实施方案中，辅助细胞系是293-t7-np细胞系，其于2006年6月14日保藏在collectionnationaledeculturesdemicro-organismes(cncm)的编号i-3618下；或者293-nlst7-npmv细胞系，其于2006年8月4日保藏在cncm的编号i-3662下。

本发明还涉及重组mv颗粒，其拯救自表达t7rna聚合酶以及mv的n、p和l蛋白的辅助细胞系，并且其进一步表达编码本发明的载体的核酸或编码本发明的重组mv基因组载体的核酸。

在另一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包含(a)denv抗原，所述denv抗原包含融合至denv1的ectom的4种denv血清型的ediii多肽的融合物，特别是具有seqidno:145的序列的denv抗原；以及(b)本发明的嵌合多表位，其任选地不含辅助佐剂(accessoryadjuvant)。

本发明还涉及包含本发明的重组mv颗粒的免疫原性组合物，所述组合物任选地不含辅助佐剂。有趣的是，本发明的重组mv颗粒能够在给药时于宿主中引发针对登革热病毒感染或者针对mv和登革热病毒感染的体液和/或细胞免疫应答。在一特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物引发免疫应答，特别是针对denv1、denv2、denv3和denv4的t细胞免疫应答，因此可以引发针对这些denv1-4血清型的任何病毒的感染的保护性应答。

根据本发明的一特定实施方案，所述免疫原性组合物被配制用于通过肠胃外途径如皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)或静脉内(i.v.)注射给药。

根据本发明的另一特定实施方案，所述免疫原性组合物以一个或多个给药剂量给药，特别是以初免-增强(prime-boost)给药方案给药。

在一特定实施方案中，所述免疫原性组合物不含辅助佐剂。

给药的量(剂量)取决于待处理的个体，包括患者的状况，个体免疫系统的状态，给药途径和宿主大小。合适的剂量范围为10³tcid50-10⁷tcid50，并且可以由本领域技术人员根据情况修改。

本发明还涉及疫苗组合物，其包含(a)denv抗原，所述denv抗原包含融合至denv1的ectom的4种denv血清型的ediii多肽的融合物，以及(b)本发明的嵌合多表位，其任选地不含辅助佐剂。

本发明还涉及包含本发明的重组mv颗粒的疫苗组合物，其任选地不含辅助佐剂。

本发明还涉及预防和/或治疗人类个体中的登革热病毒感染的方法，所述方法包括给药药学有效量的本发明的重组mv颗粒或本发明的免疫原性组合物，其中将所述颗粒或组合物与药学可接受的媒介物和/或佐剂混合。

如本文所用，术语“预防”指阻碍或延迟登革热病毒感染的方法。

如本文所用，术语“治疗”指缓解登革热病毒感染症状(即减少宿主中的登革热病毒感染或改善患者的临床状况)或完全消除登革热病毒感染症状的方法。

如本文定义的，药学可接受的媒介物涵盖使得能够将本发明的嵌合多表位，多核苷酸，载体，特别是重组mv基因组载体配制在组合物内的任何物质。媒介物是生理上可接受的(即适合其在与宿主，特别是人接触的组合物中的使用，因此是无毒的)任何物质或物质的组合。这类媒介物的实例为磷酸缓冲盐水溶液、蒸馏水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的湿润剂无菌溶液等。

如本文定义的，佐剂包括例如脂质体，油相，如freund类型佐剂，一般以具有水相的乳剂形式使用，或者可以包含不溶于水的无机盐，如氢氧化铝、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙。

本发明还涉及产生用于制备抗登革热病毒疫苗的重组mv颗粒的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：

a)在表达t7rna聚合酶以及mv的n、p和l蛋白的辅助细胞系中转染本发明的重组mv基因组载体；

b)将所述辅助细胞系转移至能够维持重组mv颗粒的复制和产生的感受态细胞上，所述重组mv颗粒表达本发明的嵌合多表位和任选存在的包含四价denv抗原的多肽，所述四价denv抗原包含融合至denv1的ectom的4种血清型的ediii多肽的融合物，特别是具有seqidno:145的序列的denv抗原；以及

c)回收步骤b)中产生的重组mv颗粒。

在本发明的一优选实施方案中，步骤b)中的感受态细胞为vero(非洲绿猴肾)细胞、cef(鸡胚成纤维细胞)细胞或mrc5细胞。

实施例

细胞培养

将vero细胞维持在补充了5％热灭活胎牛血清(fcs,invitrogen,frederick,md)的dmemglutamax(gibco-brl)中。使用于病毒拯救的稳定hek293-t7-mv辅助细胞(wo2004/000876)在补充了10％fcs的dmem中生长。

重组mv载体的构建和拯救

以前已描述了包含对应于schwarzmv疫苗毒株的抗基因组的感染性mvcdna的质粒ptm-mvschw(combredet等人,jvirol.,2003,77(21):11546-11554)。将编码来自denv1的非结构蛋白的多表位构建体的合成cdna插入bsiwi/bsshii消化的ptm-mvschw载体中的不同位置，联合或不联合以前描述的四聚体ediii抗原(brandler等人,plos2007,1(3),e96；brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)(图7)。重组病毒的拯救可以如以前所述(combredet等人,jvirol.,2003,77(21):11546-11554)利用稳定hek293-t7-mv辅助细胞(wo2004/000876)进行。使重组病毒在vero细胞上生长，并且通过vero细胞上的终点稀释测定确定病毒滴度。

蛋白印迹

为了证实通过mv载体或pcdna3表达质粒表达denv抗原，将来自用mv-denv感染的vero细胞或来自用pcdna3-ns质粒转染的hek293细胞的裂解物通过sds-page分级分离，转移至纤维素膜(amershampharmaciabiotech)，并且用抗ediiidenv1mab4e11或抗ns3抗体探测。山羊抗小鼠igg-辣根过氧化物酶(hrp)缀合物(amersham)用作二抗。用增强的化学发光检测试剂盒(pierce)使过氧化物酶活性可见。这个分析显示mv载体表达ediii四聚体抗原和ns多表位抗原。相似地，pcdna3-ns质粒表达高水平的ns多表位抗原(图8)。

小鼠实验和细胞免疫应答

如以前所述(combredet等人,jvirol.,2003,77(21):11546-11554)产生ifnα/β受体缺陷和表达人mv受体的小鼠(hcd46+/-ifnα/β-/-或cd46-ifnar)，并且在institutpasteur动物设施安置在无病原体的条件下。在institutpasteur按照实验室动物护理办公室的指南进行实验。通过腹腔内(ip)途径用单一给药的10⁵tcid50的mv-denv载体或空mv接种6只6周龄cd46-ifnar小鼠的组。免疫后7天将小鼠安乐死并采集脾。将新鲜提取的脾细胞用denv肽(2μg/ml)或mv(moi1)特别刺激18h。还通过作为阳性对照的伴刀豆球蛋白a(5μg/ml,sigma)和作为阴性对照的rpmi–il-2(10u/ml)刺激细胞。如以前所述通过elispot测定测试它们在刺激时分泌ifn-γ的能力(guerbois等人,virology,2009,388(1):191-203)。

肽

合成覆盖整个ns多表位序列的一系列的36个重叠肽(5个氨基酸重叠的9-15个氨基酸)(图9)。用预测算法还鉴定了能够结合至cd46-ifnar小鼠中表达的h2-db和h2-kbt细胞受体的5个特异性肽(图9)。这些肽在池中或作为单独的肽用于elispot实验以在来自免疫的cd46-ifnar小鼠的脾细胞中重新刺激t细胞应答。

cd46-ifnar小鼠中的免疫原性

利用对单一免疫之后7天采集的脾细胞的ifn-γelispot测定评价通过用mv-denv免疫引发的细胞介导的免疫应答(cmi)。通过denvns肽或mv离体刺激之后，在mv-denv免疫的小鼠中检测到大量的denv特异性的ifn-γ分泌细胞(400-800个斑点形成细胞/10⁶个脾细胞)(图10、11、12)，这代表相似刺激条件(1500个斑点形成细胞/10⁶个脾细胞)中三分之一的mv特异性应答。用mv-denv免疫的大部分小鼠(5/6)具有显著的对denv的cmi应答，证实这个实验模型中的单一mv-denv免疫能够在一周内引起抗denv细胞免疫。

人源化小鼠中的免疫原性

通过电穿孔将在cmv启动子下表达denv1ns多表位序列的pcdna3质粒注射入hla-a*02-01、hla-a*24:02、hla-b*07:02和hla-b*35:01单链转基因/h-2i类裸鼠中，并且通过针对单独肽的elispot测定定量脾细胞的inf-γ应答(图13)。

于被描述在以前暴露于denv的人供体中引发hla限制性t细胞应答的47个潜在表位中，在免疫的小鼠中鉴定了13个表位：ns3的第一结构域中的4个，并且受hla-a*02:01、hla-b*07:02和hla-b*35:01限制；ns3的第二结构域中的4个，受hla-a*24:02和hla-b*35:01限制；ns4b中的3个，受hla-a*24:02和hla-b*35:01限制；以及ns5中的2个，并且受hla-a*02:01和hla-b*07:02限制(图14)。

不同转基因小鼠中引发的t细胞应答的比较显示hla-b*35:01小鼠中较高数量的具有较高数量级的肽，与来自高发区的人供体中与这个等位基因相关的高应答频率和数量级一致(weiskopfd等人,procnatlacadsciusa2013,110(22):e2046-2053)(figure15)。

有趣并且与选自不同血清型的保守抗原区一致(图1和14)的是，多表位构建体上存在的抗原表位的氨基酸序列在其他登革热血清型中是保守的，特别是参与hla结合的两个锚残基(表3)。这表明基于denv1的构建体诱导的cd8+t细胞也可以识别源自denv2、3和4的肽。这种t细胞交叉反应性可以利用人ebv转化的b细胞系c1r(zemmourj等人,jimmunol1992,148(6):1941-1948)证实，所述人ebv转化的b细胞系c1r表达单一hla等位基因，并且用同源肽脉冲培养或者用denv1、2、3和4感染。

表3.小鼠中鉴定的具有4种不同hla限制性的ns多表位序列的4种denv血清型的表位中的序列保守。预测的锚残基下划线并以灰色高亮显示。

a)肽hla-a*02:01

b)肽hla-a*24:02

c)肽hla-b*07:02

d)肽hla-b*35:01

用denv1-ns多表位构建体(seqidno:3)dna免疫之后诱导的体外和体内免疫保护的证据

a.在hlai类转基因小鼠中诱导denv特异性细胞毒性t细胞。

为了研究cd8t细胞在保护性免疫应答中的作用，将4组h-2i类空/hlai类转基因小鼠(hla-a*02:01、hla-a*24:02、hla-b*07:02和hla-b*35:01)通过dna免疫进行免疫接种。在由7只转基因动物组成的每组中，5只和2只小鼠分别接受denv1-ns多表位构建体和对照质粒。所有动物均通过真皮内注射(100μgdenv1-ns多表位或对照质粒)然后体内电穿孔来免疫。以3周间隔进行2次免疫，并且第二次注射之后10天测试脾细胞的体外和体内细胞毒性活性以及通过elispot测定测试脾细胞的ifn-γ分泌。

1-体外评价denv特异性细胞毒性t细胞应答

在每组hlai类转基因动物中，测试分别接受denv1-ns多表位构建体和对照质粒的3只和1只小鼠的抗原特异性细胞毒性t细胞应答。利用颗粒酶b(grb)elispot测定获得t细胞应答的定量，其在单细胞水平测量细胞毒性介质颗粒酶b的释放，并且据显示其与t细胞裂解靶细胞(ewencl等人,2006,jimmunolmethods,308(1-2):156-166；kaliav等人,2010,advexpmedbiol,684:79-95；zanettim,等人2010,advexpmedbiol,684:108-125)和抑制病毒产生(marcet-palaciosm,等人,2011,plospathog,7(12):e1002447)的能力强烈相关。在这个测定中，与细胞分泌ifn-γ的频率平行测量在用同源或无关肽体外刺激时脾细胞释放颗粒酶b的频率。结果显示与用对照pcdna3.1质粒免疫的动物相比，在用denv1-ns多表位构建体免疫的小鼠中显著的inf-γ和grb应答(图16a和16b)。ifn-γ应答和grb释放之间也有关联，对hla-a24小鼠中的肽p32、hla-a2小鼠中的p56、hla-b7小鼠中的p15以及hla-b35小鼠中的p49、p50和p51获得的ifn-γ和grb的应答最高。

2-体内评价denv特异性细胞毒性t细胞

如以前所述进行体内细胞毒性测定(clementet.等人,2013,methods,61(2):105-109)。简单地说，将用denv1-ns多表位构建体或对照质粒免疫的小鼠用装载肽的同基因细胞过继转移并用荧光染料标记(细胞微量紫)。将分别用特异性肽和对照肽脉冲培养的10⁷高-和10⁷低-荧光染色细胞的混合物静脉内注射入受体动物。注射之后18小时，通过流式细胞术分析受体小鼠的脾细胞，并且确定细胞微量高供体细胞(用特异性肽的混合物脉冲培养的细胞)和细胞微量低供体细胞(未脉冲培养或用对照肽脉冲培养)之间的比例。因为将等量的高和低染色细胞注射入受体小鼠，所以免疫小鼠中的特异性杀死活性导致较低分数的装载特异性肽混合物的高染色细胞(图17)。利用下式确定特异性裂解的百分比：

b.在人源化小鼠中诱导保护性免疫应答

因为i型ifn充足的小鼠抗denv感染，所以仅可以在i型缺陷的小鼠或用人造血干细胞移植的alymphoid小鼠中考虑疫苗诱导的针对用denv攻击的保护性免疫应答。与用具有hla限制性应答的人骨髓和淋巴室重组的新世代人源化小鼠的最近发展一致(legrandn,等人,2011,procnatlacadsciusa,108(32):13224-13229；garcias,等人,2012,immunollett,146(1-2):1-7；serra-hassounm,等人,2014,jimmunol,193(3):1504-1511)，发明人将使用人sirpalpha转基因的rag^-/-γc^-/-小鼠，其中小鼠mhci类和ii类分子已分别被人hla-a2和dr1分子代替(ch1-2hsa)。

在第一设置中，hla-a2分子为hhd构型(具有连接至小鼠h-2d^b的α3结构域的hla-a2的人α1和α2结构域)(pascolos等人,1997,jexpmed,185(12):2043-2051)。ch1-2hsahhd小鼠目前是可获得的。人造血脐带血祖细胞移植之后3个月，当所有人子集已在宿主中重组时，首先用登革热病毒感染小鼠以证明人树突细胞室中的体内病毒复制。简单地说，用10⁵或10⁶pfu的denv1毒株kdh0026a(源自人临床分离株)静脉内感染2组各3只小鼠。通过定量逆转录(qrt)-pcr监测病毒滴度。

在第二设置中，hla-a2分子由全人hhh型式的i类分子组成。目前正在开发的这些新ch1-2hsahhh宿主应当提高人cd8/tcr分子结合至mhc-肽复合物，允许更有效刺激denv特异性cd8t细胞。如图13所述，用denv1-ns多表位和对照质粒构建体免疫2组各6只人源化的ch1-2hsahhh小鼠。在每组6只重组小鼠内，在每组3只小鼠内静脉内注射10⁵或10⁶pfu的denv1毒株kdh0026a之后第2、4和7天通过qrt-pcr定量感染动物血液中的病毒mrna来评价保护。

c.cd46-ifnar小鼠中的mvdvax保护效力

发明人在cd46-ifnar小鼠中评价了表达四价denv抗原(包含融合至denv1的膜蛋白的胞外域(ectom)的4种denv血清型的包膜结构域iii(ediii)的融合物)且同时表达本发明的denv1ns抗原的重组mvdvax载体的保护效力(描述于图7中)。如以前所述(combredet,c.等人,2003,jvirol,77(21):11546-11554)产生cd46-ifnar小鼠，并且在institutpasteur动物设施安置在无病原体的条件下。在institutpasteur按照实验室动物护理办公室的指南进行实验。通过腹腔内(ip)途径用10⁵tcid50的mv-denv载体或空mv接种6只6周龄cd46-ifnar小鼠的组。引发之后1个月进行相同剂量的第二次给药。为了分析抗mv和抗denv抗体的存在，通过眶周途径定期采血。最后一次免疫之后2个月，通过腹腔内注射10⁵tcid50的vero细胞上生长的小鼠-神经适应的denv1夏威夷毒株来实验攻击所有动物(despres等人,j.virol.,1998,72(1),823-829)。攻击之后，在第1、2、3、5、7天通过眶周途径采血，并且在接下来的15天追踪动物的临床表现和称重。通过如下文所述的一步qrt-pcr确定小鼠血清中的denv1基因组病毒负荷。将血清在56℃下热灭活30min，并且利用elisa(trinitybiotech)检测抗mv抗体的存在。hrp缀合的抗小鼠免疫球蛋白(jacksonimmunoresearch)用作二抗。如以前所述(brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)通过elisa，利用由来自大肠杆菌(e.coli)中产生的或体外合成的denv1、denv2、denv3和denv4的重组ediii蛋白包被的96-孔板检测抗denv抗体。hrp缀合的抗小鼠免疫球蛋白用作二抗。汇集的血清的终点滴度计算为给出来自用作阴性对照的mv接种小鼠的两倍吸光度的最后稀释的倒数。

d.非人灵长类中的mvdvax保护效力

发明人将在非人灵长类(nhp)中评价重组mvdvax载体的保护效力。

实验如下进行：

病毒.攻击病毒：denv1牙买加毒株cvi16363p，1977年分离，世代2/3mp/3pc6/36ht2pvero细胞培养上清液。denv1毒株kdh0026a，c6/36细胞培养上清液。denv2dj.m.o.1.7.12，c6/36细胞培养上清液。denv4多米尼加814669毒株，1981年分离，世代4pc6/36ht2pvero细胞培养上清液。这些病毒用于中和测试。如以前所述(brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)制备重组mvdvax疫苗病毒，并且通过对vero细胞的终点有限稀释测定测定病毒滴度。

动物.将源自毛里求斯的食蟹猴(macacafascicularis)安置在cea的bsl-3动物护理设施中。法兰西岛地区伦理委员会批准按照europeandirective2010-63-ue进行的实验方法。动物是未成年雄性和雌性成年(0.8–1kg)。为了评价疫苗候选物的免疫原性，用相隔一个月的包含10⁵tcid50的mvdvax疫苗病毒的2个200-μl剂量皮下接种12只动物，并且在6个月后用10⁶tcid50的mvdvax的第三剂量强化。相似地，8只对照动物接受2次给药的空mvschw疫苗(200μl，包含10⁵tcid50)和6个月后的10⁶tcid50的第三剂量。最后一次免疫之后5个月，将动物分为两组，并且通过静脉内接种悬浮于200μlpbs中的1.0×10⁴pfu的野生型denv1或denv4来攻击。监测猴的病毒血症、临床表现以及细胞和抗体应答。通过percoll密度梯度离心(sigma-aldrich)分离外周血单核细胞(pbmc)。采集血清和血浆并储存在-20℃下用于以后的分析。

体液应答.如以前所述通过使用酶联免疫吸附测定(elisa)检测热灭活血清中的抗denv和抗mv抗体(brandler等人,vaccine,2010,28,6730-6739)。当光密度(od)是来自对照动物的血清的od的2倍时，认为血清是阳性的。

denv中和测试.如以前所述利用蚀斑减少中和测试(prnt)检测vero细胞中的抗denv中和抗体(brandler等人,plos2007,1(3),e96)。简单地说，利用50ffu的vero适应的denv1夏威夷毒株(who参考毒株，genbank登录号af226687)、denv2牙买加毒株n.1409、denv3毒株pah881/88泰国或denv4毒株63632/76缅甸在vero细胞上检测抗denv中和抗体。终点滴度计算为ffu的数量减少至少50％的最高血清稀释。还在疫苗开发中心(cvd,mahidoluniversity,thailand)测试中和抗体滴度。在cvd进行的测试中，使用源自猴肾的llc-mk2细胞和以下denv：denv1(16007)、denv2(16681)、denv3(16562)和denv4(1036)，并且如以前所述基于蚀斑计数的50％减少(prnt50)计算prnt滴度(sirivichayakul等人virol.j.2014,11-48)。

细胞免疫应答.如以前所述(stebbings等人,plos-one,2012,7(11),e50397)，用覆盖mvdvax的denv1-ns插入物的合成肽池刺激来自外周血的淋巴细胞之后通过elispot测定和通过多功能流式细胞术检测细胞应答。在1μg/ml的共刺激抗体抗cd28和cd49d(biolegend)的存在下，用1μg/ml/肽的合成15-聚体(重叠11aa)肽池(bei,http://www.beiresources.org)或10⁴tcid50/10⁶个细胞的减毒活空mv一式三份刺激细胞。用等体积的没有肽的dmso(0.15％v/v)温育阴性对照，并且用1μg/ml葡萄球菌肠毒素b(sigma-aldrich)温育阳性对照。

denv病毒rna的定量和denv滴定.在0.5ml达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)/5％胎牛血清(fcs)中稀释血清(25μl)。提取病毒rna(qiaamp病毒rna提取试剂盒，qiagen)，并且利用高保真酶(roche,mannheim,germany)，通过一步denvqrt-pcr进行分析。用realarttmwnvlc实时pcr试剂盒(qiagen)进行denvrna的实时qrt-pcr。对于病毒滴定，在250μl培养基中稀释样品，并且在用包含0.8％最终(重量/体积)羧甲基纤维素的dmemglutamax/2％fcs覆盖的vero细胞上测定系列稀释的感染性。温育4天后，将细胞固定，并且如以前所述通过免疫聚焦测定使蚀斑可见(brandler等人,plos2007,1(3),e96)。

序列表

<110>巴斯德研究院

国立科学研究中心

<120>包含非结构蛋白的片段的登革热病毒嵌合多表位及其在抗登革热病毒感染的免疫原性组合物中的用途

<130>b10753aad/dp/am

<140>pct/epxxxxxx

<141>2015-06-22

<150>ep14305984.8

<151>2014-06-23

<160>152

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1617

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>nativenucleotidesequenceofthepolynucleotideencodingthe

chimericpolyepitopeofdenv1

<400>1

gcatcacaagaagggcccctaccagagattgaagatgaggtgtttaggaaaagaaactta60

acaataatggacctacatccaggatcagggaaaacaagaagatatctcccagccatagtc120

cgtgaggccataaaaaggaagctgcgcacactaattttggctcccacaagggttgtcgct180

tccgaaatggcagaggcgctcaagggaatgccaataaggtaccaaacaacagcagtgaag240

agtgaacacacaggaaaagagatagttgacctcatgtgccacgccactttcaccatgcgt300

ctcctgtctcccgtgagagttcccaattacaacatgattattatggatgaagcacatttc360

accgatccatccagtatagcagccagagggtacatctcaacccgagtgggcatgggtgaa420

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aatgcagttatccaagatgaggaaagagacattcctgagagatcatggaactcaggatat540

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ataaacacaccagaaggaattatcccagctctctttgagccggagagagaaaagagtgca660

gcaatagacggggagtacagactgcggggagaagcaaggaaaacgttcgtggagctcatg720

agaagaggagatttaccagtttggctatcttacaaagttgcctcagaaggcttccaatac780

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tggaccctctatgcagtggccacaacaattatcactcccatgatgaggcacacaatagaa1080

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>optimisednucleotidesequenceofthepolynucleotideencodingthe

chimericpolyepitopeofdenv1(humancodonoptimised,measles

optimised)

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