生产富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的方法与流程

本发明涉及从藻类获得富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的方法。

更具体地说，本发明涉及获得富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的方法，该方法包括至少一个由向藻胆蛋白的水提物添加水杨酸组成的沉淀步骤，所述沉淀物具有至少等于所述水提物中初始含有量的50％的藻胆蛋白含量并具有至少等于70％的澄清度。在藻胆蛋白中区分有藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白以及与此相关的蛋白质，藻胆蛋白是在某些藻类(红藻和隐藻纲(cryptophyceae))和所有的蓝细菌中存在的光合色素蛋白。这些蛋白色素具有从红色到蓝色的着色能力。

目前，这些色素正在重新吸引着人们的兴趣。事实上，当前存在着一种用天然产品替代合成组分的强烈趋势。这种趋势从以下方面得到解释：一方面，消费者出于对健康、生态和环境保护的要求对天然产品的需求增加，另一方面，旨在相对于合成产品推进天然产品的法规的变化。这种情形解释了对天然染料的市场需求大幅增加的原因。

一篇关于在市场上可获得的天然染料的列表的综述揭示了蓝色染料的大幅缺乏。示出的仅有的一些是母菊薁(提取自甘菊花)和靛蓝(来自于槐蓝属植物(indigoplant)的叶子的发酵)。然而，由于低提取率(这两种染料的提取率均不超过干重的0.1％)，这两种染料的可得性仍保持低于市场需求。

在藻胆蛋白中，藻蓝蛋白由于其独特的蓝色而保持着事实上的垄断地位。藻蓝蛋白是仅在蓝藻中发现的有色蛋白。其不能化学合成。涉及藻蓝蛋白的各种研究的结果提及其抗氧化剂、抗炎和抗肿瘤能力的可能性。

广泛表明藻蓝蛋白用于使某些食物产品(加冰类型饮料的冰或甜品、冰淇淋、面团、蛋糕和饼干等)着蓝色。

其作为一种组分能被引入到护肤霜剂、美容面膜和防晒产品中。其有利地替代了被认为是可疑的合成色素。

当前，已知的工业规模上的藻蓝蛋白的应用被局限于几种食品(杏仁蛋白软糖；甜味汁；冰、冰沙和附带地，巧克力)或几种化妆品制剂(霜剂和凝胶剂)。市场上的仅有的藻蓝蛋白销售被几家公司(主要是日本)垄断并在大部分的美国天然食用染料市场仅覆盖2％。

而且，藻蓝蛋白能够从蓝细菌螺旋藻(钝顶螺旋藻，arthrospiraplatensis)中提取，蓝细菌螺旋藻能含有3％至12％的藻蓝蛋白。这种蓝色微藻被who认为是安全的，其以工业规模进行生产。其开发遍及全世界数个国家中。

一旦从生物质中提取出藻胆蛋白，进行浓缩步骤是必要的，浓缩步骤通常引起沉淀。

有几种藻胆蛋白浓缩方法。一些使用重型设备，耗时长，如离心、冻干或透析。在工业规模上此类方法的推广产生高昂的投资费用。较简单的其他方法使用盐(特别是硫酸铵，其能够额外地保护藻胆蛋白抵抗细菌和真菌)进行沉淀。在用硫酸铵沉淀的情况中，需要大量的这种盐(大于提取物重量的60％)。而且，已知硫酸铵具有皮肤和眼睛刺激以及在摄取或吸入事件中肺充血和呼吸困难等急性作用。

从这方面要排除常用于沉淀蛋白质的其他方法，其利用非食品级的酸、有机溶剂、非离子型聚合物或甚至是絮凝剂，并常常导致藻胆蛋白变性。

发明人已证实向藻胆蛋白水提物添加水杨酸能够使藻胆蛋白沉淀。水杨酸是天然酸，具有食品质量并且极普遍地用作食品防腐剂。

藻胆蛋白市场的主要要求覆盖三个基本方面：响应于与食物或化妆品产品有关的各种法规的需要、良好的颜色稳定性以及有竞争力的价格。就法规而言，藻胆蛋白总体上的天然性质以及它们的提取在不存在任何有机溶剂的水溶液中进行的事实是确定的优势。

本发明寻求解决的技术问题是获得富含藻胆蛋白同时稳定的沉淀物。

藻胆蛋白在本质上是蛋白质，溶于水性溶剂，从而促进细菌和真菌的发展并严重影响它们的保存期限。而且，藻胆蛋白是强光敏性的，这导致颜色稳定性差，限制了这些藻胆蛋白的大宗工业用途。确实，藻胆蛋白常遭受光降解，光降解使其即使在弱照明下也快速失去它们的着色能力。这种光化学过程导致发色团分子部分或全部变性。一些方法使用氧清除剂和自由基清除剂，如生物喋呤-葡萄糖苷。藻胆蛋白化学偶联至这些清除剂。直到现在，此类稳定剂也不是完全令人满意的，因为关于它们的无毒性并没有定论。而且，它们的成本太高以致于不管藻胆蛋白的最终用途如何均不能期望大规模使用。

最后，直到现在稳定化的藻胆蛋白也仅是在短时间(几小时)内稳定，不适宜这些色素的化妆品、营养品或食品加工应用。

专利us5643585提出使用来源于红藻的不溶的更稳定形式的材料；所述材料通过使用有机溶剂的方法获得。这种不溶形式使这些色素的应用局限于粉末状化合物。

专利wo2005/065697描述了通过向水提物添加含抗坏血酸的赋形剂来光稳定藻胆蛋白的方法。这种方法没有描述浓缩提取物的步骤，而浓缩提取物对于需要低水含量的制品是必不可少的。

专利wo2014/045177描述了通过直接在甘油或在水/甘油混合物中浸解生物质然后过滤来提取和稳定藻蓝蛋白的方法。需要的浸解时间相当长，最多达15天。同样地，提取率也相当低，不超过所用生物质的1％。

发明人令人惊讶地证实了向藻胆蛋白水提物添加水杨酸能够解决所要解决的技术问题。

因此，本发明的主要主题是获得富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的方法，该方法包括至少一个由向藻胆蛋白水提物添加水杨酸组成的沉淀步骤，所述沉淀物具有至少等于所述水提物中初始含有量的50％的藻胆蛋白含量并具有至少等于70％的澄清度。

术语“藻胆蛋白”意在表示从某些微藻或从蓝细菌中分离的光合水溶性色素蛋白质，如别藻蓝蛋白(apc)、藻蓝蛋白家族(c-pc和r-pc)、藻红蛋白家族(r-pe和c-pe)和藻红蓝蛋白(pec)。

术语“水提物”意在表示通过使用水性溶剂(如水、海水或任何含有cacl2、nacl或任何其他磷酸盐或钾盐的水溶液)提取和溶解藻胆蛋白的步骤获得的产物。

来自于沉淀步骤的术语“沉淀物”意在表示从水提物中通过沉淀浓缩的藻胆蛋白的量。在本发明的上下文中，使用水杨酸来沉淀藻胆蛋白。

术语“稳定”意在表示其中藻胆蛋白未被降解、特别是在自然光下未被降解的沉淀物。稳定性可以通过藻胆蛋白的半衰期来测量，藻胆蛋白的半衰期表示导致一半藻胆蛋白降解的天数。

通过本发明的方法沉淀的藻胆蛋白的半衰期在低于20℃的温度、特别是在10℃至20℃之间的温度下以及在低于50μmolm^-2s^-1的光强度、特别是在5μmolm^-2s^-1至50μmolm^-2s^-1之间的光强度下能够达到50天、60天、70天、80天、90天、100天或甚至110天。

半衰期例如根据藻胆蛋白的浓度随天数(或小时数)的变化来测定。然后以如下方式表示藻胆蛋白降解的程度：((藻胆蛋白的初始量–第d天藻胆蛋白的量)×100/藻胆蛋白的初始量)。半衰期对应于使初始浓度的一半(50％)降解时的天数，即这种程度等于50％。在降解程度低并且未达到50％的情况中，能够使用在实验范围中获得的日降解程度进行外推以预测超过该范围的半衰期。

稳定性还能通过保持颜色来评价。确实，藻胆蛋白的任何降解都将导致悬浮液或提取物的颜色变化。

能通过测量例如在620nm(对应于藻胆蛋白的吸收峰)下提取物的吸光度来评价颜色。这一波长下的吸光度降低表明藻胆蛋白降解。

根据培养条件，微藻的生物质至多含有20％至25％的藻胆蛋白。因此，表述“沉淀物具有至少等于水提物中初始含有量的50％的藻胆蛋白含量”意在表示以下事实：通过本发明的方法沉淀了水提物含有的20％至25％的藻胆蛋白的50％。

为本发明的主题的藻胆蛋白能从蓝细菌或从微藻提取。

所述微藻特别是选自红藻纲(rhodophyceae)、蓝藻纲(cryptophyceae)和蓝细菌，更特别地是钝顶螺旋藻和水华束丝藻(aphanizomenonflos-aquae)，特别是克拉马斯海藻(algaklamath)。

当对钝顶螺旋藻(螺旋藻)进行提取时，根据m.rebeller等人(1979)描述的方法进行提取。这种提取方法是在10g/l的cacl2溶液中进行2小时，随后通过10μm纱布过滤。其也能够在海水中进行，这使其能够使藻胆蛋白提取物富集微量元素并通过避免使用商业盐来降低提取成本。

溶液中各种藻胆蛋白的量通过bryant等人(1976)建立的分光光度法来测定。

根据本发明的方法使其能够获得包含初始水提物中含有的藻胆蛋白量的至少50％、优选75％、甚至更优选80％的藻胆蛋白沉淀物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述藻胆蛋白沉淀物包含初始水提物中含有的藻胆蛋白量的至少85％、或至少90％、95％并直到沉淀完全为止，即所述沉淀物包含100％的水提物中含有的藻胆蛋白。

从干生物质或新鲜生物质提取藻胆蛋白导致细胞溶解。

术语“细胞溶解”意在表示通过任何方式并且特别是通过物理/机械方式(通过超声处理、冷冻/解冻循环)或化学方式(cacl2、(nh4)2so4的溶液)或生物方式(酶)使细胞或细菌的质膜破裂。细胞溶解生成不溶性膜碎片和复合物，其保留在回收的提取物的悬浮液中。这些提取残留物的去除被称为澄清。

发明人令人惊讶地证实了向藻胆蛋白水提物添加水杨酸使其能够既沉淀提取物中含有的藻胆蛋白又去除提取残留物。

可以使用表述“选择性沉淀分离藻胆蛋白与提取残留物”。事实上能够通过改变水杨酸浓度沉淀这两组化合物中的一组或另一组。

术语“澄清度”意在表示藻胆蛋白在根据本发明的方法获得的全部沉淀物中的比例。当沉淀物不含有膜碎片(其为细胞溶解残留物)时，澄清度为100％。添加水杨酸后，通过分光光度法单独测定未沉淀的藻胆蛋白和碎片的量。由此推导出沉淀的藻胆蛋白和碎片的含量。此外，以下列方式测量澄清度：100×沉淀的藻胆蛋白的量/(沉淀的藻胆蛋白+碎片的量)。

基于620nm和650nm下的光密度并通过应用bryant等人(1976)的公式来估算藻胆蛋白含量。通过测量680nm下的光密度并根据建立的使od680与微藻的干生物质关联的相关曲线(costa等人，2002)来评价碎片含量。

根据本发明的方法使其能够获得具有至少等于所述水提物中初始含有量的50％的藻胆蛋白含量并具有至少等于80％、优选90％、或等于100％的澄清度的沉淀物。

根据本发明的方法使其能够获得一种藻胆蛋白沉淀物，该藻胆蛋白沉淀物包含所述水提物中含有的藻胆蛋白量的50％至80％，并具有至少等于70％的澄清度。

在本发明的一个具体实施方式中，所述富含藻胆蛋白的沉淀物的澄清度等于75％、80％、85％、90％、95％或100％。换句话说，膜碎片或复合物的含量在0％(则澄清是完全的)至30％之间，并且可以等于沉淀物量的5％、10％、15％或25％。

在本发明的一个优选实施方式中，该方法使其能够获得一种沉淀物，该沉淀物具有至少等于所述水提物中初始含有量的70％的藻胆蛋白含量，并且不含膜碎片。

术语“不含膜碎片”意在表示沉淀物具有100％的澄清度的事实。

在本发明的一个具体方式中，根据本发明的方法使用含有至少1.5g/l的所述藻胆蛋白的藻胆蛋白水提物。

用于通过水杨酸沉淀的藻胆蛋白水提物因此可以含有大于或等于1.5g/l藻胆蛋白的量。

本发明建立以下方程式，使其能够测定对于溶于初始提取物中的任何量的藻胆蛋白使用的水杨酸的最小量：水杨酸(g)＝0.007×藻胆蛋白(mg)/0.52。

在本发明的方法中使用的水杨酸以如下方式添加至含有至少1.5g/l所述藻胆蛋白的水提物：使得获得基本上大于或等于4g/l且基本上小于或等于20g/l的水杨酸浓度。在本发明的一个具体实施方式中，添加的水杨酸的量为4g/l至10g/l，或者为10g/l至15g/l或者为15g/l至20g/l。

在本发明的一个具体实施方式中，水杨酸以如下方式添加至藻胆蛋白水提物：使得获得基本上大于或等于4且基本上小于或等于13g/l的水杨酸浓度。在此实施方式中，藻胆蛋白沉淀物具有至少等于水提物中含有的初始量的50％的藻胆蛋白含量和100％的澄清度。换句话说，该沉淀物不再显示出来自于使其能够获得水提物的提取步骤的膜碎片或残留物。

则澄清是完全的。膜碎片和复合物则保留在上清液中。

更特别地是，已证实澄清(完全或部分澄清)的质量取决于藻胆蛋白和膜碎片各自的含量。确实，溶液中藻胆蛋白的浓度越大，且其含有的碎片越少，澄清越好。更具体地说，具有大于1.5g/l的藻胆蛋白含量、优选1.5g/l至1.8g/l范围内的藻胆蛋白含量以及0.7g/l至0.9g/l范围内的膜碎片含量的藻胆蛋白溶液将允许良好的澄清。在这些条件下，对于在基本上大于或等于4g/l的值至基本上小于或等于13g/l的值之间的水杨酸浓度，澄清可以是完全的。

在本发明的另一个实施方式中，水杨酸以如下方式添加至藻胆蛋白水提物：使得获得基本上大于或等于13g/l且基本上小于或等于14g/l的水杨酸浓度。在此实施方式中，藻胆蛋白沉淀物具有至少等于水提物中含有的初始量的70％的藻胆蛋白含量以及至少等于70％的澄清度。

在本发明的一个具体实施方式中，该方法可以包括在用水杨酸沉淀的步骤之前的澄清步骤。

澄清可以通过简单的滗析来进行，滗析除去大部分的残留物，但是在这些条件下自细胞溶解产生的或多或少高比例的不溶性膜碎片和复合物保留在回收的提取物的悬浮液中。

完全澄清需要诉诸于更剧烈的程序，如在高于8000rpm下的离心、采用截留量少于100kd的管或膜的透析或切向超滤、或使用聚合物的色谱法，使其能够在提取物通过期间截留碎片。此类剧烈的澄清方法的工业规模推广常常产生高投资成本。

澄清因此能通过添加水杨酸或通过两种互补方式(即在第一步骤中滗析以及在沉淀期间向水提物添加水杨酸)来进行。

在本发明的一个具体实施方式中，该方法可以包括在使用水杨酸选择性沉淀藻胆蛋白之后溶解沉淀物的步骤。

这一溶解步骤特别是使用具有食品质量的天然多元醇来进行。其实例为甘油或丙三醇。甘油是一种优异的天然防腐剂。其稳定蛋白质并防止细菌和真菌生长。甘油具有允许良好的使藻胆蛋白防腐的优点。

在本发明的上下文中也能使用丙三醇或多元醇丙烷-1,2,3-三醇(或1,2,3-丙三醇)的任何衍生物或任何形式。

在本发明的上下文中，已测定1.2l甘油能够溶解27g沉淀的和/或澄清的藻胆蛋白。

藻胆蛋白-甘油溶液能在环境温度和光度条件下储存超过三个月，在冷条件以及暗条件下能够储存数年。

本发明的方法还能在生长被阻断的生物质中诱导藻胆蛋白合成的步骤之后进行。本发明的方法使其能够获得一种生物质，该生物质具有至少等于所述生物质干重的20％的藻胆蛋白含量。

本发明的方法使其特别能够获得一种生物质，该生物质具有至少等于所述生物质干重的21％、22％、23％、24％或25％的藻胆蛋白含量。

本发明的方法使其特别能够获得一种生物质，该生物质具有在所述生物质干重的20％至25％之间的藻胆蛋白含量。

因为该方法的这一合成步骤是在培养罐外进行，使其能够不损害生物质的生产率。

术语“生物质”意在表示在培养中在给定的时刻下活微藻的总质量。其用克/升(g/l)表示。

术语“藻胆蛋白”意在表示从某些微藻或从蓝细菌分离的光合水溶性色素蛋白质，如别藻蓝蛋白(apc)、藻蓝蛋白家族(c-pc和r-pc)、藻红蛋白家族(r-pe和c-pe)和藻红蓝蛋白(pec)。

术语“诱导合成”意在表示通过任何方式刺激微藻生物质产生藻胆蛋白。

术语“诱导培养基”意在表示含有与最佳生长所需的盐浓度相比过量的或不足的一种或多种盐的任何微藻培养基。在本发明的上下文中，这种培养基含有过量的氮，该氮是通过向zarrouk培养基添加nano3而获得的，浓度为大于2.5g/l，并优选为3至5g/l。

术语“阻断生长”意在表示使微藻的增殖停止。阻断生长是可逆的。确实，在阻断生长之后，收集一部分生物质。则浓度因此降低，并且生物质能够再次生长。因此生物质未受损害。

阻断所述微藻生物质的生长的步骤在诱导罐中进行，并且在所述罐中所述生物质的浓度比培养中允许微藻最佳生长的浓度高3至13倍时进行。

阻断所述微藻(特别是蓝细菌，更特别是钝顶螺旋藻)生物质的生长在诱导罐中进行，在所述罐中所述生物质的所述浓度特别是比培养中允许微藻最佳生长的浓度高3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13倍。

例如根据微藻的生长率随培养密度而变化的曲线，进行阻断生长(阻断微藻增殖的事实)的决定。当微藻的生长率为零时，观察到阻断。

术语“浓度”可以用术语“密度”替代。术语“生物质密度”或“生物质浓度”的使用无差别。密度，同浓度一样，用g/l表示。

已接受的是：培养中允许微藻最佳生长的密度/浓度为大约0.4g/l。

这种阻断通过将1至5g/l浓度的生物质引入至诱导罐来进行，但是这种装置不是限制性的，并且在本发明的上下文中可以使用任何用于阻断生物质的生长的装置。所述生物质在阻断时的浓度可等于1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l或5g/l。

生物质的密度/浓度能通过多种方法进行测量。

-透明度测定盘(secchidisk)：其是一种可以快速估测在水生培养基中培养的细胞的密度的简单装置。其由长30cm的刻度尺组成，在下端零点位置配备有直径为5cm的白盘。一旦浸没在培养基中不再能够分辨出盘，记录从该点开始的深度(用厘米表示)。

-在显微镜下计数。这种方法耗时，但是其能够估测丝体数量和每根丝体的圈数。通过校准移液管，将一滴样品沉积在凹玻片上以便在显微镜下对其进行观察；评价该滴中的丝体数量，已知来自我们移液管的17滴表示1ml体积。如果培养物非常浓，则对样品进行稀释。对随机取用的30根丝体计算平均圈数。

-665nm下的光密度。这种方法使其能够采用665nm(叶绿素吸收波长之一)下的吸光度来快速估测生物质。这种体内吸收通常与叶绿素浓度具有良好的相关性。使用配有具有平行面的25cl比色皿的分光光度计。针对尚未进行接种的培养基进行归零。

诱导罐可以是中间培养罐或回收罐，或任何其他用于储存活微藻的密封罐。

在本发明的一个优选实施方式中，所述生物质在诱导罐中的浓度在基本上大于或等于1g/l的值至基本上小于或等于5g/l的值之间。这种浓度通过向诱导罐添加诱导培养基来获得。

1g/l至5g/l的浓度对应于比收集时(即最佳生长时，此时浓度为大约0.4g/l)生长的生物质密度大3至13倍的密度。在该浓度下，阻断生长以促进微藻的防御代谢。

通过例如通过过滤、滗析或离心使所述生物质达到1g/l至5g/l的浓度，能阻断生物质例如在最佳生长下、特别是在大约0.4g/l的浓度下的生长。

在将生物质沉积在诱导罐中之前也可以对生物质进行洗涤。洗涤使其能够去除来源于培养基的多余的盐。这因此允许更好地控制诱导溶液的氮浓度。

在这种情况中，使用生理水或新鲜制备的诱导培养基溶液洗涤生物质3次。

在这些情况下，初始生物质不受方法的影响并且藻蓝蛋白合成的诱导不依赖于生物质培养条件。

该程序具有能够容易地整合到传统螺旋藻养殖场的生长线中的优点。其可以在中间培养罐或回收罐中应用持续3小时、4小时或直到5小时。

在本发明的一个具体实施方式中，诱导藻胆蛋白合成的步骤包括：

1)使光合微藻的生物质暴露于光通量，所述通量具有从基本上大于或等于10μmolm^-2s^-1的值到基本上小于或等于13μmolm^-2s^-1的值的光密度；

2)添加氮源以便在诱导培养基中获得大于2.5g/l的nano3浓度。

例如，使用测量对光合有效的照射的光度计来测定以μmol光子每平方米每秒计的光强度。

应当注意，10μmolm^-2s^-1对应于330lux，13μmolm^-2s^-1对应于429lux，特别是采用借助于荧光管(例如“植物生长荧光”型)照明时。在这种情况下，1μmol光子每平方米每秒等于33lux。

诱导培养基中的nano3浓度特别是3至4g/l或3至5g/l。

10至13微摩尔m^-2s^-1(μmolm^-2s^-1)范围内的光强度和含3至5g/lnano3的培养溶液(作为氮源)的组合使其能够获得含20％至25％藻蓝蛋白的生物质，这与在未应用本发明方法下进行的实验中获得的3％至12％范围相比是特别高的。

光能够通过简单的40w功率白炽灯泡或通过荧光管来提供。

优选的诱导溶液由zarrouk培养基组成，但能使用任何其他适合于螺旋藻的培养基。在任何事件中，通过添加过量的硝酸钠(nano3)来改变诱导溶液的氮浓度。最终浓度必须包括在3至5g/lnano3的范围内，这表示比在初始zarrouk培养基中存在的浓度(2.5g/lnano3)大1.2至2倍的浓度。

在上文定义的培养条件下，培养步骤进行3小时、4小时或直至5小时，并足以诱导稳定含量的藻胆蛋白合成，该稳定含量为干生物质的20％至25％。

用于制备具有至少等于所述生物质干重的20％的藻胆蛋白含量的光合微藻生物质的本发明方法包括阻断生物质生长的步骤和诱导藻胆蛋白合成的步骤。

根据一个有利的实施方式，生物质具有至少等于所述生物质干重的21％、22％、23％、24％或25％的藻胆蛋白含量。

根据一个有利的实施方式，生物质具有包括所述生物质干重的20％至25％的藻胆蛋白含量。

在一个具体实施方式中，诱导藻胆蛋白合成的步骤之前可以是收集微藻生物质的步骤。当培养物处于指数生长期时，即当生物质生产率最大时，将生物质收集在通常的培养罐中。通过纱布(或通过滗析或通过离心)过滤回收的体积，以便获得新鲜生物质。将获得的生物质转移到诱导罐中。

本发明的方法还可以包括最后的收集富集的生物质的步骤。

本发明的方法因此可以包括以下步骤：

-a)收集微藻生物质，

-b)阻断所述生物质的生长，

-c)诱导藻胆蛋白合成，

-d)收集所述的富含藻胆蛋白的生物质。

本发明的方法使用选自蓝细菌、红藻门植物或隐芽植物的光合微藻。

优选地，用于实施本发明方法的光合微藻是钝顶螺旋藻，也被称为螺旋藻。

所述光合微藻特别是选自红藻纲、隐藻纲和蓝细菌，更特别是蓝细菌，甚至更特别是钝顶螺旋藻和水华束丝藻，特别是克拉马斯海藻。

本发明还保护通过如前文所描述的方法获得的粉末形式或悬浮液形式的稳定的藻胆蛋白沉淀物。根据本发明的澄清的且稳定的藻胆蛋白实际上能用于化妆品领域和营养品、食品加工或药物制剂中的任何应用形式(粉末、液体或半液体)。

通过本发明的方法使用水杨酸沉淀的藻胆蛋白，不论它们是否预先通过滗析步骤进行澄清，均能在40℃下烘干或冻干，从而改善稳定性并增加保存期限。它们能直接并入到用于任何食品加工、治疗、化妆品或药物应用的任何粉末状产品。

根据本发明的方法通过用甘油溶解和稳定的沉淀物能例如直接包装在小瓶中或被并入任何液体或粘性应用，作为用于食品、化妆品或药物制剂的添加剂、染料和活性成分。

为粉末或者为甘油溶液的两种形式的藻胆蛋白额外含有相关蛋白质、用于初始提取的cacl2盐的残留物和用于沉淀的水杨酸的残留物。这些成分全都是食物产品，其不以任何方式损害该产物在任何食品、化妆品或药物应用中的使用。

在一个变体方式中，可以通过在沉淀物溶解于甘油之前用蒸馏水洗涤沉淀物来减少盐和水杨酸含量。这种洗涤对于不耐受任何过量存在的水杨酸的应用而言是优选的。

本发明还涉及作为新产品的在沉淀和/或澄清步骤结束时获得的上清液。这种溶液含有未沉淀的藻胆蛋白和碎片部分。而且，其富含水溶性蛋白质、微量元素和一定量的溶解的水杨酸。其形成富含活性成分的组合物，能用于任何液体形式的食物和/或化妆品产品。

本发明还涵盖可以通过本发明方法获得的粉末形式或悬浮液形式的完全不含膜碎片的富含藻胆蛋白的稳定沉淀物。

最后，本发明保护含有所述的富含藻胆蛋白的稳定沉淀物或富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的混合物的化妆品或营养品组合物，不论它们是粉末、片剂或凝胶胶囊形式还是液体或粘稠形式(如霜剂、凝胶剂或糊剂)的组合物。

本发明的化妆品组合物具有强抗皱性质，这使其能够对抗深层皱纹、皮肤松弛和肤色暗淡。

本发明的化妆品化合物富含抗氧化化合物。其抵抗自由基并刺激细胞充氧。经连续施用，重塑脸部轮廓，减少深层皱纹并使肤色更均匀。本发明的化妆品组合物还可以减少眼睛下方的眼袋和黑眼圈并防止脱水以更舒适。

本发明的化妆品还具有抗斑纹(anti-mark)作用并刺激细胞解毒，避免太阳和污染的影响，并提高对抗特征在于过量黑色素的斑纹的能力。

根据斑纹的强度，每日二至四次施用是必要的。轻的和弥散性斑纹在几周内消失，而有清晰轮廓的深斑纹可能需要6至12个月才能完全消失。本发明的化妆品或皮肤病组合物也被推荐用于重痤疮爆发留下的残留斑纹。而且，其对柔软皮肤具有保湿作用。

本发明还涉及皮肤病组合物，其含有作为活性物质的如先前所定义的所述富含藻胆蛋白的稳定沉淀物或富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的混合物，以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及如先前所定义的富含藻胆蛋白的稳定沉淀物或富含藻胆蛋白的稳定沉淀物的混合物作为抗氧化剂的用途。

附图说明

图1表示溶解的藻胆蛋白随着温度(temp，用℃表示)和光强度强度(lum，用μmol光子/m²/s表示)的变化的等半衰期(iso-half-life)曲线。

图2表示藻胆蛋白(phy)和碎片(frag)的沉淀程度随水杨酸浓度(g/l)的变化。

图3表示沉淀物的澄清度随碎片浓度(g/l)和藻胆蛋白初始浓度的变化。水杨酸含量为13g/l。

实施例

实施例1：用水杨酸沉淀

将本发明的方法分成两个基本步骤：

1)将商品级粉末状水杨酸添加至藻胆蛋白提取物。搅拌溶液(水杨酸+提取物)15分钟。该步骤可以使溶液均质化并促进使酸与溶液中的藻胆蛋白分子接触。

将溶液置于分液漏斗中。在至多1小时后，几乎全部的藻胆蛋白(超过90％)沉淀。用于1小时后沉淀几乎全部的藻胆蛋白所需要的水杨酸的量取决于藻胆蛋白在初始提取物中的量。本发明建立了以下方程式，该方程式使其能够测定对于初始提取物中任何量的可溶性藻胆蛋白使用的水杨酸的最小量：

水杨酸(g)＝0.007×藻胆蛋白(mg)/0.52

对于需要较高纯度藻胆蛋白的用途，本发明显示当应用使用水杨酸的选择性沉淀时，使藻胆蛋白提取物澄清。在使其能够从提取物中去除可滗析的残余物的滗析步骤之后使用澄清。因此其目的在于分离藻胆蛋白与滗析后保留在悬浮液中的细膜颗粒。

采用通过纱布或滤纸的粗过滤方式或简单地采用从分液漏斗顶部倒出上清液的方式回收通过滗析可能澄清的沉淀的藻胆蛋白。

2)将通过滗析可能澄清的沉淀的藻胆蛋白溶解于甘油中。本发明测定1.2l甘油足以溶解27g沉淀的藻胆蛋白。溶解产率为95％至99％。应当指出，在甘油中未溶解的部分能在无水乙醇中回收。

实施例2：研究根据本发明的方法用水杨酸沉淀且重新溶解于甘油中的藻胆蛋白的半衰期随温度和光强度的变化。

术语“半衰期”(y)表示导致一半的藻胆蛋白降解的天数。

研究的温度范围为20至60℃，研究的光强度范围为50至150μmol光子/m²/s。

进行11个实验，其中8个表示对应于两个因素的三个水平之间的组合。其余3个表示中心点并使其能够评价实验误差。

提出的数学模型是：

log10y＝4-0.08temp-0.013×lum+0.0005×temp²+0.0002×temp×lum。

该模型有效性为94％，相关系数r²＝98％，并且在95％是可预测的(q)。

通过等半衰期曲线(isohalf-lifecurve)(图1)给出藻胆蛋白半衰期根据温度和光条件的变化(用天数表示)。

在低于20℃的温度和低于50μmol光子/m²/s的光强度下，用水杨酸沉淀且重新溶解于甘油中的藻胆蛋白的半衰期能超过110天。

通过在研究范围外预测，使其能够估计在4℃和全暗的储存条件下时，稳定的藻胆蛋白的半衰期为11年。

在相同的温度(20℃)和光度(50μmol光子/m²/s)条件下，稳定性试验表明对于未经处理的水提物(即尚未对其进行基于添加水杨酸和/或甘油的本发明方法的水提物)而言，全部的藻胆蛋白在12小时后降解。对于用水杨酸沉淀和稳定但未重新溶解于甘油中的粉末状藻胆蛋白而言，在孵育超过2个月后降解未超过10％。

对于溶解于甘油中但未用根据本发明的方法用水杨酸沉淀的水提物而言，在孵育1个月后降解为50％。

用水杨酸沉淀且溶解于甘油中的水提物显示出更好的稳定性。

实施例3

尝试通过用水杨酸选择性沉淀来澄清提取的藻胆蛋白。能从干的或新鲜的螺旋藻生物质进行提取。

使用13g干螺旋藻(或130g新鲜的螺旋藻)，混悬于0.2l无菌海水中，充分均质化。

将整个混合物在-4℃下冷冻过夜。使其在0.4l无菌海水中解冻，并在冷条件下搅拌2小时。进行第二次冷冻-解冻，之后在0.4l无菌海水中解冻并在冷条件下搅拌2小时。

将获得的悬浮液转移至滗析容器中，在冷条件下过夜，以便使提取物的水相与可滗析的生物质分离。

估测藻胆蛋白的提取率为螺旋藻干重的12-15％。

基于在620nm和650nm下的光密度并应用bryant等人(1976)的公式估算藻胆蛋白含量。通过根据建立的使od680与干螺旋藻生物质关联的相关曲线测量680nm下的光密度来评估碎片含量。

因此评估的提取物的藻胆蛋白含量为1.5g/l海水。

评估碎片和膜元件的含量为1.9g/l。

在连续搅拌下间歇性地添加1至2g粉末状水杨酸。

在每次添加时，使溶液静置2小时，在该时间之后藻胆蛋白沉淀。然后评估溶液中藻胆蛋白和碎片的量以便测定沉淀程度。

沉淀程度的结果在图2中显示。

表明对于小于12-13g/l的水杨酸浓度其能够获得100％的澄清沉淀物。

对于添加13g/l的水杨酸，因此获得的沉淀且完全澄清的藻胆蛋白的最大收率为70％。

全部的膜碎片和复合物保留在上清液中并且仅在高水杨酸浓度下才沉淀。

实施例4：沉淀的藻胆蛋白的澄清度水平的变化

对于在(通过多种稀释和离心获得的)提取物中的多种初始藻胆蛋白和碎片浓度以及对于多种水杨酸浓度，研究沉淀的藻胆蛋白的澄清度水平的变化。

根据实验设计方法学，通过具有相互作用的三个水平的全因素设计来进行研究。因素为：提取物的初始藻胆蛋白浓度，范围为0.3至1.52g/l；范围为0.7至1.9g/l的碎片浓度和范围为10至20g/l的水杨酸浓度。

该模型给出的实验矩阵由代表对应于三个因素的三个水平(最小值、最大值和中心值)之间的组合的15个实验组成。对同一组合进行三次重复使其能够评估实验误差。

添加水杨酸后，通过分光光度法对于每个实验单独测定未沉淀的藻胆蛋白和碎片的量。由此推导出沉淀的藻胆蛋白和碎片的含量。计算澄清度。

“澄清度”表示为澄清度＝100×沉淀的藻胆蛋白的量/沉淀的藻胆蛋白+碎片的量。

该模型使其能够绘制等澄清度曲线(iso-claritycurves)，在图3中示出。

表明仅对于大于1.5g/l的藻胆蛋白浓度和小于0.9g/l的碎片含量，能够获得100％的完全澄清水平。在这些条件下完全澄清所需的水杨酸含量为小于13g/l。

实施例5：抗皱霜剂

获得具有以下组成的抗皱霜剂：

水：59％，

甜杏仁油：18％，

溶解于甘油中的稳定的富含藻胆蛋白的沉淀物：7％，

棕榈油：5％，蓖麻油：3％，

藻类提取物：3％(β-葫萝卜素)，

蜂蜡：2％，

黄原胶：1.7％，

芳香剂：1％，

对羟基苯甲酸乙酯：0.1％，对羟基苯甲酸甲酯：0.1％，对羟基苯甲酸苄酯：0.1％。

实施例6：抗斑纹霜剂

获得具有以下组成的抗斑纹霜剂：

抗斑纹霜剂：

水：59％，

甜杏仁油：19.5％，

溶解于甘油中的稳定的富含藻胆蛋白的沉淀物：7％，

棕榈油：5％，蓖麻油：3％，

藻类提取物：1.5％(β-葫萝卜素)，

蜂蜡：2％，

黄原胶：1.7％，

芳香剂：1％，

对羟基苯甲酸乙酯：0.1％，对羟基苯甲酸甲酯：0.1％，对羟基苯甲酸苄酯：0.1％。

参考文献

arad和ai.,1997.coloringmaterial.us专利us/5,643,585。

bryantd.a.,glazer,a.n.和eiserlingf.a.,1976.characterisationandstructuralpropertiesofthemajorbiliproteinsofanabaenasp.arch.microbiol,110,61-75。

costajav,collalm,duartefilhopf,kabkek,webera.,2002.modellingofspirulinaplatensisgrowthinfreshwaterusingresponsesurfacemethodology.worldjmicrobiolbiotechnol18:603-607。

minard.f.,2005.methodforthephotostabilisationofphycobiliproteinsinanaqueousextract,compositionscontainingstabilisedphycobiliproteinsanduseofstabilisedphycobiliproteins.专利号wo2005065697a1。

rebellerm.youtp和lonchampd.,1979.procédéd'extractionselectivedescolorantscontenusdanslesalguescyanophycées.(由institutdupétrole在c09b61/00分类下提交的专利)。

frédéricpottecher,2014.procédéd'extractionetdestabilisationdephycocyanineetsesapplication.wo2014045177a1.由ecosystem提交的专利。