以血红蛋白类载氧体为基础的无基质人脐带血红蛋白的制备的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及利用q300阴离子交换层析的方法对对人脐带血血红蛋白的分离纯化，利用sds-page、hplc、氧合度测定等方法检测纯化效果，最终制备出了一种安全的以血红蛋白类载氧体的无基质人脐带血血红蛋白。

(二)

背景技术：

输血一直是战争、疾病、自然灾害以及外科手术中重要的治疗手段。尤其是在某些紧急的情况下，如外科手术、失血性休克、体外循环、机体缺血和再灌注、器官保存和血液中病毒性疾病，其作用显得尤为重要且无可替代。但是基于我国人口众多、人口的老龄化的基本国情，以及外科手术在数量和复杂程度方面的不断增加，而献血人员严重不足，导致血液供给量日益突出。特别是当遇到地震、台风等意外自然灾害时，血液的需求量也因此大大增加。在实际应用总是存在各种问题，如(1)血液的来源不足，有效的保存时期短；(2)输血前的准备工作烦琐费时，包括严格的血型鉴定和交叉配型；(3)输血过程中可能存在传染性疾病传播隐患，如乙型、丙型肝炎和hiv等。因此需要开发出一种具有携带o2功能，并根据体内氧分压的高低进行可逆地结合与分离o2，替代人体血液的溶液。应对这些问题，使得血液代用品的研究开始逐步展开。

优良的血液代用品应具有以下特点：(1)可以有效地进行o2和co2交换；(2)在体内半衰期时间足够长；(3)容易代谢和排出体外，且对人体组织及各脏器功能无损害；(4)渗透压和黏度适宜，能够在血管中进行正常的流动与输送氧气；(5)没有免疫源性，方便在临床试验前进行消毒和灭菌处理；(6)产品稳定性强，能够用于大规模工业生产；(7)室温下保持稳定，能够长期保存。血红蛋白的一个重要功能就是在机体内携带和运输氧气，维持机体正常的生理代谢。因此以血红蛋白作为原料的血红蛋白类载氧体(hemoglobin-basedoxygencarriers，hbocs)是一种安全有效且可实现的载氧方式。

然而，由于血红蛋白的纯度不够，受杂蛋白的影响在血液的再灌注中将对人体的肾，肝，脑产生毒性；影响心血管活性及其他一些免疫疾病。因此，血红蛋白的纯度将直接影响以无基质血红蛋白为基础的血液代用品的质量安全。无基质血红蛋白溶液的纯度必须达到99％，且必须严格高铁血红蛋白的含量。基于这些要求，大量的分离纯化研究均未能达到理想的要求。就血源来讲，因人脐带血具备2，3-dpg别构调节作用，所以我们选则人脐带血作为原料来进行分离纯化工作。

随着以血红蛋白(hb)为基础的载氧体(hemoglobinbasedoxygencarriers，hbocs)的血液代用品的研究不断深化并逐步实现产业化，使得人们对hb的需求量也大大增加。这对作为重要原料的血红蛋白(hb)的纯度和质量提出了更高的要求，其质量将直接影响血红蛋白类血液代用品的好坏与否。衡量血液代用品的重要指标包括：(1)hb的纯度，hb的纯度将直接决定血代品的质量。如若hb的纯度不高，其中有杂蛋白的影响，在血液的再灌注中将对人体的肾，肝，脑产生毒性；影响心血管活性及其他一些免疫疾病；(2)高铁血红蛋白含量，高铁血红蛋白的含量高低将直接决定血红蛋白是否具有载氧能力。hb是有4个亚基和4个卟啉环的复杂蛋白质，在脱离红细胞后容易解聚成为αβ二聚体，同时卟啉环中的二价铁容易氧化成三价铁，使hb变为无载氧活性的methb；(3)氧结合能力，制品的氧结合力有多强，才能有效的向组织供氧。现在进入临床的制品，其氧结合力多与红细胞中的血红蛋白相近(p50值约为26mmhg)。

通常文献中介绍的血红蛋白的分离纯化主要包括4个步骤：血液的前处理；粗提；分离纯化；纯度鉴定。首先用生理盐水或四氯化碳洗涤压积红细胞释放血红蛋白分子，离心收集血红蛋白溶液；其次通过过滤或离心除去小分子杂志和残留的细胞膜；然后通过高效液相法后凝胶柱层析法等手段去除磷脂及其他杂蛋白；最后对纯化样品进行纯度检测。

无基质血红蛋白制备方法有：1.有机溶剂萃取法：主要过程是洗涤红细胞，四氯化碳萃取液萃取得到粗提的血红蛋白液，然后将粗提液经不同等级的膜过滤，再经微滤膜过滤除菌。此方法得到的血红蛋白具有较高的血红蛋白回收率及红细胞破膜率。2.co饱和提取法：首先为防止在纯化过程中高铁血红蛋白的产生，在红细胞内通入过量的co气体，将红细胞羰基化。向红细胞中加入有机溶剂破膜、离心得到无基质血红蛋白，产物经60℃加热，离心去除沉淀即为纯化的hbco。最后，将得到的hbco通入纯o2，使得纯化的hbco转化为hbo2。此方法，虽能得到较纯的血红蛋白，但很难将hbco全部转化为hbo2。3.硫酸铵分级沉淀血红蛋白法：将压积红细胞装入透析袋，用tris缓冲液透析破碎，破碎的上清经两级硫酸铵沉淀后透析至上样缓冲体系，离心后取上清即得血红蛋白提取液；红细胞提取液通过qsapharosefastflow阴离子交换柱层析进一步分离，计算回收率。通过此方法可以得到纯度较高的血红蛋白液，纯化效果较好，但在控制纯化过程中高铁血红蛋白的上升仍存在问题。4.切向流过滤法纯化血红蛋白：用4％的柠檬酸洗涤红细胞，0.9％nacl溶解红细胞，离心得到溶解液，经三级过滤来纯化血红蛋白。首先将溶解液通过一个玻璃棉列装置过滤大分子残片，然后将滤液分别循环式通过截留分子量为50nm，500kda，100kda高频膜。此方法采用循环式的过滤方法，得到的血红蛋白的纯度较高，缺点是此方法的纯化步骤较多且所需的设备成本较高。

以上方法就是从全血中提取分离血红蛋白制备无基质血红蛋白的常用方法，都分离得到hb，对以血红蛋白为基础的血液代用品的研究做出了贡献。但有的工艺过程复杂，设备成本较高；有的在分离过程中还加入了有机溶剂等，对血红蛋白的结构和性能都可能产生不小的影响；有的所需的纯化时间较长，不利于进行大规模分离提取。因此，我们选用离子交换层析法来分离血红蛋白。本实验以q300阴离子交换树脂作为填料，因其具有离子强度高，极性大，分离效果好等优点，建立了一种更加安全，高效且纯化度较高的无基质血红蛋白的制备方法。

(三)

技术实现要素：

利用q300阴离子交换层析的方法对对人脐带血血红蛋白的分离纯化，最终制备出了一种安全的以血红蛋白类载氧体的无基质人脐带血血红蛋白。

本专利的实施方案如下：

其步骤包括：

用0.9％生理盐水洗涤脐带血，经蒸馏水进行粗提。用q300阴离子交换纯化血红蛋白，对纯化后的血红蛋白进行浓缩，得到终产品。测定血红蛋白浓度及高铁血红蛋白含量，并用sds-page和hplc进行纯度分析，通过血样分析仪进行氧饱和曲线分析。

具体实施方式

脐带血血红蛋白(hb)的提取：取新鲜脐带血于4℃以3000rpm/min离心15min。将所得压积红细胞用0.9％生理盐水洗涤离心三次(生理盐水的用量为红细胞体积的3倍)。向压积红细胞加入3倍体积的纯水溶解，冰水浴下破膜30min，进一步以16000rpm/min，4℃下离心1.5h，上层澄清红色液体，即为血红蛋白溶液(sfhb)，吸出，备用，4℃下液氮封存。

分子筛q300柱层析法纯化hb：凝胶柱准备：取q300凝胶粒子溶入冷的去离子水中，轻轻搅拌使离子均匀一致，静置20min，弃去上层清液，重复数次即可。处理好的填料灌入玻璃层析柱(300mm×100mm)。分别用2倍柱体积的20％bufferb和100％b溶液清洗柱子，然后用8倍柱体积20％bufferb平衡柱子，流速为10ml/min，柱温4℃。上样与洗脱：将上述制备的血红蛋白(2g)溶于20ml的20％bufferb缓冲液中进行上样。分别用40％bufferb、60％bufferb、80％bufferb、100％bufferb的缓冲液以10ml/min的流速进行梯度洗脱，2.5h即可洗脱完成。待洗脱液的吸收峰峰达到最高时，收集洗脱液，分装2管，每管约10ml，并将洗脱液浓缩(以上纯化实验均在冷冻层析柜中进行)，并对浓缩液进行纯度等指标检测。hb浓度的测定；高铁血红蛋白(methb)含量测定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：将洗脱峰收集样本(2管)经10％sds-page电泳，另加纯化前的脐带血血红蛋白作为鉴别对照。分离胶浓度为12.5％，用ph8.8的tris1.5mol/lhcl缓冲液配制。浓缩胶浓度为5％，用ph6.8的tris1.0mol/lhcl缓冲液配制。电泳缓冲液为ph8.39的tris-gly缓冲体系，120v电泳4h。凝胶用硝酸银染色。用灰度扫描仪进行扫描测定纯度。

hplc分析：采用zenixsec-300的凝胶柱(21.2mm×300mm)，0.2mpbs缓冲溶液作为流动相，检测波长为280nm，流速为0.500ml/min，上样量为20μl，分别对纯化前后hb溶液进行检测，确定纯化hb纯度。

氧饱和曲线测定：使用血样分析仪在37℃下检测，检测浓度为11.5g/l。

(四)附图说明

图1sds-page对比扫描图

图2hb样品hplc图

图3hb样品氧饱和曲线图。