棉铃虫P糖蛋白基因及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及RNA干扰技术领域，具体地说，涉及棉铃虫P糖蛋白基因及其应用。

背景技术：

在世界农业发展史上，化学杀虫剂的发明和使用极大推动了农业的发展。然而，大量投入化学杀虫剂对环境以及高等动物的危害也不可忽视，一方面带来了严重的环境污染并成为重要的疾病诱导剂，导致不可逆的和有害的遗传修饰；另一方面也导致这些生物产生很强的抗药性。植物次生物质具有对病虫草害防治效果好，且对人畜安全，不污染环境，无残留，对病虫草害特异性强，源于自然，易被降解，害虫和病菌难以产生抗药性等优点；生物农药也具有针对性强，对人畜安全，对生态环境影响小等优点。这两类杀虫剂均符合目前倡导的绿色有机农业的要求，在绿色有机农业生产中扮演着重要角色。

植物次生性物质是植物在代谢过程中形成的产物，是植物自卫的武器，植物通过次生物质影响昆虫的取食，形成忌避或影响昆虫的消化来保护自己，植物次生性物质对昆虫的寄主选择、取食及生长发育具有重要的影响。植物通过自身所含营养成分的质和量以及种类繁多的次生代谢产物来影响植食性昆虫对寄主的趋性取食活动进而影响昆虫的生长发育和繁殖造成昆虫种群的波动。昆虫在长期的进化过程中，为了应对来自外界有害因子的危害也进化出了复杂的解毒代谢系统来弱化植物次生物质及其他有害物质的危害。其中P糖蛋白就是一类依赖ATP水解能量将与之结合的有害物质转运出细胞膜的跨膜转运蛋白，这也是棉铃虫产生抗药性的重要原因之一。植物次生物质对昆虫的影响及昆虫对其适应反映了植物与昆虫的协同进化。生物农药是利用生物活体(真菌、细菌、昆虫病毒、天敌等)或其代谢产物研制而成的针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，其均来自天然的化学物质和生命体，对人畜和环境安全，在目前倡导的绿色有机农业生产中同样也发挥着重要作用。利用分子生物学手段干扰昆虫潜在的防御基因，从而提高昆虫对植物次生性物质和生物农药的敏感性，对制定新的抗药性综合治理策略具有深远的意义。

RNA干扰(RNAi)技术提供了用于控制基因表达的潜在的工具，因为其能特异性靶向选择，并且以显著高的效率进行靶向mRNA抑制。基于RNA干扰技术开发新的靶标已经被应用于害虫防治。

技术实现要素：

本发明的目的是提供棉铃虫P糖蛋白及编码该蛋白的基因。

本发明的另一目的是提供棉铃虫P糖蛋白基因的应用，即以该基因为靶点，开发基因的抑制剂用于害虫防治。

为了实现本发明目的，本发明提供的棉铃虫P糖蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码棉铃虫P糖蛋白的基因HaPgp1。基因HaPgp1是通过提取棉铃虫总RNA，反转录得cDNA，以cDNA为模板，根据NCBI(GenBank:KC713821.1)中公布的411bp序列设计引物F1和R1(SEQ ID NO:4-5)，PCR扩增得到棉铃虫P糖蛋白基因部分序列，然后利用cDNA末端快速克隆技术(RACE技术)得到棉铃虫P糖蛋白基因cDNA序列全长(SEQ ID NO:2)。

本发明还提供含有基因HaPgp1的载体、工程菌或转基因细胞系。

本发明还提供基因HaPgp1在制备杀虫剂中的应用，以基因HaPgp1作为靶点，开发基因HaPgp1的抑制剂作为杀虫剂的有效成分。

本发明还提供一种杀虫剂，其有效成分为基因HaPgp1的抑制剂。

本发明所述抑制剂为dsRNA、shRNA、siRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体等中的至少一种。

优选地，所述抑制剂为dsRNA，其序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明所述抑制剂的有效成分中还包括植物次生性物质和/或生物农药等。其中，所述植物次生性物质包括但不限于2-十三烷酮；所述生物农药包括但不限于阿维菌素。

本发明进一步提供所述杀虫剂在棉铃虫防治中的应用。

本发明首次克隆获得了棉铃虫P糖蛋白基因HaPgp1。以基因HaPgp1为靶点，基于RNA干扰技术，设计并合成的dsRNA序列能够用于干扰棉铃虫P糖蛋白基因的表达，使棉铃虫降低对杀虫药剂的代谢能力，从而增强了昆虫对植物次生性物质和生物农药的敏感性，提高了杀虫药剂的控害效果，同时对于解决由于化学杀虫剂导致的生态恶化以及杀虫剂抗性等问题具有积极意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中棉铃虫P糖蛋白基因HaPgp1的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，M为DNA Marker，1为目的片段。

图2为本发明实施例2中饲喂棉铃虫P糖蛋白基因dsRNA后，棉铃虫P糖蛋白基因在不同时间的表达量。

图3为本发明实施例3中饲喂棉铃虫P糖蛋白基因dsRNA后，用2-十三烷酮和阿维菌素药剂处理的棉铃虫幼虫的死亡率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 棉铃虫P糖蛋白基因HaPgp1全长序列的克隆

提取棉铃虫总RNA，反转录得cDNA，以cDNA为模板，根据NCBI(GenBank:KC713821.1)中公布的411bp序列设计引物F1和R1，PCR扩增得到棉铃虫P糖蛋白基因部分序列，然后通过cDNA末端快速克隆技术(RACE技术)利用5’-Full RACE Kit和3’-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase(购自TaKaRa)，分别按5’RACE和3’RACE试剂盒说明操作，获得棉铃虫P糖蛋白基因cDNA序列全长(SEQ ID NO:2)；再以cDNA为模板，设计全长引物F2和R2扩增出约3800bp大小的条带，1％琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，并进行切胶回收。回收片段与pEASY^TM-Blunt zero Cloning Vector载体连接得到重组质粒Blunt zero-HaPgp1，并测序。

表1 扩增棉铃虫P糖蛋白基因使用的引物

棉铃虫P糖蛋白基因HaPgp1的cDNA序列全长为3801bp，编码分子量大小约140KDa的蛋白(SEQ ID NO:1)。棉铃虫P糖蛋白包含四个核心区域：两个疏水的跨膜结构域和两个核苷酸结合域。在P糖蛋白的三维结构中，两个疏水的跨膜结构域互相接近，形成底物分子结合和外排的通道；两个核苷酸结合域相互接近，形成ATP结合和水解释放能量的区域。

实施例2 棉铃虫HaPgp1基因dsRNA的合成

根据实施例1克隆获得的棉铃虫HaPgp1基因中的一段长度为282bp的序列(SEQ ID NO:3)，设计HaPgp1基因的dsRNA，通过体外转录试剂合成dsRNA后与棉铃虫人工饲料混合饲喂2龄棉铃虫幼虫。

具体地，通过MEGAscript T7 transcription kit，设计引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGGACGTCATTGATGGCAGTGT-3′和5′-TAATACGACTCACTATAGGGACGCTGTTTCTGACCTCCTG-3′(SEQ ID NO:9和10)，通过体外转录得到HaPgp1基因的dsRNA。将dsRNA与棉铃虫人工饲料混合(35μg/g)，饲喂2龄幼虫，利用荧光定量PCR检测饲喂后12h、24h、36h及48h时HaPgp1基因的表达，发现12h的干扰效果最佳，此时能够高效沉默棉铃虫P糖蛋白基因的表达，具有较好的靶基因沉默效果(图2)。

所述dsRNA的序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例3 HaPgp1基因的dsRNA能够提高棉铃虫对植物次生物质2-十三烷酮和阿维菌素的敏感性

将实施例2中体外合成的dsRNA与人工饲料混合(35μg/g)，饲喂棉铃虫2龄幼虫，同时用2-十三烷酮和阿维菌素药剂处理棉铃虫，考察棉铃虫对2-十三烷酮和阿维菌素的敏感性。

具体地，处理组用浓度为35μg/g的HaPgp1 dsRNA处理25头棉铃虫2龄幼虫12h，再用0.1mg/g 2-十三烷酮和0.4μg/g阿维菌素药剂处理上述棉铃虫，其中，以饲喂GFP dsRNA作为对照组，DEPC水处理作为阴性对照，试验重复四次。分别记录对照组与处理组棉铃虫的死亡率作为判断HaPgp1 dsRNA是否能够提高棉铃虫对植物次生物质2-十三烷酮和生物农药阿维菌素的敏感性的标准。结果显示，饲喂棉铃虫P糖蛋白dsRNA的处理组，用2-十三烷酮处理后死亡率比dsGFP对照组升高了59％，同样用阿维菌素处理后，饲喂棉铃虫P糖蛋白dsRNA的处理组比对照组死亡率升高了58％。因此，HaPgp1 dsRNA组相比于对照处理12h后显著增加了棉铃虫死亡率(图3)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。