技术领域本发明属于生物医药领域，涉及胞磷胆碱钠的新用途，具体涉及一种胞磷胆碱钠的药物组合物及其防治卵巢癌的医药用途。
背景技术：
胞磷胆碱钠用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍，对脑中风所致的偏瘫可逐渐恢复四肢的功能，也可用于其他中枢神经系统急性损伤引起的功能和意识障碍，也用于缺血性脑血管病和血管性痴呆。胞磷胆碱钠通过降低脑血管阻力，增加脑血流来促进脑物质代谢，改善脑循环。也可增强脑干上行网状激活系统的机能，增强椎体系统的功能，改善运动麻痹，故对促进大脑功能的恢复和促进苏醒有一定作用。注入胞磷胆碱钠注射液后可迅速进入血液，有部分通过血脑屏障进入脑组织，胆碱部分在体内成为良好的甲基化供体，可对多种化合物有转甲基化作用，约1％的胆碱从尿排出。目前随着社会的发展，人类各种肿瘤的发病率都较前有所上升，给肿瘤患者及其家人带来极大的痛苦，因此肿瘤的研究与防治在医学领域占有极其重要的位置。正是因卵巢恶性肿瘤的特殊的生物学行为，造成患者就诊时多数已属晚期，且发病率呈逐年上升趋势，极大地威胁着人类女性的健康。妇科肿瘤为妇科疾病的一部分，而妇科恶性肿瘤如卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌严重危及着妇女的生命。近年来各种因素导致卵巢癌的发病率呈上升趋势，在我国发病率排在宫颈癌、子宫体癌之后，而在美国仅次于宫体癌。卵巢恶性肿瘤约占女性恶性肿瘤的占妇科恶性肿瘤的。因其解剖位置较深，起病隐匿，又无明显的早期自觉临床症状及有效的筛査方法和措施，一旦发病则发展迅速约的患者在出诊时己属晚期，并且己经发生转移死亡率及复发率均较高。临床上常见的卵巢癌患者在剖腹探査时，术中可以发现病灶局限在卵巢的约占，大多数已经向盆、腹腔其它脏器转移，常见子宫、双附件、大网膜等，而患者的五年生存率才。目前临床上卵巢癌的治疗方法为肿瘤细胞减灭术化疗、放疗，根据患者的病情可以给予术前后化疗，因此化疗在晚期卵巢癌患者的治疗中占有重要位置，但是由于肿瘤细胞化疗耐药性及化疗的毒副作用影响了化疗的总体效果，因此卵巢癌患者对化疗药物的耐药成为化疗治疗的最大障碍。迄今为止，尚未见胞磷胆碱钠及其药物组合物与卵巢癌防治的相关性报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种胞磷胆碱钠的药物组合物，该药物组合物中含有胞磷胆碱钠和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，胞磷胆碱钠和该天然产物可以协同防治卵巢癌，用于开发成防治卵巢癌的药物。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，一种胞磷胆碱钠的药物组合物，包括胞磷胆碱钠、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将远志的干燥根粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。进一步地，步骤(a)用80％乙醇热回流提取，合并提取液。进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。如上所述的化合物(Ⅰ)在制备防治卵巢癌的药物中的应用。如上所述的胞磷胆碱钠的药物组合物在制备防治卵巢癌的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的胞磷胆碱钠的药物组合物中含有胞磷胆碱钠和一种从远志中分离得到的结构新颖的天然产物，胞磷胆碱钠和该天然产物单独作用时，对卵巢癌的防治效果一般；二者联合作用时，对卵巢癌的防治效果显著提高，可以开发成防治卵巢癌的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证分离方法：(a)将远志的干燥根(2kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(15L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1(10个柱体积)、30:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(10个柱体积)、5:1(8个柱体积)和2:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(324mg，HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：浅黄色胶状物，HRAPCIMS显示[M+H]+为m/z239.0667，结合核磁特征可得分子式为C15H10O3，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-1(7.65，d，J＝8.8Hz)，H-2(7.31，dd，J＝8.5，7.7Hz)，H-3(7.01，d，J＝7.7Hz)，H-8(8.05，s)，H-12(8.49，s)，H-13(9.64，s)，H-14(9.96，s)，H-15(2.91，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：127.4(CH，1-C)，118.7(CH，2-C)，127.9(CH，3-C)，135.2(C，4-C)，112.3(C，5-C)，159.4(C，6-C)，121.5(C，7-C)，130.7(CH，8-C)，126.6(C，9-C)，120.3(C，10-C)，129.7(C，11-C)，160.2(CH，12-C)，185.2(CH，13-C)，195.0(CH，14-C)，17.5(CH3，15-C)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1723cm-1)，烯烃(1658cm-1)和芳香环(1610cm-1，1572m-1，1470m-1)基团。1H-NMR谱显示一个甲基质子信号δH2.91(3H，s)，一组AMX系统质子信号δH7.65(1H，d，J＝8.8Hz)、7.31(1H，dd，J＝8.8，7.7Hz)与7.01(1H，d，J＝7.7Hz)，一个环内连氧烯烃质子信号δH8.49(1H，s)，一个芳烃质子信号δH8.05(1H，s)，两个醛基质子信号δH9.64(1H，s)与δH9.96(1H，s)。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有15个碳信号，包括一个甲基δC17.5，七个次甲基(两个羰基碳，四个烯烃碳与一个连氧烯烃碳)δC127.4、118.7、127.9、130.7、160.2、185.2、195.0，以及七个季碳(七个烯烃碳)δC135.2、112.3、159.4、121.5、126.6、120.3、129.7；以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。HMBC谱中，H-13与C-7和C-12的相关性确认了一个醛基与C-11位连接，H-14与C-10和C-8的相关性表明另一个醛基连接在C-9位，H3-15与C-3和C-5的相关性可知甲基与C-4是相连的。此外，HMBC谱中H-1与C-2和C-10，H-3与C-2和C-4，H-8与C-7和C-9，H-12与C-6和C-11以及H3-15与C-3和C-5的相关性并结合1H-1HCOSY谱中H-1/H-2/H-3与H-12/H-13的相关性可以构建出该化合物的连接方式，进而确证该化合物的结构。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。该化合物的化学结构式及碳原子编号如下所示：实施例2：对卵巢癌模型的防治作用一、材料和仪器人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3由兰州大学的医学实验中心提供。通用RPMI-1640培养基(10％胎牛血清)培养。胞磷胆碱钠购自中国药品生物制品检定所。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。RPMI-1640培养液、四甲基偶氮挫蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、L-谷氨酰胺科昊生物工程有限公司。胰蛋白酶购于美国Sigma公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。十二院基磺酸钠(SDS)购于西安周鼎生物技术有限责任公司。HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。酸化HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。青霉素、链霉素购于华北制药厂。CO2培养箱(Heraeus，BB5060UV)，德国倒置相差显微镜(OLYMPUS，CK-40)，日本荧光显微镜(OLYMPUSOPTICAL，A×80，日本)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，酶标分析仪(BIO-TEK公司，美国)，低温高速离心机(Beckman-Coulter公司，德国)，EpicsXL流式细胞仪(Beckman-Coulter公司，德国)，R-3850型自动台式灭火器(山东新华医疗器械股份有限公司)，DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，数显恒温水浴箱(上海梅香仪器有限公司)，BS400S电子分子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，08-2恒温磁力搅拌器(上海天平仪器厂)，TDL-5普通离心机(上海安亭科学仪器厂)，低温冰箱(日本三洋公司)，电子制冰箱(日本三洋公司)，细胞冻存管(上海生工生物工程有限公司)。主要试剂的配置1、RPMI-1640：将RPMI-1640干粉剂一袋(10g)倒入清洗好的1000ml的烧杯中，加入双蒸水，终体积至1000ml，磁力搅拌器搅拌30分钟后，再加入碳酸氢钠2.0g，调整pH范围至7.2～7.4，继续搅拌使其充分溶解，之后在超净工作台中除菌，无菌条件下分装至250ml的盐水瓶中，放置4℃冰箱保存。每次重新配RPMI-1640时都应另取少量培养液放置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的培养箱中培养48h，细胞培养无菌后使用。2、10％胎牛血清：将冻存的胎牛血清置于4℃冰箱过夜解冻后放于56℃水域箱中，定时震摇，减少沉淀发生，35min后取出，置于超净工作台内降至常温后，分装置20或10ml小瓶后-20℃保存。3、PBS液：称取氯化钠8.00g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3.489g放入清洗好的100ml的烧杯中，再加入一些双蒸水，使其终体积为1000ml。，搅拌使其充分溶解，pH7.4，200ml瓶分装，高压灭菌后降至常温，4℃冰箱保存。4、青链霉素溶液：将青霉素、链霉素各80万单位，溶于80ml生理盐水中，无菌条件下分装，-20℃保存。当用其配制完全培养基时终浓度为100U/ml。5、胰蛋白酶消化液：称取胰蛋白酶0.25g，放入100ml的烧杯中，加入PBS液使其终体积为100ml，搅拌充分溶解后，滤过除菌，无菌条件下分装，4℃冰箱保存。6、L-谷氨酰胺补充液：称取谷氨酰胺2.922g，放入100ml的烧杯中，加入PBS液使其终体积为100ml，搅拌充分溶解后，过滤除菌，无菌条件下分装，4℃冰箱保存。RPMI-1640培养液在配制2周后应补加谷氨酰胺。7、细胞冻存液：50％RPMI-1640培养液+40％胎牛血清+10％DMSO，过滤除菌后低温避光保存。8、十二烷基磺酸钠溶液：称取十二烷基磺酸钠10g，加入双蒸水至终体积为100ml，再加入1ml0.01％盐酸，搅拌使其充分溶解，4℃冰箱保存。9、MTT：称取MTT50mg，10mlPBS液使其充分溶解，使其质量浓度为5mg/ml，无菌条件下过滤分装，4℃冰箱保存，两周内有效。注意配制及保存均应避光。10、RPMI-1640完全培养液：由90mlRPMI-1640+10ml胎牛血清+2ml100U/ml青链霉素溶液组成。二、试验方法1、细胞培养1.1细胞复苏将冻存管迅速从液氮中取出后立即放入37℃温水中，轻轻晃动冻存管，使冻存物尽快溶解，将其放入超净工作台中，将其内的细胞悬液移入离心管，再向离心管中加入10倍RPMI-1640培养液(含10％小牛血清)，离心，800rpm/min，离心5～10min，弃上清，细胞沉淀中加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，轻摇均匀，置37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养。并注明细胞名称及日期。1.2细胞传代培养待SKOV3细胞长至80～90％培养瓶时，弃去原有的培养液，并用配好的PBS洗两遍；用0.25％的胰酶消化，放在倒置显微镜下观察，当见细胞回缩、细胞间隙增大、形态变圆时弃去消化液，加入一定量的培养液中和胰酶消化液，并用吸管轻轻吹打已经消化过的细胞.，使其脱离培养瓶，800rpm/min离心5min，弃上清；显微镜下在计数板上进行细胞计数，按1:3比例传代，分装至培养瓶中，再次补充适量培养液后继续培养。注意严格无菌操作，每天观察细胞生长情况。1.3细胞冻存取对数生长期的细胞以0.25％的胰蛋白酶消化后离心，PBS洗2次，在低速离心机上l000rpm离心5min，弃上清液，加入1mL于-20℃下预冷的含DMSO的细胞冻存液，用吸管吹打均匀后移入冻存管中，用封口膜封口标记后放入4℃静置30min，之后-20℃放置2h后转入-80℃。一个月内使用的细胞可保存于-80℃中，长期保存者24h后应由-80℃移入液氮中。细胞的复苏与冻存应遵循的原则为慢冻快融。2、四甲基偶氮蓝(MTT)实验(1)选择对数生长期的细胞(生长80～90％)时，用配好的0.25％胰酶将细胞消化好以后，轻轻地吹打制成单细胞悬液，调整的最终的细胞浓度为8×104/mL；(2)取3个96孔板，每个时间点1板，100μL/孔，每孔细胞数为104做好分组标志；(3)细胞贴壁后分组，设空白组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)、胞磷胆碱钠组(胞磷胆碱钠终浓度30μmol/L)、化合物(Ⅰ)组(化合物(Ⅰ)终浓度30μmol/L)、胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物组(胞磷胆碱钠终浓度15μmol/L+化合物(Ⅰ)终浓度15μmol/L)，每组设6个复孔；(4)37℃、5％CO2条件下分别培养24、48和72h；(5)时间到后，吸去上清液后每孔加5g/L的MTT10μL；(6)培养4h后加入10μLDMSO，在多功能微板测试系统上以490nm波长测定各孔光密度OD值；(7)药物对细胞抑制率的计算：抑制率(％)＝(对照组细胞数-实验组细胞数)/对照组细胞数×100％。实验至少重复三次。3、PI染色法流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡(1)取对数生长期的SKOV3细胞，先用配好的胰酶消化后轻轻吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度为6×105/mL；(2)以6×105/mL的密度接种于50mL的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；(3)24h后将原来的培养液吸出，加入同等量(7.5mL)的含药培养液(胞磷胆碱钠组含胞磷胆碱钠30μmol/L；化合物(Ⅰ)组含化合物(Ⅰ)30μmol/L；胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物组含胞磷胆碱钠15μmol/L+化合物(Ⅰ)15μmol/L)，继续于37℃、5％CO2培养箱中培养48h；(4)48h后收集细胞，用0.25％胰酶消化后轻轻吹打制成单细胞悬液，将其移入离心管后，以1000r/min离心，离心l0min，弃去上清液，并用4℃的70％的冰乙醇固定，放置4℃的冰箱过夜；(5)次日用磷酸盐缓冲液PBS清洗、离心，弃上清后检测加入核糖核酸酶(RNAase)150μL和碘化丙啶(PI)染液150μL，在室温条件下避光染色30min，运用流式细胞仪检测细胞的周期分布及凋亡情况。实验重复三次，并应用软件进行分析。4、数据分析采用SPSS19.0的软件进行统计学的分析，以均数±标准差(X±s)来表示。采用单因素方差分析对计量资料进行比较，而组间两两比较采用LSD检验，率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。三、结果及结论1、MTT实验结果胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物作用于人卵巢腺癌SKOV3细胞24、48和72h后均出现明显的细胞增殖抑制作用，且抑制作用强于胞磷胆碱钠或化合物(Ⅰ)单独作用于人卵巢腺癌SKOV3细胞。结果见表1。表1对SKOV3细胞的影响2、PI染色法流式细胞术(FCM)检测细胞周期的结果胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物组作用于SKOV348h，较对照组相比G0/G1的细胞数量呈明显增多趋势，而S期和G2/M细胞数量呈明显减少趋势。胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物的作用效果优于胞磷胆碱钠或化合物(Ⅰ)单独作用效果。结果见表2。表2作用于SKOV3细胞48h对细胞周期分布的影响上述结果表明，胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物可以显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖活力，影响细胞周期的分布，将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡；胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)组合物的抑制效果优于胞磷胆碱钠或化合物(Ⅰ)单独作用的抑制效果，说明胞磷胆碱钠与化合物(Ⅰ)存在协同作用，可以协同抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，可以开发成防治卵巢癌的药物。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。