一种制备重组人凝血因子Ⅷ的方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法，具体涉及通过波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子ⅷ的细胞以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血ⅷ因子。

背景技术：

血友病为一种先天性凝血因子基因缺陷或突变导致凝血功能障碍的遗传出血性疾病。根据相应的凝血因子将血友病分为甲型、乙型、丙型血友病(即血友病a、b、c)，其中血友病a占80％-85％。目前替代疗法如输注血浆、凝血因子ⅷ或ⅸ是治疗血友病有效措施，但由于血浆来源的凝血制品极易造成血源性病毒污染，基因重组类凝血因子因其安全性及有效性成为治疗血友病的主要产品。重组人凝血因子ⅷ与天然凝血因子ⅷ具有相似的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的出血倾向，具有良好的治疗效果。目前上市的重组人凝血因子ⅷ有recombinate(baxter公司)、advate(baxter公司)、kogenatefs(bayer公司)、refacto(pfizer公司)、xyntha(pfizer公司)、eloctate(biogen公司，b结构域缺失的因子ⅷ与igg1fc结构域的融合蛋白)以及octanate(octapharma公司)等。

作为哺乳动物表达细胞的一种，人胚肾细胞(hek293)表达系统已经被用于制备许多包含重组凝血八因子的治疗蛋白，其表达的重组蛋白的蛋白翻译后修饰完全且免疫反应低，但hek293细胞培养工艺技术壁垒高，细胞结团严重，细胞状态难以维持。目前，重组八因子的细胞株的规模化培养主要采用的是传统搅拌式反应器，如中国专利申请cn103517919采用搅拌式反应器通过施加较大的剪切应力(即较大的搅拌速率)悬浮培养hek293细胞，培养产生的重组人凝血八因子最高活性仅达到16iu/ml；中国专利申请cn102776260通过在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1，获得的重组人凝血八因子的表达量最高也仅达到10～20国际单位/天/10⁶细胞。因此，仍需要高效培养重组人凝血因子ⅷ的方法。

技术实现要素：

本发明一方面提供一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法，包括：

(1)采用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子ⅷ的细胞，所述细胞处于对数生长期且细胞状态良好，所述反应器培养的温度为37℃，转速15～25rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％，空气0.3～0.5lpm，培养时间为72～110小时，培养方式为流加培养；

(2)从步骤(1)的细胞培养液中收获重组人凝血因子ⅷ。

其中所述重组人凝血因子ⅷ选自全长的重组人凝血因子ⅷ，或者b结构域缺失的重组人 凝血因子ⅷ(bddrfⅷ，序列如seqidno:1所示)。在本发明的一个优选实施方案中，所述重组人凝血因子ⅷ选自b结构域缺失的重组人凝血因子ⅷ。

优选的，其中步骤(1)中波浪式生物反应器的转速为16-24rpm。在本发明的一些具体实施方案中，所述波浪式生物反应器的转速为16、17、18、19、20、21、22、23或24rpm。

优选的，其中步骤(1)中波浪式生物反应器的角度为6-7度。在本发明的一个实施方案中，所波浪式生物反应器的角度为6度。在本发明的另一个实施方案中，所述波浪式生物反应器的角度为7度。

优选的，其中步骤(1)中co2浓度为7-9％，更优选为8％。

优选的，其中步骤(1)中空气设置为0.4lpm。

优选的，其中步骤(1)中培养时间为80-100小时，更优选为88-96小时。

其中步骤(1)中所使用的培养基不特别限制，只要适合细胞生长即可，在本发明的一个优选实施方案中，所使用的培养基为含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoamc、1g/lkolliphorp188的cdoptichoagt培养基。

优选的，其中步骤(1)中流加培养是在培养周期的24～72小时内补加200mmol/l谷氨酰胺至其浓度为2～4mmol/l，补加200g/l葡萄糖溶液至葡萄糖含量为2～4g/l。

优选的，步骤(1)的波浪式生物反应器包括但不限于wave生物反应器(gehealthcare)、appliflex(applikon)、biostatrm(sartoriusstedimbiotech)、celltainer(celltainerbiotech)、readytoprocesswave25(gehealthcare)、xuri细胞扩增系统w25(gehealthcare)、xrs20(palllifesciences)、sb50-x(kuhner)或sb200-x(kuhner)。更优选的，步骤(1)的波浪式生物反应器选自wave生物反应器(gehealthcare)。在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)的波浪式生物反应器选自wave波浪式反应器(gehealthcare，型号20/50eht)。

优选的，步骤(2)收获重组人凝血因子ⅷ是在含有na⁺的溶液中进行的。

在本发明的一个具体实施方案中，重组人凝血因子ⅷ的制备方法包括以下步骤：

(1)一级种子液制备：从液氮罐中取冻存的重组人凝血因子ⅷ工作细胞库细胞一支(装量1ml)，37℃水浴解冻，转移至含20ml种子培养基cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、50μg/mlzeocin)的125ml细胞培养摇瓶中，放置于37℃、6～10％co2二氧化碳恒温培养箱中110～130rpm培养。细胞密度约3.0～4.0×10⁶cells/ml时传代培养，传代密度约为0.6～1.0×10⁶cells/ml，3～4次传代后将一级种子液接种于wave波浪式反应器(gehealthcare，型号20/50eht)

(2)二级种子液制备：wave波浪式反应器培养二级种子液，接种比例为1/4～1/3，接种密度为0.6～1.0×10⁶cells/ml，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoam c、1g/lkolliphorp188)，二级种子液培养参数设置：培养温度37℃，转速15～20rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％，空气0.3～0.5lpm。二级种子液的细胞处于对数生长期且细胞状态良好时接种于wave波浪式反应器。

(3)wave波浪式反应器培养：接种比例为1/4～1/3，接种密度为0.6～1.0×10⁶cells/ml，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺、0.02％antifoamc、1g/lkolliphorp188)，流加培养，在培养周期的第24～72小时补加200mmol/l谷氨酰胺至其浓度为2～4mmol/l，补加200g/l葡萄糖溶液至葡萄糖含量为2～4g/l，培养周期第96小时收获，wave波浪反应器细胞培养主控参数设定：培养温度37℃，转速20～25rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％以及空气0.3～0.5lpm。

(4)从步骤(3)的细胞培养液中收获重组人凝血因子ⅷ，收获条件为终浓度0.5mol/l的nacl，2～8℃下电导为40～50ms/cm，溶液混合后静置30分钟。

本发明的制备方法进一步包括将步骤(2)收获的重组人凝血因子ⅷ进一步纯化的步骤，其中所述纯化步骤包括：s/d病毒灭活、亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析、纳滤和超滤置换缓冲液。

本发明再一方面提供一种含有重组人凝血因子ⅷ的组合物，其中所述重组人凝血因子ⅷ由本发明的任一项制备方法获得。

术语“流加培养”指反应器培养过程中细胞不断生长及产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度，一方面，它可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成；另一方面，它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。

本发明的制备方法具有如下有益效果：wave波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器。此外，wave波浪生物反应器采用较低的转速(例如15rpm～25rpm)培养细胞时，细胞活率和蛋白表达量也获得了出乎意料的提高。另外，进一步的纯化有效去除了宿主蛋白、dna、亲和配基、聚合物、降解物以及细胞培养过程中带入的污染物，大大提高了重组人凝血因子ⅷ的产量及蛋白活性。

附图说明

图1：wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器的细胞生长曲线对比图，左侧纵坐标为细胞密度(10⁶细胞/ml)，右侧纵坐标为细胞活率，横坐标为培养时间。

图2：wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器蛋白表达量对比图。

图3：wave波浪生物反应器不同培养周期的细胞生长曲线图，左侧纵坐标为细胞密度(10⁶细胞/ml)，右侧纵坐标为细胞活率，横坐标为培养时间。

图4：wave波浪生物反应器不同培养周期的蛋白表达量图。

图5：重组人凝血因子ⅷ的纯化流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中的这些和其他实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1考察wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器细胞培养效果

一级种子液制备：从液氮罐中取冻存的重组人凝血因子ⅷ工作细胞库细胞一支(自制，装量1ml)，37℃水浴解冻，转移至含20ml种子培养基cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、50μg/mlzeocin(invotrogen公司)，lifetechnologies公司)的125ml细胞培养摇瓶中，放置于37℃、6～10％co2二氧化碳恒温培养箱中110～130rpm培养。每天观察细胞状态，取样进行细胞计数和检测细胞活率(台盼蓝法)，细胞密度约3.0～4.0×10⁶cells/ml时传代培养，传代密度约为0.6～1.0×10⁶cells/ml，3～4次传代后将一级种子液接种于wave波浪式反应器(gehealthcare，型号20/50eht)

二级种子液制备：wave波浪式反应器培养二级种子液，接种比例为1/4～1/3，接种密度为0.6～1.0×10⁶cells/ml，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，二级种子液培养参数设置：培养温度37℃，转速15～20rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％，空气0.3～0.5lpm。二级种子液的细胞处于对数生长期且细胞状态良好时接种于wave波浪式反应器和30l搅拌式不锈钢反应器(applikon公司，型号ez-control)。

wave波浪式反应器细胞培养工艺：接种比例为1/4～1/3，接种密度为0.6～1.0×10⁶cells/ml，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培养，在培养周期的第24～72小时补加200mmol/l谷氨酰胺至其浓度为2～4mmol/l，补加200g/l葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量为2～4g/l，培养周期第96小时收获。培养过程中每24小时取样进行细胞计数检测细胞活率(台盼蓝法)，以及检测蛋白活性(一期法)。wave波浪反应器细胞培养主控参数设定：培养温度37℃，转速20～25rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％以及空气0.3～0.5lpm。

30l搅拌式不锈钢反应器细胞培养工艺：接种比例为1/4～1/3，接种密度为0.6～1.0×10⁶ cells/ml，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培养，在培养周期的第24～72小时补加200mmol/l谷氨酰胺至其浓度为2～4mmol/l，补加200g/l葡萄糖(sigma公司)溶液至葡萄糖含量为2～4g/l，培养周期第96小时收获。培养过程中每24小时取样进行细胞计数检测细胞活率(台盼蓝法)，以及检测蛋白活性(一期法)。搅拌式不锈钢反应器主控参数设定：培养温度37℃；搅拌转速100～130rpm；do通过补加o2自控维持在40％；ph值通过补加co2及0.5mol/l氢氧化钠溶液自控维持在7.00±0.20；空气持续通气，通气量为500ml/min。

wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器的细胞生长曲线对比结果如图1所示；wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器蛋白表达量对比结果如图2所示；wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器工艺过程及培养效果对比如表1所示。

表1：wave波浪生物反应器与搅拌式不锈钢反应器工艺过程及培养效果对比

wave波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器。此外，wave波浪生物反应器采用较低的转速(例如15rpm～25rpm)培养细胞时，细胞活率和蛋白表达量也获得了出乎意料的提高。

实施例2wave波浪生物反应器考察不同培养周期对细胞活率及蛋白表达量的影响

参照实施例1的制备方法获得二级种子液。

将二级种子液以1/4～1/3的接种比例，0.6～1.0×10⁶cells/ml的接种密度，培养基为cdoptichoagt(含4mmol/l谷氨酰胺(lifetechnologies公司)、0.02％antifoamc(sigma公司)、1g/lkolliphorp188(sigma公司)，lifetechnologies公司)，流加培养，在培养周期的第24～72小时补加200mmol/l谷氨酰胺至其浓度为2～4mmol/l，补加200g/l葡萄糖(sigma公 司)溶液至葡萄糖含量为2～4g/l，培养周期第120小时收获。培养过程中每24小时取样进行细胞计数检测细胞活率(台盼蓝法)，以及检测蛋白活性(一期法)。wave波浪反应器细胞培养主控参数设定：培养温度37℃，转速20～25rpm，角度5～8度，co2浓度6～10％以及空气0.3～0.5lpm。

wave波浪生物反应器不同培养周期的细胞生长曲线图如图3所示；wave波浪生物反应器不同培养周期的蛋白表达量如图4所示。细胞培养96小时后细胞状态不佳，细胞活率降低，蛋白快速降解，故将培养周期缩短至80～100小时，产品在袋内停留时间短利于保持产品活性。

实施例3重组人凝血因子ⅷ的纯化

(1)收获细胞培养液

向实施例1获得的细胞悬液(wave波浪式反应器培养)中加入含有氯化钠和氯化钙的缓冲液(10mmol/lhepes，5mmol/l二水氯化钙，4mol/l氯化钠，ph7.2)，使氯化钠的终浓度约为0.5mol/l，使其2～8℃下电导为40～50ms/cm，将溶液混合后静置约30分钟，通过深层过滤将细胞移除之后进行无菌过滤(0.22μm)以除去任何残留的细胞碎片和颗粒物。

(2)s/d病毒灭活

使用0.3％的磷酸三丁脂(tnbp)(v/v)和1％的tritonx-100对步骤(1)获得的澄清细胞收获液进行病毒灭活。在20～25℃下搅拌45分钟进行病毒灭活。

(3)亲和层析

将步骤(2)获得的细胞收获液使用gehealthcareindex系列层析柱(柱床高度6.5cm，直径7cm，体积约250ml，填料为ⅷselect凝胶(gehealthcare公司))进行纯化。用于亲和层析的缓冲液和亲和层析步骤如表2和表3所示。

表2：用于亲和层析的缓冲液

表3：亲和层析步骤

(4)阴离子柱层析

将q-sepharosehighperformance填料(gehealthcare公司)装填至层析柱管(geheatlhcarexk50层析柱)中，使柱床高度为6～7cm，直径为5cm，体积约为110～140ml。稀释步骤(3)的洗脱液使其电导值为12～15ms/cm(2～8℃)，从而使凝血因子ⅷ能与凝胶结合。用于亲和层析的缓冲液和层析步骤如表4和表5所示。

表4：用于阴离子交换层析的缓冲液

表5：阴离子柱层析步骤

(5)疏水柱层析

将butylsepharosehighperformance填料(gehealthcare公司)装填至层析柱(gehealthcarexk26)中，使柱床高度为16～21cm，直径为2.6cm，体积约为80～110ml。使用电导调节缓冲液稀释步骤(4)的洗脱液使其电导值为58～62ms/cm(2～8℃)。用于疏水柱层析的缓冲液和层析步骤如表6和表7所示。

表6：用于疏水层析的缓冲液

表7：疏水层析步骤

(6)纳滤(除病毒过滤)

使用平衡缓冲液(10mmol/lhepes，5mmol/l二水氯化钙，0.7mol/l氯化钠，ph7.2)平衡纳滤膜(planovabioex，asahi-kasei公司)，过滤步骤(5)获得的的疏水流穿液以除去无包膜病毒。

(7)超滤置换缓冲液

通过10kda纤维素超滤膜(millipore公司)对步骤(6)所得滤出液进行缓冲液置换。在过程中，保持系统压力小于0.1mpa，浓缩到一定体积后，采用置换缓冲液(3mg/mll-组氨酸，0.7mol/l氯化钠，5mmol/l氯化钙，ph7.0)置换约15个系统体积，置换完毕后加入终浓度为6mg/ml的蔗糖，得到原液并-80℃保存。

三批中试规模纯化结果如表8所示。

表8：三批中试规模纯化结果

*上述重组人凝血因子viii蛋白活性检测均采用一期法，参照中国药典(2010版)三部附录xn人凝血因子ⅷ测定法。^#蛋白含量测定采用紫外分光光度法。