技术领域本申请属于动物医学领域，具体地说，涉及一种细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的构建方法和应用。
背景技术：
鸭瘟(DuckPlague)又称鸭病毒性肠炎(Duckviralenteritis，DVE)，在我国俗称“大头瘟”，是由鸭瘟病毒(DuckPlagueVirus)引起的鸭、鹅、天鹅、雁及其它雁形目禽类的急性、热性、败血性、接触性传染病。其特征是血管损伤，组织出血，消化道黏膜某些特定部位有疹状损害，淋巴样器官出现特异性病变以及实质器官退行性变化。患病鸭临诊表现为高热稽留，排绿色稀粪，两脚麻痹，流泪和部分病鸭头颈肿大；食道黏膜有出血，常有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔黏膜充血、出血、水肿和假膜覆盖；肝有大小不等的出血点和灰白色坏死灶。多年来鸭瘟以高达90％的死亡率引起社会广泛关注。该病传播速度很快,加上集约化养鸭业鸭群密度高、流动频繁、极易引起流行，而且该病在一个大流行期后常呈地方性流行，长期危害养鸭业，造成巨大的经济损失，己经成为困扰我国养鸭业发展的主要疫病之一。鸭瘟病毒中国强毒株(DPVCHv)作为疱疹病毒家族的一员，拥有庞大的基因组和复杂的基因组结构，编码基因达76个之多，对其进行遗传操作和构建重组病毒的工作尤为困难。受限于研究平台的制约，目前鸭瘟病毒的致病机制和其基因组编码的大多数基因功能尚属未知。近年来功能基因组学的兴起极大地促进了大基因组插入的单拷贝细菌人工染色体(BacteriaArtificialChromosome，BAC)质粒基因工程技术的发展。疱疹病毒基因组上大量复制非必需基因的存在和细菌人工染色体能容纳长达300kb外源DNA的超大容量优势能够很好地匹配，一旦疱疹病毒的BAC构建成功，就能轻易的实现对病毒基因的任何突变。且所有的突变过程都能够在大肠杆菌中得到有效地控制和分析，相比之下经典的细胞内重组分析只能在重组病毒被构建和纯化后进行。同时，BAC分子克隆化病毒的构建过程简单高效，无须繁复的克隆过程，使得BAC成为我们构建重组鸭瘟病毒的最佳选择。目前，该技术已在多种疱疹病毒相继成功应用，如1型单纯疱疹病毒(StavropoulosTA,StrathdeeCA.Anenhancedpackagingsystemforhelper-dependentherpessimplexvirusvectors[J].JVirol,1998,72:7137-7143.)、人巨细胞病毒(HCMV)(WagnerM,RuzsicsZ,KoszinowskiUH.Herpesvirusgeneticshascomeofage[J].TrendsMicrobiol,2002,10(7):318–324.)、牛I型疱疹病毒(张存，叶伟成，王一成，等.牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性[J].科学通报，2009，54(24)：3823-3829.)、伪狂犬病毒(尹文玲，尹龙勃，叶伟成，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4):331-335.)、马立克氏病毒(崔红玉，王云峰，石星明，等.鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建[J].生物工程学报,2008,24(4):569-575.)等。针对DPV的重组病毒构建，也已有成功的案例。WangJ等用BAC必需功能元件取代了DPV2085株UL44(gC)基因，成功构建了gC缺失的重组鸭瘟病毒，并以之为载体表达了H5N1禽流感病毒的HA基因(WangJ,OsterriederN.Generationofaninfectiouscloneofduckenteritisvirus(DEV)andofavectoredDEVexpressinghemagglutininofH5N1avianinfluenzavirus[J].Virusresearch,2011,159(1):23-31.)。ZouZ等分别在DPV中国疫苗株C-KCE的SORF3-US2和gB-UL26区域插入BAC的mini-F序列，构建了重组鸭瘟病毒并以之为载体表达了鸭坦布苏病毒的囊膜蛋白E和禽流感的HA基因(①ZouZ,LiuZ,JinM.Efficientstrategytogenerateavectoredduckenteritisvirusdeliveringenvelopeofducktembusuvirus[J].Viruses,2014,6(6):2428-2443；②ZouZ,HuY,LiuZG,etal.Efficientstrategyforconstructingduckenteritissvirus-basedliveattenuatedvaccineagainsthomologousandheterologousH5N1avianinfluenzavirusandduckenteritisvirusinfection[J].VetRes,2015,46(1):42.)。ChenL等则在鸭瘟病毒中国疫苗株C-KCE的UL15B和UL18基因之间插入BAC的mini-F序列，并做了体内攻毒保护试验(ChenL,YuB,HuaJ,etal.Constructionofafull-lengthinfectiousbacterialartificialchromosomecloneofduckenteritisvirusvaccinestrain[J].Virologyjournal,2013,10(1):1.)。但是，目前尚未见利用鸭瘟病毒中国强毒株(DPVCHv)非必需神经毒力基因TK开展重组鸭瘟病毒的构建和应用其进行鸭瘟病毒致病机理及基因功能研究方面的报道。TK基因在已知的疱疹病毒中是早期基因，其产物胸苷激酶是胸腺嘧啶合成过程中补救途径的酶，通过磷酸化胸腺嘧啶为dTMP，并继续磷酸化得到dTTP以参与DNA的合成(Al-Madhoun等，2004；SK等，1985)。此外TK基因还是疱疹病毒的主要毒力基因，在疱疹病毒家族中保守且为病毒复制的非必需基因，并且TK基因最早主要出现在神经组织感染中(Han等，2002；Mettenleiter等，2000；Redaelli等，2008；Gill等，2009)。大量研究表明TK基因的缺失不影响病毒的复制和功能，同时TK的功能性缺失还有助于降低病毒的毒力，有发展为疫苗的潜力，此外由于带有TK缺失标记，还可以发展为标记疫苗在临床上区别野毒和重组疫苗毒。因此将TK基因作为靶基因用于构建鸭瘟病毒中国强毒株TK基因缺失的细菌人工染色体重组病毒拯救系统平台，除了有利于更深入地开展DPV的致病机理和基因功能研究外，也有助于解决弱毒疫苗株本身存在的毒力返强及终生病毒血症等一系列问题，为开发新型二联或多联活载体疫苗奠定基础，具有重要的应用前景。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请针对上述问题，提供了一种细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的构建方法，通过将长达162kb左右的鸭瘟病毒中国强毒株(DPVCHv)基因组克隆到细菌人工染色体(BAC)中，电转化大肠杆菌DH10B后获得的阳性克隆提取质粒后转染鸭胚成纤维细胞(DEF)，拯救出能在宿主细胞DEF上产生绿色荧光和空斑的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒DEVCHv-BAC-G。所获重组病毒DEVCHv-BAC-G，能够以病毒形式在细胞内生存，亦可以质粒的形式在大肠杆菌内复制，使得我们可以运用大肠杆菌系统成熟的遗传操作手段对DPVCHv基因组的任意位置进行修饰、改造、研究，有利于DPVCHv的致病机理和基因功能研究的开展；利用重组病毒EGFP荧光报告基因的指示作用，有利于细胞内重组病毒的筛选和纯化。同时所获TK功能性缺失的重组鸭瘟病毒在神经细胞等非分裂细胞中的复制能力降低，使得潜伏于神经组织的病毒难以激活，大大降低鸭瘟病毒重组疫苗株的神经毒力，从而保证该重组鸭瘟病毒作为疫苗具有更优的安全性。此外由于带有TK缺失标记和EGFP基因，还可以发展为标记疫苗在临床上区别野毒和重组疫苗毒。为了解决上述技术问题，本申请公开了一种重组鸭瘟病毒，包括鸭瘟病毒全基因组序列，所述鸭瘟病毒全基因组序列内插入了转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11序列，所述转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11序列包括细菌人工染色体核心功能元件(BACmini-F)、筛选标记绿色荧光蛋白EGFP、Cm抗性标记和两个loxp位点；所述转移载体序列如SEQIDNO.1所示；所述loxp位点的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示。进一步地，转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的插入位点为DPVCHvTK基因的250-251核苷酸之间，转移载体的左右侧同源臂分别命名为为TKA和TKB；TKA的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示，TKB的核苷酸序列如SEQIDNO.23所示。进一步地，重组鸭瘟病毒以细菌和病毒两种形式保存。本申请还公开了一种转移载体构建方法，包括以下步骤：1)以质粒pEGFP-ΔMCS为模板，PCR扩增EGFP表达盒并将其亚克隆至pUC18，获得pUC18/EGFP；2)以提取的DPVDNA为模板，扩增TK基因插入位点左右侧同源臂TKA、TKB，并逐个亚克隆至pUC18/EGFP，获得pUC18/EGFP-TKAB；所述TKA的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示，所述TKB的核苷酸序列如SEQIDNO.23所示；3)通过SphI酶切线性化pBeloBAC11质粒，并将其与相同酶切处理过的pUC18/EGFP-TKAB进行连接，Amp/Cm双抗性筛选重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11。本申请还公开了一种细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的构建方法，将包括细菌人工染色体(BAC)核心功能元件(mini-F)和绿色荧光蛋白(EGFP)的转移载体序列插入到长达162kb的鸭瘟病毒中国强毒株(NCBIAccessionNO.JQ647509)基因组的TK区域，电转化大肠杆菌DH10B后获得的阳性克隆提取质粒后转染鸭胚成纤维细胞(DEF)，拯救出能在宿主细胞DEF上产生绿色荧光的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒DEVCHv-BAC-G。进一步地，构建方法具体按照以下步骤实施：1)通过多步克隆构建包括TK基因左右同源臂、EGFP绿色荧光表达盒、pBeloBAC11核心功能元件三部分组成的重组鸭瘟病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11；2)提取重组鸭瘟病毒转移载体质粒与DPVDNA共同转染DEF细胞，筛选能够发出绿色荧光的重组鸭瘟病毒DPVCHv-BAC-G；3)PCR鉴定重组鸭瘟病毒DPVCHv-BAC-G中DPV和BAC基本功能元件的完整性；4)提取环化时期的DPVCHv-BAC-G，电转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞，Cm抗性平板筛选阳性克隆pBAC-DPV；其中，环化时期是指30-50％细胞病变时期；5)提取PCR及酶切图谱鉴定正确的pBAC-DPV质粒，转染DEF细胞，拯救出包括DPVCHv全基因组的感染性克隆。进一步地，构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救平台所用引物如下：TKAF：5’-3’，GAATTCATGCTTGCCATCATAACCGTATTCTC，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；TKAR：5’-3’，TCTAGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCACCTCGAGCTTTTCTTTCCTGTG，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；TKBF：5’-3’，GCATGCACATAGCAACAACTGACGCAAAAGC，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；TKBR：5’-3’，AAGCTTTCCCAGAAAGCTCGCCTAGGTCCTC，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；EGFPF：5’-3’，TCTAGATAGTTATTAATAGTAATCAATTACG，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；EGFPR：5’-3’，GTCGACATGCAGTGAAAAAAATGCT，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；sopBF：5’-3’，ATTCGTTAATTGCGCGCGTAGG，核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；sopBR：5’-3’，GAATATTCAGGCCAGTTATGCT，核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；repAF：5’-3’，CATGGCGGAAACAGCGGTTATC，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；repAR：5’-3’，ATGTATGAGAGGCGCATTGGAG，核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；TKF：5’-3’，CGCGGATCCCACTGAATGTCACTGC，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；TKR：5’-3’，CGCGGATCCCACTGAATGTCACTGC，核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。本申请还提供了一种利用上述的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建的重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株及其回复突变株。本申请还提供了一种细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台在鸭瘟病毒基因功能、病毒致病机制、以及基于此平台的鸭瘟病毒预防及其他禽类传染病重组鸭瘟病毒疫苗研究方面的应用，包括将其他禽类传染病基因与DPVCHv-BAC-G基因组上任意位点的替换或插入，所述其他禽类传染病包括能够引起包括鸡、鸭、鹅在内的雁形目禽类的病毒性传染病。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：1)本发明所构建的重组鸭瘟病毒DPVCHv-BAC-G感染性克隆，与野毒亲本株相比，在宿主细胞DEF上产生的空斑大小接近，但其不同时间点在DEF上的TCID50与亲本野毒相比下降了100倍左右，但是在整个观察周期内，其生长曲线趋势是与亲本株一样的。说明毒力基因TK的功能性缺失降低了病毒在宿主细胞上的滴度，但其缺失不影响病毒的复制周期，重组病毒和亲本毒在感染宿主细胞内的增殖规律是一致的。2)本发明在鸭瘟病毒中国强毒株细菌人工染色体重组病毒拯救系统平台的基础上，结合RedE/T重组技术将UL55基因进行敲除和回复突变，转染DEF细胞后所拯救的UL55基因缺失株及回复突变株能够产生与亲本相同的致细胞病变。进一步的RFLP、IFA、空斑试验和一步生长曲线比较表明所构建的UL55缺失株和回复突变株，能产生与亲本株DPVCHv-BAC-G相似的细胞病变效应、在感染细胞中的展现出相同的增殖周期并且其对宿主细胞的致病性与亲本株DPVCHv-BAC-G极为接近。推测UL55基因的功能与病毒的复制无关，其功能缺失不影响病毒在宿主细胞上的增殖过程及空斑形成，也不改变病毒对细胞的滴度。3)基于本发明的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建的UL55基因缺失株及回复突变株与UL26.5基因的共定位表明，UL55基因不影响UL26.5蛋白在感染细胞内的定位。4)本发明所构建的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台还具备发展为重组载体二联或多联疫苗的潜力，可用于鸭瘟病毒及其他禽类病毒性传染病的预防。包括将其他禽类传染病基因与DPVCHv-BAC-G基因组上任意位点的替换，所述其他禽类传染病包括能够引起包括鸡、鸭、鹅在内的雁形目禽类的病毒性传染病。当然，实施本申请的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1是本申请细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的纯化；其中，A：转染后盲传三代观察到的重组病毒荧光；B-I：重组病毒的噬斑纯化1-8代；图2是本申请pBAC-DPV限制性内切酶酶切图谱分析；其中，A：pBAC-DPV的BamHI、EcoRI酶切电泳图；B：模拟pBAC-DPV的BamHI、EcoRI酶切电泳图；M1：M1:DL15000；M2：1kbplusladder；图3是本申请重组DPV分子克隆化病毒的鉴定，其中，M1：DL5000；M2：DL15000；1-17:以提取的pBAC-DPV质粒或DPVCHv细胞DNA作为模板扩增的表5中的DPV基因组基因和插入序列功能元件基因EGFP、repA、sopB；图4是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G的IFA鉴定，其中，A-D：DPVCHv-BAC-G感染细胞；E-H：DPVCHv感染细胞；I-L：DEF细胞；图5是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G与亲本毒CHv空斑试验及一步生长曲线比较；其中，A：亲本毒CHv感染细胞；B：拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G感染细胞；图6是本申请亲本毒CHv和拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G上清和细胞中的一步生长曲线；其中，A：亲本毒CHv感染细胞；B：拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G感染细胞；图7是本申请Red重组所用质粒菌株pKD46、pKD4、pCP20图谱；图8是本申请UL55基因缺失第二轮RED重组鉴定；M1：DL15000；M2:DL5000；1：第一轮重组前UL55基因区域片段；2：第一轮RED重组PCR产物；3：第二轮RED重组PCR产物；图9是本申请拯救UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55的鉴定；M：DL5000；1-3：分别以DPVCHv、DPVCHv-BAC-G、DPVCHv-BAC-GΔUL55感染细胞DNA作为模板用鉴定引物扩增UL55基因区域；图10是本申请构建UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R第二轮RED重组鉴定；M1：DL5000；M2:DL15000；1：第一轮重组前UL55基因区域片段；2：以DPVCHv-BAC-GΔUL55为模板扩增UL55基因区域片段；3：构建回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R第一轮RED重组鉴定；4：构建回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R第二轮RED重组鉴定；图11是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G、DPVCHv-BAC-GΔUL55、DPVCHv-BAC-GΔUL55RRFLP分析；A:BamHI、EcoRI酶切电泳图；B：模拟BamHI、EcoRI酶切电泳图。M：1kbplusladder；M1:DL15000；1:DPVCHv-BAC-G；2:DPVCHv-BAC-GΔUL55；3:DPVCHv-BAC-GΔUL55R。*：缺失或多出的条带；图12是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-GΔUL55R的IFA鉴定；A-D：DPVCHv-BAC-G感染细胞；E-H：DPVCHv-BAC-GΔUL55感染细胞；I-L：DPVCHv-BAC-GΔUL55R感染细胞；图13是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G、UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R的空斑试验和一步生长曲线比较；A：亲本毒CHv感染细胞；B：拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G感染细胞；C：UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55；D：UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R；图14是本申请拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G、UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R上清和细胞中的一步生长曲线；其中，A：上清曲线；B：细胞曲线；图15是本申请DPVCHv感染宿主细胞中UL55蛋白和UL26.5蛋白的定位情况。A-D:鼠抗UL55IgG作为一抗检测DPVCHv感染宿主细胞中UL55蛋白的定位；E-H：兔抗UL26.5IgG作为一抗检测DPVCHv感染宿主细胞中UL26.5蛋白的定位情况；I-L：鼠抗UL55IgG和兔抗UL26.5IgG作为一抗检测DPVCHv感染宿主细胞中UL55和UL26.5蛋白的共定位情况；图16是本申请拯救重组病毒感染宿主细胞中UL26.5蛋白的定位情况。A-D：兔抗UL26.5IgG作为一抗检测DPVCHv-BAC-G感染宿主细胞中UL26.5蛋白的定位情况；E-H：兔抗UL26.5IgG作为一抗检测DPVCHv-BAC-GΔUL55感染宿主细胞中UL26.5蛋白的定位情况；I-L：兔抗UL26.5IgG作为一抗检测DPVCHv-BAC-GΔUL55R感染宿主细胞中UL26.5蛋白的定位情况。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台构建1、引物设计：根据TK基因及其左右两侧基因序列、pEGFP-C1序列和pBeloBAC11序列设计用于构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救平台所用引物如表1所示：表1构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救平台所用引物2细菌人工染色体重组鸭瘟病毒转移载体构建构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台外源BAC序列的插入位点为DPVCHv的TK区域。设计构建一个含有TK基因左右同源臂的细菌人工染色体转移载体，通过与DPV共转染细胞同源重组获得重组的鸭瘟病毒。转移载体包括TK基因左右同源臂、EGFP、pBeloBAC11mini-F序列三部分组成。其中TK左臂包括部分UL24和TK序列，右臂包括部分TK序列。并且在左侧同源臂A下游引物中设计34bp的loxP位点，方向与pBeloBAC11质粒上的loxP位点同向，同源臂的大小分别为1357bp、1039bp。2.1EGFP绿色荧光蛋白表达盒的亚克隆EGFP绿色荧光蛋白表达盒为去除了pEGFP-C1质粒多克隆位点的质粒pEGFP-ΔMCS。构建的主要过程包括用BglII和SmaI双酶切pEGFP-C1后，回收线性化的载体，经KlenowFragment补平，T4DNAligase连接后，转化于Eco.liDH5a感受态细胞，获得删除了多克隆位点的质粒pEGFP-ΔMCS。pEGFP-ΔMCS常规方法增菌培养并提取质粒，以此质粒为模板，利用表1中扩增EGFP的引物EGFPF/EGFPR进行PCR扩增，扩增体系和反应程序如表2、表3所示：表2扩增EGFPPCR反应体系表3扩增EGFPPCR反应条件扩增结束后，将扩增产物点样进行电泳，得到大小为1571bp的扩增产物。胶回收试剂盒进行切胶回收EGFP扩增产物后，依次将其连接到pMD18-T和pUC18质粒载体上进行T克隆和亚克隆，亚克隆经PCR和酶切鉴定正确后送公司进行测序鉴定，所得正确克隆质粒命名为pUC18/EGFP。2.2DPVCHvTK区域左右侧同源臂的亚克隆2.2.1DPVCHv感染细胞总DNA的提取2.2.1.1鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备(1)取8-11日龄健康鸭胚，在照蛋器上用铅笔划出气室和胚头的位置。用37℃的0.1％新洁尔灭清洗蛋壳表面，将蛋壳表面的新洁尔灭完全冲洗干净并将蛋壳表面晾干后先后分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面，置于超净工作台内的蛋架上。(2)无菌操作条件下打开气室，将胚体取出并用灭菌PBS将胚体洗净，去头、翅、腿、内脏等，再用PBS洗胚体2-3遍以彻底去除血污。用灭菌的眼科剪将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，再加胰酶150μl/胚，于37℃水浴中消化1min左右直至胚块成絮状；(3)立即将细胞悬液以5000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀悬浮于适量MEM后用6层纱布过滤，滤液加10％小牛血清和100IU/ml双抗后并充分吹打均匀后，分装于细胞瓶中，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。2.2.1.2鸭瘟病毒的增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后加入0.1MOI病毒覆盖细胞表面进行吸附，37℃作用120min后弃病毒液，然后加含5％小牛血清和100IU/ml双抗的MEM维持营养液于37℃培养，直至病变出现。2.2.1.3DPVCHvDNA提取(1)待接种DPV的细胞瓶中出现80-90％的病变时，收获细胞，-20℃反复冻融破碎细胞，4℃条件下，5000r/min×30min去细胞碎片。(2)取离心后的上清液400μl，加入蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/ml，温和地混匀后,56℃水浴1h，其间不时温和旋转粘滞溶液；(3)加入10％SDS至终浓度为1％，37℃水浴30min；(4)加入400μl饱和酚：氯仿(1：1)轻柔颠倒混匀5min，之后4℃5000r/min×5min,用剪去末端的TIP头沿管壁小心吸取上清。再用酚氯仿重复抽提2-3次，最后用400μl氯仿抽提1次(整个抽提过程轻柔操作)，离心后取上清。(5)取上清液，加1/10体积的3MNaAc(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜沉淀核酸。(6)4℃13000r/min离心10min，沉淀用70％冷乙醇洗涤两次，每次洗涤后小心倒掉或吸去上清。(7)最后一次洗涤完成后，吸去多余液体，在通风橱中略微风干或用DNA浓缩干燥仪干燥后，再用20μlTE缓冲液(pH8.0)溶解DNA，-20℃冰箱保存备用或直接电泳鉴定。2.2.2TK基因左右同源臂的扩增以提取的病毒基因组DNA为模板，利用引物TKAF/TKAR、TKBF/TKBR对TK左右臂进行PCR扩增，PCR反应条件和程序同表2、表3。扩增得到大小为1357bp、1039bp的TK基因左右同源臂扩增产物。2.2.3构建TK基因左右同源臂的亚克隆pUC18/EGFP-TKAB参照EGFP表达盒的亚克隆的克隆方法，将扩增所得TKA、TKB分别进行T克隆，经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性T克隆命名为pMDT-TKA、pMDT-TKB。然后将T克隆所得的pMDT-TKA、pMDT-TKB分别用EcoRI/XbaI、SphI/HindIII酶切后，先后连接到用相同酶切处理过的pUC18-EGFP上，构建出pUC18/EGFP-TKA、pUC18/EGFP-TKAB亚克隆质粒。2.3重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建2.3.1BAC载体核心序列片段的制备将-70℃保存的pBeloBAC11划线于含氯霉素(Cm，34μg/ml)抗性的LB固体培养基平板上，过夜培养后，挑取单克隆，接种于100ml灭菌的LB/Cm液体培养基中，37℃、220rpm培养18h，按照QiagenplasmidMidikit质粒中量提取试剂盒说明提取低拷贝质粒pBeloBAC11，溶解于50μl灭菌的ddH2O中。用SphI酶切提取的pBeloBACll，胶回收分子量约7.5kb的线性化DNA片段，即为BAC载体基本功能基因线性化片段，用来构建细菌人工染色体重组病毒转移载体。2.3.2重组病毒转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的构建LB/Amp平板上划线培养重组质粒pUC18/EGFP-TKAB，次日挑选单克隆接种液体培养基进行常规增菌培养。AxygenPlasmidMiniExtractionkit小量提取质粒pUC18/EGFP-TKAB，SphI酶切并回收片段，与回收的SphI酶切pBeloBACll线性化片段进行连接、转化，涂布Amp/Cm双抗性的LB身体培养基，37℃倒置培养。经过菌落PCR、酶切和测序鉴定，挑取两个loxP位点分别位于BAC核心序列两侧的阳性克隆保种并命名为pUC18/EGFP-TKAB-BAC11。作为与DPV基因组DNA共转染构建DPV重组病毒的转移载体。3细菌人工染色体重组鸭瘟病毒的构建3.1转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11的提取从冰箱中取出构建好的转移载体pUC18/EGFP-TKAB-BAC11阳性克隆，划线于含Cm的抗性LB培养基平板上，37℃培养过夜后，挑取单克隆中量摇菌100ml，培养16h后按QIAGENPlasmidMidiKit说明书提取转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11。灭菌水自然溶解后，取少量的质粒DNA用紫外分光光度计定量并鉴定纯度。3.2转移载体质粒pUC18/EGFP-TKAB-BAC11与DPVDNA共转染常规方法制备原代鸭胚成纤维细胞，在六孔细胞培养板中培养至形成单层，接种DPVCHv细胞毒，37℃孵育1h后，去除病毒液，用不含血清的MEM洗细胞两遍，每孔加入1.5ml无血清MEM。按照Lipofectamine3000的说明书进行转染，每孔转染2.5μgpUC18/EGFP-TKAB-BAC11转移载体质粒DNA。同时转染一孔pEGFP-ΔMCS作为对照。37℃、5％CO2培养箱中作用6h，吸去转染液，加入含血清的维持液；37℃、5％CO2培养箱中培养2-3天，每天观察荧光，直至出现重组病毒荧光斑。3.3重组病毒DPVCHv-BAC-G的初步筛选、富集和纯化(1)收集3.2中转染后出现荧光的细胞，反复冻融三次后，接种长满单层的鸭胚成纤维细胞，盲传三代，扩大重组病毒的产量。(2)在六孔盘中种入DEF细胞，待其长成致密单层后，接种入盲传三代后的重组病毒，在37℃、5％CO2培养箱中培养培养24-48h后，荧光倒置显微镜下观察荧光。待出现荧光后，吸去维持液，在六孔板中覆盖营养琼脂(2×MEM与2％低熔点琼脂糖等体积混合)，每孔加入2ml，待琼脂凝固后倒置培养24h左右。荧光倒置显微镜下观察并标记带荧光的细胞集落，用巴氏吸管将其吸出，置于500μl细胞培养维持液中，-70℃反复冻融三次释放病毒。(3)将反复冻融后的病毒液以不同的稀释倍数(先5倍稀释，当荧光量显著增多后10倍稀释)感染24孔细胞培养板上的鸭胚成纤维细胞，37℃作用2h后，吸去病毒液，覆盖营养琼脂，待琼脂凝固后翻转细胞培养板。37℃、5％CO2培养箱中继续培养至出现较大荧光斑，再用巴士吸管吸取荧光斑进行纯化、富集。(4)重复步骤(3)直至所有的空斑均出现荧光(图1)，将获得的重组病毒命名为DPVCHv-BAC-G。3.4重组病毒DPVCHv-BAC-G的鉴定收获纯化后的重组病毒DPVCHv-BAC-G提取细胞DNA作为模板，用表1中的引物扩增转移载体功能元件repA(SEQIDNO.26所示)、sopB(SEQIDNO.25所示)、EGFP基因(SEQIDNO.27所示)及DPV基因组的TK区域(SEQIDNO.28所示)。PCR扩增体系及程序同表2、表3所示。PCR鉴定结果表明重组病毒能够扩增出转移载体功能元件repA、sopB、EGFP基因，但不能扩增出DPV基因组的TK区域，表明已成功获得纯化了的在TK基因区域插入BAC的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒DPVCHv-BAC-G。4重组鸭瘟病毒电转化克隆的获取4.1大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞的制备(1)从-70℃冰箱中取出保存的DH10B菌种，划线于LB平板上，37℃倒置培养16-24h。(2)挑取单克隆接种于5ml无抗性的LB液体培养基中。37℃、220rpm，培养14～16h作为种子液。(3)将种子液以1：50的比例接种于50mlLB液体培养基中，37℃、220rpm剧烈震荡培养，培养1h后每隔半小时取少量菌液测OD600。当OD600达到0.5-0.7时，立即取出，置于冰上冷却30min。此后所有的操作应保持在冰上进行。(4)将菌体转入预冷的离心管中，放入提前预冷的离心机中，4℃、5000r/min离心5min，收集菌体。(5)用冰预冷过的灭菌超纯水20ml悬浮菌体，轻柔吹打，并时刻保持冰上，6000r/min离心5min。离心结束后立即倒掉上清，将菌体置于冰上。(6)重复步骤(5)3-5次，彻底除去菌液中的盐离子成分。(7)最后一次洗涤后，倒掉上清，视菌体的量加入适量冰冷的灭菌超纯水悬浮并分装成50μl/支，立即进行电转化。若暂不转化，则在倒掉上清后，用预冷的灭菌30％甘油进行悬浮，分装成小份后放入-70℃冰箱保存备用。4.2DPVCHv-BAC-G环化基因组DNA的提取只有环化的含BAC序列的重组病毒基因组DNA电转入电转感受态DH10B中才能象BAC质粒一样在细菌中复制。DPV基因组DNA只在感染细胞的初期很短暂的时间内处于环化状态。因此要获得环化的重组DPV病毒基因组DNA，收获病毒的时间特别关键。常规方法增殖重组DPV病毒DPVCHv-BAC-G，待30％-50％左右的细胞出现病变时，提取病毒基因组。所有的操作中，为了保证基因组的完整性，动作要轻柔，用剪刀把枪头口剪大并用酒精灯的火焰使之光滑化。用灭菌超纯水溶解时，使其自然溶解，期间不要晃动，以防DNA断链。4℃暂时保存，取少量提取的重组DPV感染细胞总DNA用紫外分光光度计测定浓度，立即用于电转。4.3电击转化筛选重组BAC克隆(1)试验开始前，开启电转化仪，并设置好参数1.8kV，200Ω，25μF(1mm电转杯)。(2)将4.2提取的重组病毒环化基因组DNA，置于冰上5-10min，使其冷却。加入1-5μl(100ng)重组病毒DNA到新鲜制备的50μlDH10B电转化感受态中，轻轻搅动细胞，使其混匀。继续置于冰上10min中左右。(3)用预冷的枪头吸取步骤(2)中的感受态-DNA混合物到预冷的1mm电转杯中，轻轻敲击桌面，使混合物沉于管底。(4)用吸水纸吸干电转杯周围的水分，立即放入电击槽中，用设定好的程序进行电击。(5)电击完成后，迅速加入1ml37℃预热的LB培养基，轻轻重悬细胞后，迅速吸出，转移到试管中，放入37℃水浴摇床中复苏2h左右。(6)8000r/min常温离心1min，留200μlLB重悬沉淀，将悬液转移到LB/Cm固体培养基上，细菌涂布棒涂布均匀后放室温直至液体吸收，倒置琼脂糖平板，放入37℃培养箱中培养24h左右。4.4BAC转化子的鉴定从4.3中获得的克隆中随机挑选2个进行菌落PCR鉴定，菌落PCR结果显示重组DPV电转化克隆成功。进一步挑选其中的一个克隆增菌培养后按照QiagenPlasmidMidikit的说明书的方法中量提取BAC分子克隆化DPV病毒的阳性克隆pBAC-DPV。取提取的pBAC-DPV质粒1μg，分别用限制性内切酶BamHI、EcoRI按照表4的体系进行酶切，酶切完成后，用1％琼脂糖凝胶电泳分析，酶切产物全部上样，15V电泳16-19h。结果显示pBAC-DPV质粒的BamHI、EcoRI酶切图谱与预期的酶切分析结果一致(图2)。表4pBAC-DPV酶切体系进一步用酶切鉴定正确的pBAC-DPV质粒为模板，PCR鉴定插入DPV病毒TK区域的BAC转移载体片段，包括荧光标记EGFP基因和BAC基本功能基因序列，引物序列见表1。同时根据pBAC-DPV亲本株DPVCHv株全基因组设计引物，扩增DPV体内外增殖必需基因、毒力基因及结构蛋白基因(采用本实验室已有的引物序列，不需要另外合成)，以确认pBAC-DPV中DPV基因组结构的完整性。同时提取DPVCHv细胞DNA用相同引物进行扩增作为对照。14个在本实施例中用来鉴定pBAC-DPV分子克隆化DPV病毒基因组完整性的基因如表5所示。结果表明所列DPV基因组基因和插入外源序列的核心功能元件完整(图3)，重组DPV电转化克隆构建成功，获得了能在细菌中复制的重组DPV电转化克隆子pBAC-DPV。表5鉴定pBAC-DPV分子克隆化DPV病毒基因组完整性的基因5重组DPV全基因组感染性克隆的拯救5.1转染用pBAC-DPV的提取将经过酶切图谱分析、PCR鉴定以及测序鉴定正确的BAC细菌克隆，划线于LB/Cm培养基平板上，37℃培养18h，挑取单克隆，中量摇菌100ml，按QiagenPlasmidMidikit的说明书提取pBAC-DPV质粒，在超净工作台中用50μl的灭菌水溶解DNA。取少量pBAC-DPV稀释后用紫外分光光度计测定浓度。将pBAC-DPV浓度控制在0.2μg～1μg/μl，4℃冰箱内保存。5.2将pBAC-DPV转染进DEF常规方法制备DEF细胞，待细胞融合至80-90％时，用不含有抗生素和血清的MEM洗涤细胞，重复洗涤3次以上，用于转染。取新鲜提取的pBAC-DPV2.5μg进行转染，转染的具体操作参照脂质体转染试剂盒LipofectalnineTM3000的使用说明进行。同时设立转染pEGFP-ΔMCS质粒的细胞孔作为转染对照以及不转染质粒的细胞孔作为空白对照。转染后第二天，吸去转染混合液，用PBS洗涤后，换成5％MEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3d，荧光倒置显微镜下观察病毒荧光斑。5.3拯救DPV全基因组感染性克隆待2.4.2中的转染孔出现带荧光的噬斑后，收获细胞，反复冻融后盲传三代以去除瞬时转染的质粒，扩大重组病毒的产量，待接种后大量细胞出现带荧光的噬斑时，即可收获、保种，将获得重组病毒命名为DPVCHv-BAC-G。5.4拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G的鉴定5.4.1DPVCHv-BAC-G基因组DNA提取常规方法制备原代鸭胚成纤维细胞，待DEF长成致密单层细胞后，将拯救的重组病毒DPVCHv-BAC-G接种到己铺满单层DEF的细胞培养皿上。37℃培养至产生CPE，胰酶消化下来后，加入5％生长液终止消化，取出1ml含病毒的消化液，13,000x1min，沉淀-20℃保存或直接用于提取病毒DNA。在病毒沉淀中加入1mllysisbuffer，悬浮后加入20μl20mg/ml的蛋白酶K，56℃作用1h后，用酚氯仿提取3次，最后加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20℃作用2h后，4℃13,000x20min，最后用1ml70％乙醇洗涤一遍沉淀，待乙醇挥发干净后溶于100μl灭菌水中。5.4.2PCR鉴定以提取的拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G感染细胞DNA作为模板检测插入序列核心元件repA、sopB、EGFP及DPV基因组上的US2基因。电转化的克隆子8提取质粒进行相应扩增作为阳性对照，未感染DPV的DEF作为模板同时进行PCR作为阴性对照。结果显示repA、sopB、EGFP及DPV基因组上的US2基因都能获得特异性扩增产物。5.4.3IFA鉴定(1)用重组病毒DPVCHv-BAC-G感染细胞培养皿中长满单层DEF细胞的爬片，同时设立感染DPVCHv的DEF细胞爬片和不感染任何病毒的DEF细胞爬片作为对照。(2)弃去培养液，用PBS洗2遍细胞，彻底去除PBS，但是不要让细胞干掉。(3)用1ml冰冷的4％多聚甲醛4℃固定细胞30min，弃去混合液并略微风干(此步可将风干的细胞爬片用封口膜封好并用锡箔纸密封存于-20℃冻存，稍后操作。)(4)PBS洗细胞3次，每次1-2ml，室温作用5min；(5)用含0.2％Triton的PBS透化30min。(6)加入200μl封闭液(用PBS配制的5％脱脂牛奶)，37℃湿盒封闭1h。(7)一抗孵育：吸干液体，加入200μl纯化的兔抗TK抗体(用含1％BSA的PBS适当稀释)，37℃湿盒作用1h或4℃孵育过夜。(8)吸干液体，用含0.1％Tween-20的PBS洗细胞3次，每次1-2ml，室温作用5min；(9)二抗孵育：加入200μlTRITC标记的羊抗兔IgG(1:100稀释)，锡箔纸包裹避光，37℃湿盒作用1h。(10)重复步骤(8)。(11)吸干液体，每孔加入200μlDAPI(1:1000稀释)避光染核5-10min。(12)重复步骤(8)。(13)吸干液体，夹出细胞爬片，反转置于加有甘油的载玻片上。(14)荧光显微镜下观察荧光。从图中可以看出，重组病毒EGFP表达发出绿色荧光(图4B)，而对应的亲本毒DPVCHv感染细胞和DEF细胞则没有观察到荧光(图4F、J)。一抗结合后，缺失了TK的重组病毒和DEF细胞(图4C、K)没有特异性荧光出现，而亲本毒DPVCHv则可以观察到明亮的红色荧光(图4G)，说明重组病毒拯救成功。6拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G的体外生物学特性分析6.1病毒定量(TCID50测定)(1)从-70℃冰箱中取出冻存的DPVCHv-BAC-G、DPVCHv，在EP管中将病毒液做连续10倍倍比稀释，从10-1-10-8。(2)将稀释好的病毒按每孔100μl接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一横排共10孔。(3)常规方法制备DEF悬液，在加有稀释病毒液的孔中每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2～3×105个/ml。(4)同时，用剩下的2个纵排做正常细胞对照(100μl生长液+100μl细胞悬液)。(5)加好后置于37℃、5％C2O培养箱中培养7-9天。(6)显微镜下观察并记录病变情况，按Reed-Muench两氏法或Karber法计算TCID50。6.2空斑试验(1)将冻存的DPVCHv-BAC-G和DPVCHv分别用MEM连续作10倍倍比稀释。(2)取倍比稀释的病毒液，每孔100μl接种于24孔板中生长成单层的致密鸭胚成纤维细胞。(3)37℃吸附1h后，吸出病毒液，每孔加入500μl加入0.5％甲基纤维素培养基覆盖细胞，37℃、5％CO2培养箱中继续培养3-5d。(4)吸出甲基纤维素，每孔加入500μl预冷的4％多聚甲醛，室温固定15min；(5)灭菌PBS洗细胞两次，加入500μl0.5％结晶紫染色5min，自来水冲洗去除染色液，观察并计数蚀斑。结果显示亲本毒CHv和拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G在感染宿主细胞DEF后，形成的空斑大小接近，形态也非常相似(图5A、B)。6.3一步生长曲线(1)将测定了TCID50的DPVCHv-BAC-G和DPVCHv株以0.02MOI的剂量分别到接种已长成单层的致密鸭胚成纤维细胞的24孔细胞培养皿中，每个稀释度接种3孔。(2)分别在接种后的6h、12h、24h、36h、48h、72h分开收获上清和细胞中的病毒。上清中的病毒：直接取500μl病毒上清，置于EP管中；细胞中的病毒：吸去上清后，用PBS洗细胞3遍，每孔加入0.05％胰酶100μl消化细胞，待细胞消化下来后加入400μl5％MEM维持液终止消化，吹打均匀后转移到EP管中。(3)将收获的不同时间点的上清和细胞中的病毒反复冻融三次，取100μl不同时间点的病毒样品依次做10倍稀释至合适的稀释度(10-1～10-8)。(4)将稀释好的病毒按每孔100μl接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一横排共5孔。(5)常规方法制备DEF悬液，在加有稀释病毒液的孔中每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2～3×105个/ml。(6)同时，用剩下的2个纵排做正常细胞对照(100μl生长液+100μl细胞悬液)。(7)加好后置于37℃、5％C2O培养箱中培养7-9天。(8)显微镜下观察并记录病变情况，按Reed-Muench两氏法或Karber法计算TCID50并绘制生长曲线(图6A、B)。从图中可以看出，在感染后的72小时内，无论是上清还是细胞内的重组病毒含量都显著低于亲本毒DPVCHv的病毒量，在感染的不同时期二者的含量最大相差100倍左右。亲本毒和重组毒在感染后的前24h内，感染细胞的上清和细胞中都检测不到病毒含量的增加，说明其处于潜伏状态。在感染24h后，二者在上清和细胞中的含量都显著增加，到48h.p.i时细胞中的病毒不再增加，而上清中的含量却在持续增加，说明此时病毒的复制已经进入裂解释放时期。由此我们可以推断，由于BAC-EGFP转移载体序列在TK区域的插入，降低了重组病毒对于细胞的致细胞病变效应，使其在细胞上的感染滴度降低。实施例2重组鸭瘟病毒UL55基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究1菌株/质粒Red重组所用质粒菌株pKD46、pKD4、pCP20图谱如图7所示。2引物设计本实施例中用于构建UL55基因缺失及其回复突变株引物如表6所示。表6用于RED重组的相关引物3第一轮RED重组敲除UL55基因3.1UL55基因同源打靶片段的扩增、回收设计用两侧带UL55基因同源臂及FRT序列的卡那霉素抗性基因座位打靶片段代替要敲除的UL55序列。以质粒pKD4为模板，扩增卡那霉素抗性基因。该引物3’端20个碱基来源于卡那霉素抗性基因，用来扩增该抗性基因，5’端50个碱基来源于DPVCHv，分别位于要敲除的UL55基因序列的两侧，用来同源重组，Kana基因两侧各包括一个FRT，用于第二轮RED重组。用保真酶扩增kana抗性基因的PCR体系和反应条件如表2、表3所示。所获UL55基因同源打靶片段长1577bp。胶回收纯化后，溶于30μl灭菌水中，取少量适当稀释后紫外分光光度计测定回收kana片段的浓度。3.2将pKD46转化至包含DPVCHv-BAC-G感染性克隆的DH10B中从-70℃冰箱中取出保存的pKD46菌种，划线于LB/Amp平板，倒置平板置于30℃培养箱中培养16-24小时。次日挑选单克隆在LB/Amp液体培养基中进行增菌，13-16h后常规方法小量提取质粒。同时，取出包含DPVCHv-BAC-G感染性克隆的DH10B的菌种，活化增菌后制备化学感受态细胞并转化入pKD46，将30℃复苏后的转化菌液涂布LB/Cm/Amp平板，30℃培养箱倒置培养24-48h。3.3包含pKD46和DPVCHv-BAC-G感染性克隆的DH10B电转感受态细胞的制备3.3.1RED重组系统的诱导表达挑选LB/Cm/Amp平板长出的包含pKD46和DPVCHv-BAC-G的单菌落，在30℃过夜培养。次日按1:50的比例将过夜培养物接种到新鲜的LB/Cm/Amp培养基中，30℃、220rpm剧烈震荡培养，每20min测一次OD600，当OD600＝0.1时加入终浓度为100mM的L-阿拉伯糖诱导pKD46上exo、Beta、Gam蛋白的表达。将加入L-阿拉伯糖的菌放回水浴摇床内，继续培养，每30min测一次OD600，直至OD600为0.5–0.7，停止培养，立即置于冰上15-30min，使培养物彻底冷却。3.3.2包含pKD46和DPVCHv-BAC-G感染性克隆的电转感受态细胞的制备取3.3.1获得的冷却后的诱导培养物，按照实施例1的方法制备电转化感受态，置于冰上做电转化备用。3.3.3电转化将线性打靶片段转入表达RED重组酶基因的菌株3.3.3.1电击转化将100ng回收的线性kana抗性基因片段加入到3.3.2中制备的50μl表达RED重组酶基因的电转化感受态细胞中，按照实施例1的方法设置程序进行电击转化，转化完成转移到试管中37℃复苏2h后，取200μl菌液涂布LB/Cm/Kana平板，剩下的离心后涂布到另外一个LB/Cm/Kana平板，37℃培养箱倒置培养16-24h。3.3.3.2第一轮RED重组鉴定待第一轮重组电转化的平板上长出单克隆后，挑几个用表6中的UL55基因缺失鉴定引物进行菌落PCR鉴定。结果表明在RED重组酶的作用下，带UL55同源臂的Kana片段成功重组到DPVCHv-BAC-G基因组上。缺失鉴定引物扩增Kana替换前UL55基因区域片段长度为979bp，Kana替换后的目的区域片段长度为1895bp。将菌落PCR鉴定正确的克隆投入含Cm/Kana抗性的LB液体培养基中进行培养、保种。4第二轮RED重组去除Kana抗性基因4.1去除kana抗性基因(1)从-70℃冰箱中取出保存的Pcp20菌种，划线于LB/Amp平板，30℃倒置培养24-48h。挑选长出的单克隆接种LB/Amp液体培养基进行增菌、提取质粒，溶于适量灭菌水后，4℃保存备用。(2)取第一轮RED重组鉴定正确的单克隆，LB/Cm/Kana培养13-16h后，按1：50的比例接种于LB/Cm/Kana液体培养基中，制备化学感受态细胞。(3)化学转化0.5pgPcp20质粒到第一轮RED重组去除了UL55基因的化学感受态细胞中。(4)将30℃复苏2h后的转化菌液取100μl用LB做10-1-10-5倍比稀释，最后取100μl10-4和10-5稀释的培养涂布2个LB/Cm/Amp平板，30℃培养24h。(5)取平板上长出的单克隆划线于LB/Cm平板，倒置平板于42℃培养箱中培养16-24h。4.2第二轮RED重组鉴定4.2.1菌落PCR鉴定待第二轮重组42℃培养的平板上长出单克隆后，挑几个用表6中的UL55基因缺失鉴定引物进行菌落PCR鉴定。鉴定结果表明通过在大肠杆菌中转入Pcp20，使其表达能识别FRT位点的FLP重组酶切除Kana抗性基因，再通过42℃热灭活温度敏感质粒Pcp20，获得敲除了UL55整个ORF的缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55。PCR结果显示，去除Kana抗性基因后，鉴定引物扩增UL55基因区域仅剩502bp，与预期结果一致(图8)。进一步测序鉴定正确后投入含Cm抗性的LB液体培养基中进行培养、保种。5拯救重组病毒DPVCHv-BAC-GΔUL555.1中量提取DPVCHv-BAC-GΔUL55质粒将鉴定正确的DPVCHv-BAC-GΔUL55克隆投入100mlLB/Cm液体培养基中培养过夜13-16h，按QiagenPlasmidMidikit的说明书提取重组质粒，灭菌水溶解后取少量用紫外分光光度计测定浓度，其余的-4℃保存备用。5.2拯救DPVCHv-BAC-GΔUL55病毒取2.5μg提取的重组克隆质粒DPVCHv-BAC-GΔUL55，常规方法转染到长成单层的DEF细胞中，37℃、5％CO2培养箱中培养4～6天，观察荧光空斑。收获细胞，反复冻融三次后，盲传三代以扩大病毒产量同时去除瞬时表达的质粒，收获并冻存病毒。5.3拯救重组病毒DPVCHv-BAC-GΔUL55的鉴定以拯救的DPVCHv-BAC-GΔUL55感染细胞DNA作为模板，用表6中的UL55基因缺失鉴定引物进行PCR扩增。同时以DPVCHv、DPVCHv-BAC-G感染DEF细胞DNA为模板进行扩增作为对照(图9)。电泳结果显示，拯救UL55基因缺失病毒只能扩增出UL55全基因缺失以后的502bp片段，而对应的DPVCHv、DPVCHv-BAC-G则能扩增出包括UL55基因在内的979bp片段。进一步用兔抗UL55多克隆抗体作为一抗，TRITC标记的羊抗兔作为二抗IFA检测UL55基因的表达情况，结果表明DPVCHv-BAC-GΔUL55不能检测到UL55基因的表达，而其亲本株DPVCHv-BAC-G中UL55基因正常表达，进一步证明UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55构建成功。6DPVCHv-BAC-GΔUL55R回复突变构建为构建DPVCHv-BAC-GΔUL55的回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R，设计通过线性打靶将两侧带UL55左右同源臂的UL55-Kana片段插入DPVCHv-BAC-GΔUL55重组病毒UL55基因缺失区域，再通过第二轮RED重组消除Kana抗性基因，获得恢复了UL55基因的回复株DPVCHv-BAC-GΔUL55R。6.1UL55-Kana线性打靶片段的获取根据DPVCHv和pKD4的序列设计两对引物，分别扩增UL55和kana序列，然后通过UL55基因下游引物和Kana基因上游引物5’端重叠互补部分，将UL55片段和Kana片段连接在一起，作为构建回复突变第一轮Red重组的线性打靶片段。为了进行RED同源重组打靶，设计UL55基因的上游引物和Kana基因的下游引物5’端包括UL55基因两侧50bp左右的同源臂。(1)UL55和kana基因片段的扩增、纯化：常规方法提取DPVCHv细胞DNA和pKD4质粒，作为PCR模板，用表6中的引物分别扩增UL55和kana基因片段，扩增体系和程序参照表2、表3。扩增完毕后，1％琼脂糖电泳鉴定并回收。将回收后的UL55和kana片段溶于灭菌水中，取少量适当稀释后在紫外分光光度计上测定回收片段浓度，其余4℃保存备用。(2)重叠PCR(splicingbyoverlappingextensionPCR,SOE-PCR)：加入等摩尔步骤(1)回收、纯化的UL55和kana基因片段作为模板，按照表7、表8的体系和程序利用UL55和kana片段的互补部分进行重叠延伸。将重叠好的UL55-kana基因片段作为模板，以UL55基因片段的上游引物和kana基因片段的下游引物作为引物再次进行PCR，使重叠产物的量扩大。第二次PCR的体系和程序如表9、表10所示。表7重叠PCR第一轮反应体系表8重叠PCR第一轮PCR反应条件表9重叠PCR第二轮反应体系表10重叠PCR第二轮PCR反应条件(3)UL55-Kana线性打靶片段的回收、纯化：将步骤(2)中经过两轮重叠PCR的UL55-Kana扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并进行胶回收、纯化回收片段，并测定浓度作为构建ΔUL55基因缺失株回复突变的同源臂打靶片段。6.2第一轮RED重组(将UL55-Kana重组到DPVCHv-BAC-GΔUL55基因组)电击转化打靶片段UL55-Kana至包含DPVCHv-BAC-GΔUL55和pKD46的DH10B中，在RED重组酶的作用下，带UL55同源臂的UL55-Kana片段成功重组到DPVCHv-BAC-GΔUL55基因组上。缺失鉴定引物扩增Kana替换前UL55基因区域片段长度为979bp，UL55基因缺失以后该区域长度为502bp，UL55-Kana替换后的目的区域片段长度为1895bp，与预期结果一致。6.3第二轮RED重组(去除Kana)Kana抗性基因的去除和本实施例4.1的方法一样，通过转化PCp20温度敏感性质粒介导第二轮RED重组消除kana抗性。PCR鉴定结果显示，UL55基因回复后，鉴定引物扩增UL55基因区域产生1063bp的片段(残余84bpFRT序列)，与预期结果一致，DPVCHv-BAC-GΔUL55R回复突变株构建成功(图10)。6.4RFLP分析用QiagenPlasmidMidiKit中量提取DPVCHv-BAC-G、DPVCHv-BAC-GΔUL55、DPVCHv-BAC-GΔUL55R质粒，各取1μg分别用EcoRI、BamHI酶切1-2h。所有25μl酶切产物全部上样，1％凝胶电泳20V、0.01A电泳16-17小时。电泳完成后，用10-20μlEB密闭染色2-3h，凝胶成像仪记录成像。结果显示DPVCHv-BAC-G和DPVCHv-BAC-GΔUL55R经BamHI、EcoRI酶切以后产生的条带无差异，且与预期的酶切谱图条带一致。相较而言，对应的UL55基因缺失株则在EcoRI酶切以后于4kb左右缺失了一条带、6kb左右增加了一个条带(图11A/B*)，BamHI的酶切分析结果则与DPVCHv-BAC-G、DPVCHv-BAC-GΔUL55R相同，与预期的酶切图谱完全一致。表明通过2轮RED重组成功地构建了UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和其回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R。6.5DPVCHv-BAC-GΔUL55/R的拯救及拯救病毒的鉴定转染提取的DPVCHv-BAC-GΔUL55R质粒到DEF细胞，拯救出能够产生病变的DPVCHv-BAC-GΔUL55R。并以此感染细胞的DNA作为模板，用UL55基因克隆引物进行PCR扩增。同时以DPVCHv、DPVCHv-BAC-G、DPVCHv-BAC-GΔUL55R感染DEF细胞DNA为模板进行扩增作为对照。电泳结果显示，拯救的UL55基因缺失回复株能扩增出包括UL55全基因和84bpFRT残留序列在内的879bp，对应的DPVCHv、DPVCHv-BAC-G则只能扩增出795bp的UL55基因、DPVCHv-BAC-GΔUL55则不能扩增出相应的条带。进一步用兔抗UL55多克隆抗体作为一抗，TRITC标记的羊抗兔作为二抗IFA检测UL55基因的表达情况(图12)，结果表明DPVCHv-BAC-GΔUL55不能检测到UL55基因的表达，而其亲本株DPVCHv-BAC-G和回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R中UL55基因正常表达，进一步证明UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R构建成功，UL55基因的表型得到了回复。7拯救重组病毒DPVCHv-BAC-GΔUL55、DPVCHv-BAC-GΔUL55/R的体外生物学特性分析7.1空斑试验参照实施例1的方法进行空斑试验，结果显示亲本毒CHv、拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G、UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R在感染宿主细胞DEF后，形成的空斑大小接近，形态也非常相似(图13A-D)。7.2一步生长曲线测定用0.02MOI拯救重组病毒DPVCHv-BAC-G、UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R感染DEF，在感染后的不同时间点收取细胞样品，测定病毒的滴度(图14A、B)。从图中可以看出，在感染后的前24h内，感染细胞的上清和细胞中都检测不到病毒含量的增加，说明其处于潜伏状态。在感染24h后，二者在上清和细胞中的含量都显著增加，到48h.p.i时细胞中的病毒不再增加，而上清中的含量却在持续增加，说明此时病毒的复制已经进入裂解释放时期。以DPVCHv-BAC-G为亲本株构建的UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55和UL55基因缺失回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R对细胞的感染力十分接近，且表现出相同的趋势，据此推测，UL55基因与病毒的复制及其对细胞的感染力无关。8DPVUL55基因与UL26.5的共定位情况分析8.1UL55与UL26.5在DPVCHv感染宿主细胞内的共定位为检测UL55和UL26.5蛋白在DPV感染宿主细胞中的共定位情况，设计用鼠抗UL55抗体和兔抗UL26.5抗体作为一抗进行IFA检测。常规方法制备DEF细胞细胞，并接种DPVCHv。感染后60h，取出种满细胞的爬片，按照间接免疫荧光方法进行操作。具体情况如表11所示。图15A-D所示，UL55蛋白在DPVCHv感染细胞60h后，聚集成荧光斑广泛分布于核周并有小部分存在于细胞核中。而UL26.5蛋白则形成耀眼的荧光斑广泛分布于细胞核及核膜附近(图15E-H)。二者的共定位情况显示UL55蛋白在DPVCHv感染细胞中的分布与UL26.5邻接并有小部分重叠(图15L黄色部分)。表11UL55与UL26.5在DPVCHv感染宿主细胞内的共定位分析8.2UL55蛋白对UL26.5蛋白在细胞内定位的作用分析为进一步分析UL55蛋白与UL26.5是否存在相互作用，设计用UL55基因缺失株DPVCHv-BAC-GΔUL55感染细胞，间接免疫荧光检测UL55基因缺失后UL26.5蛋白的定位情况，同时检测DPVCHv-BAC-GΔUL55亲本株DPVCHv-BAC-G和其回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R感染宿主细胞中UL26.5的分布情况作为对照。对感染细胞的处理和间接免疫荧光条件如表12所示。表12UL55蛋白对UL26.5蛋白在细胞内定位的作用分析从图14E-H可以看出，在UL55基因缺失株感染的DEF细胞中，UL26.5蛋白在感染细胞的细胞核中发出耀眼的荧光并与重组病毒EGFP基因表达发出的绿色荧光重合。相应地，UL55基因缺失亲本株DPVCHv-BAC-G和其回复突变株DPVCHv-BAC-GΔUL55R也观察到了相同的定位情况(图16A-D、I-L)。表明UL55基因缺失株编码的UL26.5蛋白与野毒株编码的UL26.5蛋白在宿主细胞内的定位无差异，UL26.5在宿主细胞内的定位尽管与UL55蛋白在空间结构上相邻并部分重叠，但是UL26.5蛋白的定位并不受UL55蛋白的影响。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。