技术领域本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白。
背景技术：
目前关于蚯蚓细胞色素P450基因的报道仅有本研究组发表在《上海交通大学学报》农业科学版2015年33卷第4期上的一篇论文蚯“蚓细胞色素P450基因的克隆及序列分析”。该论文采样RT-PCR法克隆到一条P450基因片段，长度为670bp。除此之外，国内外未见任何关于蚯蚓P450基因的报道。该文采用的RT-PCR法克隆的基因片段很短，其表达的氨基酸序列构成的蛋白质太过简单，虽具有P450的基本功能，但显然仅仅是该基因的一小部分片段。根据在其他动物上的经验，蚯蚓体内的P450基因应该有多条，而且片段长度一般应该比该文报道的片段要长，编码的蛋白质结构应该具有更完善的功能。因而，本发明在借鉴该文的基础上，重新设计了引物进行RT-PCR，并在此基础上进一步采用Race-PCR技术扩增出了更长的基因片段，其能编码功能较完善的蛋白质，推测得到的是一条相对较完整的蚯蚓细胞色素P450基因。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种蚯蚓细胞色素P450基因及其编码的蛋白。本发明采用的蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)，是一种最常用的养殖蚯蚓品种以及实验用蚯蚓品种，在全世界广泛使用，从其体内提取的基因具有代表性。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种蚯蚓细胞色素P450蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.16所示。第二方面，本发明提供一种编码所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因，其CDS序列如SEQIDNo.15所示。第三方面，本发明提供一种获得所述蚯蚓细胞色素P450蛋白的基因的方法，所述方法具体为：通过RT-PCR获得所述基因的片段序列，通过RacePCR获得所述基因的3’端序列；连接所述片段序列与所述3’端序列，即得；其中，所述片段序列如SEQIDNo.7所示；所述3’端序列如SEQIDNo.12所示。优选地，所述RT-PCR采用的简并引物对如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示。优选地，所述RT-PCR的反应体系共计40μl，具体如下：优选地，所述RT-PCR的反应条件如下：94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，反应一个循环，然后72℃恒温保存。优选地，所述RacePCR采用的上游引物对如SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11所示；下游引物采用OligodT。优选地，所述RacePCR的反应体系共计40μl，具体如下：优选地，所述RacePCR的反应条件为：94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：根据蛋白质结构中的几个螺旋结构，确定克隆到的是P450基因。本发明为继续进行蛋白质功能的研究，阐明蚯蚓机体的解毒机理以及其他动物P450基因的研究提供了参考，对于蚯蚓生态毒理学的理论和技术发展具有一定的促进作用。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为蚯蚓细胞色素P450基因的蛋白质三维结构模拟图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。1.RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)提取CYP450(细胞色素P450)基因1.1总RNA(核糖核酸)的提取采用生工总RNA提取试剂盒(B518621)，试剂用量和具体步骤具体如下：1)取10μlBuffer(缓冲液)A放入1.5ml离心管中，剪取约50mg蚯蚓放入离心管中，快速用剪刀剪碎。2)添加990μlBufferA，振荡混匀，室温静置3分钟。3)加入氯仿200μl，充分混匀，12000r，4℃离心5min。取上清。4)加入1/3体积无水乙醇，混合均匀，常温放置3min，12000r，4℃离心5min，弃上清。5)加入700μl的75％乙醇，12000r，4℃离心3min，去除上清。6)重复步骤5一次。7)室温倒置10min，晾干试管。加入50μlDEPC处理水溶解沉淀。-80℃保存。8)取2μl样品，通过电泳检测质量，并检测A260/A280的值。1.2cDNA反转录反转录体系如下：反转录条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。1.3引物设计用DNAMAN软件对Genbank上已知细胞色素P450序列进行比对，选择和蚯蚓比较接近的软体动物门物种如线虫、血吸虫等，并结合P450序列的保守区域(FxxGxxxCxG)设计引物如下：F1(SEQIDNo.1)：5’-AGATTGTTCTGGTCGCCA-3’；R1(SEQIDNo.2)：5’-CGGGTTCCTTGGGTCTAACT-3’；F2(SEQIDNo.3)：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’；R2(SEQIDNo.4)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；F3(SEQIDNo.5)：5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’；R3(SEQIDNo.6)：5’-CTCACTATAGGGCGAATTGG-3’。1.4PCR扩增反应体系如下：将配置好的PCR体系加入到含有已合成的cDNA的PCR管中，旋涡混匀。按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，反应一个循环，然后72℃恒温保存。1.5凝胶电泳检测及测序1)琼脂糖凝胶的制备：准确量取0.25g琼脂糖，添加25ml1×TAE，充分溶解，降温到60℃，吸取2.5μlGelRed，加到制胶板上，放置30min。2)把配制完全的1×TAE加到电泳槽内，以刚浸没胶板为宜。3)上样：分别取2.5μl样品和2.5μlLoadingBuffer混匀，加入胶孔中，再加入2KbDNAMarker5μl.110V跑胶30min。4)凝胶成像仪分析。5)经胶回收，质粒转化及蓝白斑筛选后，结果交于华大基因公司测序。结果得到了一段535bp的P450基因片段，与人的P45027家族同源性大于40％，证明了该片段是目的基因P450基因的一部分。其基因序列如下SEQIDNo.7所示：TTGGCCCAGATCCTAACACATTTAGAGGTATAGATTGTTCTGGTCGCCAATGCCATTAAAAAGTTAATTCATTCATTCTGGCCACTTCTATAACGCCCCTTCCAGTCCTCTACTACTCAGAGGCGCTCCCGACTACAGCACGGATACTGTATCGGAGTTTCACGCCGAAGCGCCACACGCAACTGTAGGTAAAGGACTTGCCGAAGTTTCCTACGTGGCGGCTAGAGCGGGAGTCGAACTCACGATCGTCCGGTTAAAAGTTATCGACTCAACCAATGCGCCACCACGTCCCACAATGCGCCACCACGTTATACCCAACAAAAGTTATACCTAAAATACCATGGGCACCCAAGGGGGTGGATACCACACCCCTGTCGTTTATCGACTATAACGTACATATTATGTATTTGCGAAATTAACATAGAAAGTAATTAGGCCATTCTTTAGAGGGAATGTGAGGCTACATTTTGCCTACTTATTLACTATTTTGGGGCGAAAACTGGAAGTGCGTATAGTTAGACCCAAGAACCCGGAC。2.采用RacePCR(巢式聚合酶链式反应)法扩增P450基因片段在上述克隆出的蚯蚓细胞色素P450基因片段的基础上，继续用RACE法克隆其3’端的片段，最终得到一条完整的蚯蚓CYP450基因。具体如下：2.1蚯蚓总RNA的提取：采用1.1提取的蚯蚓的总RNA。2.23’RACE特异性引物的设计根据获得的上述蚯蚓P450基因片段，使用Primer5.0软件，分别设计了2套特异性上游引物，用于扩增，下游引物选用了试剂盒自带的OligodT。RF11(SEQIDNo.8)：5’-CGGGTTCCTTGGGTCTAACT-3’；RF12(SEQIDNo.9)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；RF21(SEQIDNo.10)：5’-GTTTTCCCAGTCACGACG-3’；RF22(SEQIDNo.11)：5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’。2.3蚯蚓P450基因3’端的扩增cDNA反转录所使用的试剂盒由生物公司提供，反应条件根据说明书的条件优化获得，具体试剂量如下：反转录反应条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。2.4PCR扩增第一轮PCR扩增以试剂盒中含有的OligodT为下游引物与特异性上游引物来扩增；将第一轮扩增产物作为模板，以OligodT为下游引物与第二条特异性上游引物进行第二次扩增(巢式扩增)。PCR体系如下：将上述体系吸取到PCR管中，旋涡混匀。按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。巢式扩增两轮的试剂量和时间基本一致，以第一次得到的结果为母液，加入体系后开始新一轮扩增。2.5电泳检测及测序1)琼脂糖凝胶的制备：准确量取0.25g琼脂糖，添加25ml1×TAE，充分溶解，降温到60℃，吸取2.5μlGelRed，加到制胶板上，放置30min。2)把配制完全的1×TAE加到电泳槽内。3)上样：分别取2.5μl样品和2.5μlLoadingBuffer混匀，加入胶孔中，再加入2KbDNAMarker5μl.110V跑胶30min。4)凝胶成像仪分析。5)将目的条带回收，转移载体和大肠杆菌培养后，进行结果检查并到基因公司进行测序。结果获得蚯蚓P4503’端序列如下SEQIDNo.12所示：TAAGGTTATTCATTGTACAATGCCAATAGGTGCTCGATCCTGTTTCAACGACACCGTGAACATTCCAAGAGATGATAAGTTAAAGCTACCTGGAGGTCGATTTGGATTGTATGCAGTGCACCAGCTCTTTACTTACCTGGCAGCTCACCCCAGCCCGGAAATCACAAAGTCCATGTCAGATACAAGTTCTTTATTGTATCGATTTACTCTAATGTTCCATGAGACACCAGACGCAATACATCGAACAGAACTGCCCCACATTGCTCATGCAGCCGGGAGCCTCACACTCACTTGGCCTGCAAACTTCTCTCTGGCGGAACAGACGGAAAATATGCAAAGAGAGGAGGCCTATGCTAGCGTTGTGCCCTTCGGCTTACAAGAGGCAATGACGGTAGCTGGTCGTTTGGCATTCGAAAGGGCTATGCTCATTTTCAACAAACAACTTTCAACCGTTTGGAATGTGACACCAAAACTTCTGCTTGATATTATCCAGTCCGTT(共计499bp)。3.蚯蚓P450全长序列的克隆与分析根据上面两部分所获得的序列设计引物，同时以第一部分中提取到的总RNA为模板，进行全长P450序列的cDNA合成和PCR扩增。上游引物(SEQIDNo.13)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；下游引物(SEQIDNo.14)：5’-CTCACTATAGGGCGAATTGG-3’。3.1cDNA第一链的合成反应体系如下：反转录反应条件为：30℃反应10min，然后55℃30min，99℃5min，5℃5min。3.2PCR反应反应体系如下：将配置好的PCR体系加入到含有已合成的cDNA的PCR管中，旋涡混匀。按以下条件进行PCR反应：在94℃反应2min，运行一个循环；94℃，30sec；54℃30sec；72℃1min，反应38个循环；72℃，5min，一个循环，然后72℃恒温保存。3.3电泳与测序。反应完成后，吸2.5μl结果进行琼脂糖凝胶电泳，将检测结果在凝胶成像仪上拍照分析。结果显示，PCR产物的特异性非常好，可经过胶回收、载体连接、转化大肠杆菌等步骤后测序。3.4蚯蚓CYP450基因序列上述克隆得到的蚯蚓P450序列总共1033bp，表达344个氨基酸。使用DNAMAN软件推测获得该序列的氨基酸基本组成：预测蛋白含有细胞色素P450的特征序列，包括血红素结合区域FXXGXXXCXG，P450蛋白活性位点螺旋I；位于螺旋C中与亚铁结合有关的序列WxxxR；位于螺旋K中的序列ExxR，这是所有P450蛋白中最容易识别的序列，其结构特征基本不变。其基因(如SEQIDNo.15所示)与氨基酸序列(如SEQIDNo.16所示)如下：TTGGCCCAGATCCTCACACATTTACAGGTATAGATTGTTCTGGTCGCCAATGCCATTAAAWPRSGHINRYRLFWSPMPLKAAGTTTATTCATTCATTCTGGCCACTTCTATAACGCCCCTTCCAGTCCTCTACTACTCAGSPFIHSGHFYNAPSSPLLLRAGGCGCTCCCGACTACAGCACGGATACTGTATCGGAGTTTCACGCCGAAGCGCCACACGCGAPDYSTDTVSEFHAEAPHAAACTGTAGGTAAAGGACTTGCCGAAGTTTCCTACGTGGCGGCTAGAGCGGGAGTCGAACTTVGKGLAEVSYVAARAGVELCACGATCGTCCGGTTAAAAGTTATCGACTCAACCAATGCGCCACCACGTCCCACAATGCGTIVRLKVIDSTNAPPRPTMRCCACCACGTTATACCCAACAAAAGTTATACCTCAAATACCATGGGCACCCAAGGGGGTGGHHVIPNKSYTGNTMGTQGGGATACCACACCCCTGTCGTTTATCGACTAAAACGTACATATTATGTATTTGCGAAATTAACYHTPVVYRLKRTYYVFAKLTATGGAAAGTAATTAGGCCATTCTTTAGAGGGAATGTGAGGCTACATTTTGCCTACTTATTWKVIRPFFRGNVRLHFAYLLACTATTTTGGGGCGAAAACTGGAAGTGCGTATCGTTAGACGGAAGAACCCGGACTAAGGTLFWGENWKCVVLDERTRTKVTATTCATTGTACAATGCCAATAGGTGCTCGATCCTGTTTCAACGACACCGTGAACATTCCIHCTMPIGARSCFNDTVNIPAAGAGATGATAAGTTAAAGCTACCTGGAGGTCGATTTGGATTGTATGCAGTGCACCAGCTRDDKLKLPGGRFGLYAVHQLCTTTACTTACCTGGCAGCTCACCCCAGCCCGGAAATCACAAAGTCCATGTCAGATACAAGFTYLAAHPSPEITKSMSDTSTTCTTTATTGTATCGATTTACTCTAATGTTCCATGAGACACCAGACGCAATACATCGAACSLLYRFTLMFHETPDAIHRTAGAACTGCCCCACATTGCTCATGCAGCCGGGAGCCTCACACTCACTTGGCCTGCAAACTTELPHIAHAAGSLTLTWPANFCTCTCTGGCGGAACAGACGGAAAATATGCAAAGAGAGGAGGCCTATGCTAGCGTTGTGCCSLAEQTENMQREEAYASVVPGTATGCAGTGCACCAGAAACAACTTTCAACCGTTTGGAATGTGACACCACCAATACCTTTYAVHQKQLSTVWNVTPPIPFCTCTCTGGGTGCTCGATCCTGTCCTGGAGGTCGATTTGCAAACAAACTTCTGCTTGATATSLGARSCPGGRFANKLLLDITATCCAGTCCGTTIQSV5.蚯蚓P450基因的蛋白同源模拟应用网络蛋白模拟软件Phyre2，以Fasta格式输入蚯蚓P450的氨基酸序列，在该数据库已登录的三维结构中，发现与其同源性最高的属于CYP45027B，其中与人体内已知的CYP27B(P08684)家族同源性最高，三维结构相似度高达97％；而与黑猩猩的CYP27B家族(P05183)三维结构相似度为95％；与小鼠的CYP24A1的相似度为66％(c3k9vb)；与青鱂鱼的CYP26B1(q98t91)相似度为77％。由此可推断，该蚯蚓序列属于CYP45027家族。该蛋白质具有其他动物P450蛋白所具有的解毒功能，对进入体内的外源性化合物进行生物转化，对机体具有保护作用。综上所述，本发明基于现有技术获得P450基因片段普遍较小的缺陷，创造性地设计了引物进行RT-PCR，并在此基础上进一步采用Race-PCR技术扩增出了更长的基因片段，其能编码功能较完善的蛋白质，一条相对较完整的蚯蚓细胞色素P450基因。根据蛋白质结构中的几个螺旋结构，确定克隆到的是P450基因。本发明为继续进行蛋白质功能的研究，阐明蚯蚓机体的解毒机理以及其他动物P450基因的研究提供了参考，对于蚯蚓生态毒理学的理论和技术发展具有一定的促进作用。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。