技术领域本发明属于淋巴细胞氧化应激模型技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激模型的构建方法。
背景技术：猪圆环病毒2型(PCV2)感染引发的猪圆环病毒病已成为影响全球养猪业的重大疾病，带来了巨大的经济损失。PCV2病毒复制的主要场所是机体的单核-巨噬细胞和抗原提呈细胞，PCV2感染后，病猪体内肺、肝、肾、扁桃体、胸腺、外周血单核细胞、支气管淋巴结、腹股沟淋巴结中均能检测到PCV2病毒核酸，PCV2感染的主要表现为淋巴细胞缺失和单核细胞浸润等。因此引起猪免疫系统的破坏，免疫能力受到抑制。PCV2增殖的主要场所是B淋巴细胞，B淋巴细胞也在PCV2感染后诱导了淋巴细胞的凋亡，引起免疫抑制。PCV2感染动物机体过程中，主要造成宿主淋巴细胞和单核细胞缺失，进而导致免疫抑制性疾病。对PCV2感染宿主后在宿主体内感染的分布研究显示，PCV2以T淋巴细胞、B淋巴细胞、外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞等免疫细胞为靶细胞。然而，关于PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变还缺乏认识，亟待进一步研究。目前，常用H2O2建立细胞氧化应激模型，但H2O2在细胞培养液中代谢较快，浓度不稳定，造模效果的可控性较差。
技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种构建方便、成本较低、实用性强的猪圆环病毒2型体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激模型的构建方法，为研究PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供较理想的体外模型。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：猪圆环病毒2型体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激模型的构建方法，采用猪圆环病毒2型体外感染猪脾淋巴细胞，病毒滴度为104TCID50/0.1mL，感染时间为4-48h。感染剂量为1mLPCV2病毒液，感染时间为4-24h。上述猪圆环病毒2型体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激模型的构建方法，包括以下步骤：(1)猪脾淋巴经分离培养后，调整细胞浓度为1×106cell/mL备用；(2)设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI1640培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别收样；(3)收样用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相关指标的测定。分离培养后活细胞数＞95％。PCV2病毒感染组分为5个不同浓度，分别是100、10-1、10-2、10-3、10-4PCV2。收样时间分别为第4h、8h、12h、24h、48h。细胞氧化还原状态相关指标为细胞活性、细胞NO分泌水平、ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG含量及XOD、MPO、iNOS活性。发明人利用猪脾淋巴细胞设计并建立了一种猪圆环病毒2型体外诱导猪脾淋巴细胞氧化应激模型的构建方法，该法设置细胞对照组和PCV2病毒感染组，加入RPMI1640培养液及相应浓度病毒液，与细胞吸附2h后弃液，加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别收样，用于细胞活性及与细胞氧化还原状态相关指标的测定。本发明系首次使用猪圆环病毒2型(PCV2)作为诱因建立猪脾淋巴细胞氧化应激模型，并首次使用NO分泌水平、ROS水平、T-GSH、GSH、GSSG含量等指标作为氧化应激的相关评价指标。该模型具有构建方便、成本较低、实用性强等特点，它为研究PCV2感染是否能引起免疫细胞氧化还原状态的改变及其作用机制提供了较理想的体外模型，进而将有可能为PCV2感染引起的动物疾病的治疗提供一些新思路。按照本发明的培养条件和方法，能够帮助初次进行PCV2猪脾淋巴细胞氧化应激研究的人员较顺利的建立猪脾淋巴细胞氧化应激模型。应用本发明，发明人还确定了PCV2的最佳感染浓度和孵育时间及猪脾淋巴细胞氧化应激最适孵育时间。附图说明图1是PCV2感染对猪脾淋巴细胞存活率的变化图。图2是PCV2感染猪脾淋巴细胞对NO分泌的变化图。图3是PCV2感染猪脾淋巴细胞对ROS水平的变化图。图4是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞内GSH的变化图。图5是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞内GSSG的变化图。图6是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞内GSH/GSSG的变化图。图7是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞XOD活性的变化图。图8是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞MPO活性的变化图。图9是PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞iNOS活性的变化图。图2至图9中：时间轴上同一时间点对应的各柱状图从左到右分别为细胞对照组，PCV2稀释10000倍，PCV2稀释1000倍，PCV2稀释100倍，PCV2稀释10倍。具体实施方式一、研究思路本发明通过PCV2感染猪脾淋巴细胞，测定病毒感染后细胞分泌一氧化氮(NO)的水平、细胞内总活性氧(ROS)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性、髓过氧化物酶(MPO)活性、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性，探讨PCV2病毒感染量、感染时间与活性氧水平动态变化的相关性，建立猪脾淋巴细胞氧化应激体外模型。二、实验方法(1)猪脾淋巴细胞的分离培养：猪脾脏于灭菌PBS中洗两遍，玻璃注射器芯研磨脾脏，200目滤网过滤收集细胞。Tris-NH4Cl裂解红细胞后，PBS洗2遍，10％-FBS-RPMI1640洗一遍，重悬细胞，台盼蓝拒染法计数活细胞数＞95％，调节细胞浓度为1×106cell/mL，加入24孔板，900μL/孔，37℃，5％CO2培养。(2)分别设置细胞对照组和5个不同浓度PCV2病毒感染组(100、10-1、10-2、10-3、10-4)，每组4个重复，按1000μL/孔加至24孔板内，培养过夜使细胞贴壁后弃去培养液，PBS缓冲液洗3次，细胞对照组加入无血清RPMI1640培养液500μL，病毒组加入等量用不含血清的RPMI1640培养液稀释的不同浓度病毒液，37℃，5％CO2培养箱中吸附2小时，弃去病毒液，PBS缓冲液清洗3次后每孔加入1mL含5％FBS的RPMI1640培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、48h收样，用于后续指标测定。(3)细胞活性的测定：细胞培养44h后吸出110μL上清，加入10μL5g/LMTT继续培养，4h后弃上清，加入100μLDMSO，室温避光静置10min，以酶联免疫检测仪检测OD450nm。(4)Griess法检测上清中NO含量：细胞分别培养4h、8h、12h、24h、48h后，取各孔上清各100μL，加入等量Griess试剂，充分混匀，酶联免疫检测仪检测OD450nm，根据标准曲线回归方程计算NO含量。表1标准曲线的制作(单位：μL)(5)DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平：细胞分别培养4h、8h、12h、24h、48h，弃上清，24孔板内每孔加入DCFH-DA探针500μL，培养箱内避光孵育30min后0.01MPBS洗3次，再加入1000μLPBS，用细胞刮刀将细胞刮下，吹匀后，每孔取200μL于96孔黑板中，于荧光酶标仪测定其荧光值(激发波长488nm，发射波长525nm)。(6)OPT荧光法检测细胞内GSH与GSSG含量：细胞处理后分别于4h、8h、12h、24h、48h用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集细胞，加入5％三氯醋酸400μL，冰水浴超声破碎1min，4℃，12000g离心15min，取上清分装于-80℃保存。按以下操作检测GSH与GSSG含量。(7)细胞内T-GSH、GSH、GSSG含量及XOD、MPO、iNOS活性的检测：细胞处理后，分别于4h、8h、12h、24h、48h后弃上清收集细胞，2000rpm×5min离心弃上清，PBS洗3次，再加入500μLPBS，超声破碎，10000g×10min离心取上清液，用于XOD、MPO、iNOS活性的检测。(8)实验数据采用SSP18.0统计软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，Duncan组间比较，结果以表示。肩标*表示与对照组相比P＜0.05，肩标**表示与对照组相比P＜0.01。三、实验结果<a>不同浓度PCV2体外感染对猪脾淋巴细胞活性的影响(图1)如图1显示，各浓度的PCV2感染猪脾淋巴细胞活性均有一定程度降低，但与细胞对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。<b>不同浓度PCV2体外感染猪脾淋巴细胞对NO分泌的影响(图2)如图2显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞8h、12h、24h、48h均升高细胞分泌NO水平，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h升高细胞分泌NO水平，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。结果表明，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞能促进细胞分泌NO。<c>不同浓度PCV2体外感染猪脾淋巴细胞对ROS产生的影响(图3)图3显示，PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h、48h后，ROS水平随时间逐渐先升高后降低。10-1、10-2PCV2感染细胞4h、12h、24h、48h升高细胞内ROS水平，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-3PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、24h升高细胞内ROS水平，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)；10-3PCV2感染细胞48h、10-4PCV2感染细胞24h、48h升高细胞内ROS水平，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)。<d>PCV2体外感染猪脾淋巴细胞对细胞内氧化还原状态的影响(图4、图5、图6)图4显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h降低细胞内GSH水平，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞12h降低细胞内GSH水平，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。图5显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h及10-2PCV2感染猪脾淋巴细胞12h均升高细胞内GSSG水平，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞24h、48h及10-2PCV2感染猪脾淋巴细胞24h均升高细胞内GSSG水平，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。图6显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、48h降低感染细胞内GSH/GSSG比值，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-2PCV2感染4h降低感染细胞内GSH/GSSG比值，与细胞对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。<e>不同浓度PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞XOD活性的影响(图7)图7显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h升高感染细胞XOD活性，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)，感染48h升高XOD活性水平与细胞对照组相比存在显著性差异(P＜0.05)；10-2PCV2感染猪脾淋巴细胞8h、12h、48h及10-3PCV2感染猪脾淋巴细胞8h、48h均升高感染细胞XOD活性，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-4PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h升高感染细胞XOD活性，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。<f>不同浓度PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞MPO活性的影响(图8)图8显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h、48h均升高感染细胞MPO活性，4h、12h、24h、48h升高水平与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)，8h升高水平与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)；10-2PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、24h、48h及10-4PCV2感染细胞4h均升高感染细胞MPO活性，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。<g>不同浓度PCV2感染猪脾淋巴细胞对细胞iNOS活性的影响(图9)图9显示，10-1PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h升高感染细胞iNOS活性，4h、8h、12h升高水平与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)，24h升高水平与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-2PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h升高感染细胞iNOS活性，与细胞对照组比较存在极显著差异(P＜0.01)；10-3PCV2感染猪脾淋巴细胞4h、8h、24h升高升高感染细胞iNOS活性，与细胞对照组比较存在显著性差异(P＜0.05)。四、研究结论在本实验研究中，将原代猪脾淋巴细胞与PCV2病毒液体外胞共同培养2h后，利用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察PCV2特异性扩增条带。结果显示，PCV2病毒感染后8h-48h均检测到特异性条带，其中感染后8h、12h检测到强特异性条带。提示PCV2成功感染原代猪脾淋巴细胞。为了探讨不同剂量的PCV2感染猪脾淋巴细胞不同时间，对猪脾淋巴细胞内氧化还原状态是否有影响，观察了PCV2感染猪脾淋巴细胞后对细胞NO、ROS、GSH、GSSG水平及MPO、XOD、iNOS活性的影响。结果表明，10-1PCV2感染原代猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h、48h均显著升高细胞分泌NO水平和细胞内GSSG水平，10-1PCV2感染原代猪脾淋巴细胞12h、24h、48h显著升高细胞产生ROS水平，感染12h显著降低GSH水平，感染后4h、8h、12h、48h显著降低细胞GSH/GSSG比值。对相关酶活性的影响显示，10-1PCV2感染原代猪脾淋巴细胞4h、8h、12h、24h均显著上调细胞XOD、MPO、iNOS活性。提示10-1PCV2体外成功感染猪原代脾淋巴细胞，且一定程度上改变了细胞内的氧化还原状态，诱导细胞产生氧化应激。因此，本发明成功建立猪圆环病毒2型体外感染猪脾淋巴细胞氧化应激模型，选择10-1PCV2作为该模型的感染浓度(病毒滴度为104TCID50/0.1mL)，感染时间(氧化应激最适孵育时间)确定为4h～24h。