技术领域本发明属于酿酒技术领域，特别涉及一种多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法。
背景技术：
固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的新技术，即利用化学或物理手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越性，而且比固定化酶有更多的优点，比如：它免除了破碎细胞来提取胞内酶的手续，降低制备成本；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快，抗污染能力强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低；酶在细胞内的环境中稳定性较高，完整细胞固定化后，酶活力的损失较少等。固定化细胞技术虽然具有广阔的应用前景，但大多是在实验室规模上进行研究，要真正实用化或工业应用，还有以下问题需要解决：1)固定化细胞的稳定性问题，由于固定化的材料对微生物的毒性、固定化条件、固定化过程中的放热等都对细胞有影响而使部分细胞失活；2)固定化细胞批量生产装置的开发，这是固定化细胞技术从实验室走向实际应用的重要一步；3)廉价耐用的固定化载体及复合固定化技术的研究与开发；4)高效固定化反应器的开发。当前，固定化细胞技术的生产能力和在工业上应用的可行性，在很大程度上取决于反应器的构造。因此，这些问题的成功解决，特别是固定化细胞批量生产装置，即固定化细胞生物反应器的开发对于固定化细胞技术在工业上的广泛应用将起到极大地促进作用，并将显著提高工厂的生产效率和节约生产成本，从而有力地提高我国产品的竞争力。现有的固定化细胞发酵中，一般采用单一菌株菌株纯种或者是限定菌株混合发酵，其采用的生物反应器是结构复杂的密闭容器固态发酵反应器，其存在的缺点是发酵过程中传质效率低，发酵结束后需要通过人工对反应器进行搬运，设备投资大，操作能耗高，很难实现连续化生产，尤其是针对多轮次发酵，其操作强度和难度都较大，很难满足多轮次发酵的需求。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多孔磁性容器装有固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，无论是时间还是空间上，物料上的生命活动均呈现立体多样性，能反复活化使用实现固定化细胞重复利用，进而实现连续化生产的目的，发酵过程中满足充分的接触时间和接触面积，具有高传质效率，能进行多轮次发酵，操作简单方便。本发明的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入耐腐蚀的多孔磁性容器中；c.将装有固定化细胞碳纤维球的多孔磁性容器放入发酵设备中发酵，发酵结束后通过电动磁力从发酵设备中吸取出多孔磁性容器经活化后进行下轮次发酵；进一步，步骤b中，所述多孔磁性容器为表面均布有通孔的马氏体不锈钢空心球，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球空心体积的80-90％；进一步，步骤b中，所述不锈钢空心球为两个大小匹配的两半球以可拆卸式固定连接构成容纳固定化细胞碳纤维球的腔体，所述不锈钢空心球直径为10-15cm，所述碳纤维球的直径为0.6-2cm；进一步，步骤b中，所述不锈钢空心球的两半球为螺纹连接，所述两半球中的一个半球开口外缘部表面设置有外螺纹，另一半球的开口内缘部表面设置有内螺纹；进一步，步骤a中，所述产酸菌为己酸菌和丁酸菌，所述固定化细胞碳纤维球的制备方法包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.3-0.5g、(NH4)2SO40.4-0.6g、CH3COONa5-10g、MgSO40.2-0.4g、酵母膏1-3g、CaSO45-10g、蒸馏水800-1200ml；将上述原料混合后在温度为115-121°下灭菌15-30分钟，然后冷却至70°以下，最后加入15-20ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以2-15g/L的投入量与发酵培养基混合后以10-20％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，然后放置于摇床中摇动2-6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球。进一步，步骤a1中，所述无菌预处理包括以下步骤：将碳纤维置于丙酮中浸泡3～5h，过滤回收上清液，用相当于3～5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理3～5h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；进一步，步骤a3中，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1-2；进一步，所述碳纤维为长度为0.3-0.8cm的短切碳纤维；进一步，步骤c中，将不锈钢空心球以8-12个/m2放入窖池的上层、中层或下层，发酵结束后通过电动磁力吊从发酵设备中吸取出不锈钢空心球；进一步，步骤c中，所述发酵设备为窖池，在温度为85-95°下活化处理,5-15分钟后进行下轮次发酵。本发明的有益效果：本发明的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，利用碳纤维可控成球的特点，将发酵菌体混入碳纤维球中，形成以碳纤维为载体的固定化细胞碳纤维球，具有总表面积大、抗拉强度高、发酵稳定性好的特点，通过将固定化细胞碳纤维球装填于表面均布有通孔的具有防酸碱、耐腐蚀和磁性的马氏体不锈钢空心球中后与窖池等发酵设备的环境配合进行半连续型发酵，混合效果好，发酵过程中满足充分的接触时间和接触面积，具有高传质效率，能进行多轮次发酵，无论是时间还是空间上，物料上的生命活动均呈现立体多样性，能反复活化使用实现固定化细胞批量生产，进而实现连续化生产的目的，发酵结束后只需通过电动磁力吊从窖池等发酵设备中取出不锈钢球，经过短暂的活化后又可进行下轮次发酵，简化操作步骤，节约劳动力，同时提高生产效率。附图说明下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：图1为本发明的不锈钢空心球结构示意图。具体实施方式本实施例的磁性多孔生物反应器多轮次发酵固定化细胞碳纤维球的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入多孔磁性容器中；c.将装有固定化细胞碳纤维球的多孔磁性容器放入窖池等发酵设备中进行发酵，发酵结束后通过电动磁力从窖池等发酵设备中吸取出多孔磁性容器经活化后进行下轮次发酵；利用碳纤维可控成球的特点，通过物理吸附法使双菌细胞吸附在碳纤维表面固定，形成以碳纤维为载体的固定化细胞碳纤维球，具有总表面积大、抗拉强度高、发酵稳定性好的特点，通过将固定化细胞碳纤维球装填于具有防酸碱、耐腐蚀和磁性的多孔磁性容器中进行半连续型发酵，混合效果好，发酵过程中满足充分的接触时间和接触面积，具有高传质效率，能进行多轮次发酵，无论是时间还是空间上，物料上的生命活动均呈现立体多样性，能反复活化使用实现固定化细胞批量生产，进而实现连续化生产的目的，发酵结束后只需通过电动磁力吊从窖池等发酵设备中取出不锈钢球，经过短暂的活化后又可进行下轮次发酵，简化操作步骤，节约劳动力，同时提高生产效率。本实施例中，步骤b中，所述多孔磁性容器为表面均布有通孔的马氏体不锈钢空心球1，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的80-90％；马氏体不锈钢空心球1具有具有防酸碱、耐腐蚀和被磁性材料吸取的特点，马氏体不锈钢空心球1表面的均布的通孔是产酸菌细胞吸收环境中营养物质和进行传质的通道，确保固态发酵过程中的宏观传质过程与微观传质效率高，根据不锈钢空心球1的容腔大小装填若干个碳纤维球，碳纤维球之间的间隙形成传质通道，使传质更均匀，发酵更充分，在发酵结束后，只需通过电动磁力设备(如电动磁力吊)将不锈钢空心球1吸取出来，无需人工搬运，效率高，节约劳动力，又不影响窖池的环境，将取出的不锈钢空心球经直接经活化处理后又可进入下轮次发酵。本实施例中，步骤b中，所述不锈钢空心球1为两个大小匹配的两半球以可拆卸式固定连接构成容纳固定化细胞碳纤维球的腔体，所述不锈钢空心球1直径为10-15cm，所述碳纤维球的直径为0.6-2cm；可拆卸式固定连接构成容纳固定化细胞碳纤维球的腔体方便补料，确保半连续型发酵的进行，碳纤维球的直径直接影响物质的扩散通量，影响发酵过程中最高效的传质效率，因此，碳纤维球的直径过大或过小都不利于物质的扩散，进而影响传质效率，只有将不锈钢空心球1的大小与碳纤维球的大小相匹配才能保证物质间扩散流通速度，进而达到最高的传质效率。本实施例中，所述不锈钢空心球1的两半球为螺纹连接，所述两半球中的一个半球开口外缘部表面设置有外螺纹，另一半球的开口内缘部表面设置有内螺纹；结构简单，易于操作，可重复利用，设备利用率高。本实施例中，步骤a中，所述产酸菌为己酸菌和丁酸菌，所述固定化细胞碳纤维球的制备方法包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.3-0.5g、(NH4)2SO40.4-0.6g、CH3COONa5-10g、MgSO40.2-0.4g、酵母膏1-3g、CaSO45-10g、蒸馏水1000ml；将上述原料混合后在温度为115-121°下灭菌15-30分钟，然后冷却至70°以下，最后加入15-20ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以2-15g/L的投入量与发酵培养基混合后以10-20％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，然后放置于摇床中摇动2-6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；采用双菌发酵，步骤a2中，优先为发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.4g、(NH4)2SO40.5g、CH3COONa8g、MgSO40.3g、酵母膏2g、CaSO47g、蒸馏水800-1200ml；将上述原料混合后在温度为115°下灭菌20分钟，然后冷却至70°以下，最后加入18ml的无水乙醇。本实施例中，步骤a1中，所述无菌预处理包括以下步骤：将碳纤维置于丙酮中浸泡3～5h，过滤回收上清液，用相当于3～5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；优选为：将碳纤维置于丙酮中浸泡4h，过滤回收上清液，用相当于4倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后经蒸馏水清洗干净。本实施例中，步骤a3中，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1-2；优选为接种比例为1:1或1：2。本实施例中，所述碳纤维为长度为0.3-0.8cm的短切碳纤维；热稳定性好，机械强度高，提高负载物相对活动产率，确保细胞活性不会减少。本实施例中，步骤c中，将不锈钢空心球1以8-12个/m2放入窖池上中层，发酵结束后通过电动磁力吊从窖池中吸取出不锈钢空心球；发酵结束后通过电动磁力吊从窖池中吸取出不锈钢空心球可直接放入活化池中活化，避免人工操作造成的干扰和影响；窖池每1m2放置不锈钢空心球18-12个，优选为以10个/m2放入窖池上层、中层或下层；窖池等发酵设备不锈钢空心球的布置使不锈钢空心球之间形成有效的传质通道，保证发酵设备内不锈钢空心球1内生物体的自动调节和发酵气体产物的排出，使固态发酵过程中的宏观传质过程与微观传质效率高。本实施例中，步骤c中，在温度为85-95°下活化处理5-15分钟后进行下轮次发酵；优选为在温度为90°的水池中活化处理10分钟后进行下轮次发酵。下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。实施例一本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.3cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡3h，过滤回收上清液，用相当于3倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理3h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.3g、(NH4)2SO40.4g、CH3COONa5g、MgSO40.2g、酵母膏1g、CaSO45g、蒸馏水1000ml；将上述原料混合后在温度为115°下灭菌30分钟，然后冷却至70°，最后加入15ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以2g/L的投入量与发酵培养基混合后以5％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1；然后放置于摇床中摇动2小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为10cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的80％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以8个/m2放入窖池上中层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力吊从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为85°下活化处理12分钟后进行下轮次发酵。实施例二本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.8cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡5h，过滤回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理5h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.5g、(NH4)2SO40.6g、CH3COONa10g、MgSO40.4g、酵母膏3g、CaSO410g、蒸馏水1200ml；将上述原料混合后在温度为121°下灭菌15分钟，然后冷却至68°，最后加入20ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以15g/L的投入量与发酵培养基混合后以10％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:2；然后放置于摇床中摇动6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为15cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的90％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以12个/m2放入窖池上层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力吊从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为95°下活化处理5分钟后进行下轮次发酵。实施例三本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.4cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡3h，过滤回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理3h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.3g、(NH4)2SO40.6g、CH3COONa5g、MgSO40.4g、酵母膏1g、CaSO410g、蒸馏水1200ml；将上述原料混合后在温度为118°下灭菌30分钟，然后冷却至68°，最后加入15ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以15g/L的投入量与发酵培养基混合后以5％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1.5；然后放置于摇床中摇动6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为10cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的80％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以12个/m2放入窖池上中层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力设备从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为90°下活化处理10分钟后进行下轮次发酵。实施例四本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.8cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡3h，过滤回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理3h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.5g、(NH4)2SO40.4g、CH3COONa10g、MgSO40.2g、酵母膏3g、CaSO45g、蒸馏水1200ml；将上述原料混合后在温度为116°下灭菌20分钟，然后冷却至60°以下，最后加入20ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以2g/L的投入量与发酵培养基混合后以10％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1.8；然后放置于摇床中摇动6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为15cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的80％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以12个/m2放入窖池中层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力设备从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为85°下活化处理15分钟后进行下轮次发酵。实施例五本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.7cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡4h，过滤回收上清液，用相当于3倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理5h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.4g、(NH4)2SO40.4g、CH3COONa10g、MgSO40.4g、酵母膏2g、CaSO47g、蒸馏水1100ml；将上述原料混合后在温度为115°下灭菌25分钟，然后冷却至60°，最后加入19ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以2g/L的投入量与发酵培养基混合后以7％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:1.2；然后放置于摇床中摇动6小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为13cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的81％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以8个/m2放入窖池上中层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力设备从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为88°下活化处理13分钟后进行下轮次发酵。实施例六本实施例的多孔磁性容器包裹固定化细胞碳纤维球进行多轮次发酵的方法的方法，包括以下步骤：a.将产酸菌细胞固定于碳纤维载体形成固定化细胞碳纤维球：具体包括以下步骤：a1.将碳纤维经杀菌清洗预处理：碳纤维为长度为0.5cm的短切碳纤维，将碳纤维置于丙酮中浸泡4h，过滤回收上清液，用相当于4倍碳纤维体积的水对碳纤维进行清洗，然后将清洗后的碳纤维浸泡于体积大于6倍碳纤维体积的沸水浴中处理4h后经蒸馏水清洗干净，最后烘干；a2.配置发酵培养基：所述发酵培养基的原料包括以下组分：K2HPO40.4g、(NH4)2SO40.5g、CH3COONa8g、MgSO40.3g、酵母膏2g、CaSO47g、蒸馏水1000ml；将上述原料混合后在温度为115°下灭菌25分钟，然后冷却至65°，最后加入18ml的无水乙醇；a3.将经处理的碳纤维以8g/L的投入量与发酵培养基混合后以8％的总接种量快速接种己酸菌和丁酸菌，己酸菌和丁酸菌的接种比例为1:2；然后放置于摇床中摇动4小时，制得大小均匀的固定化细胞碳纤维球；b.将固定化细胞碳纤维球装入表面均布有通孔2的直径为为12cm的马氏体不锈钢空心球1中，所述固定化细胞碳纤维球的装填量不超过不锈钢空心球1空心体积的85％；c.将装有固定化细胞碳纤维球的不锈钢空心球1以10个/m2放入窖池下层进行发酵，发酵结束后通过电动磁力设备从窖池中吸取出不锈钢空心球1在温度为90°下活化处理10分钟后进行下轮次发酵。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。