一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性革E药的制备方法，属于磁性纳米复合材料制备技术领域。
【背景技术】
[0002]据文献记载(Adv.Drug Del.Rev.，2008, 60, 1252-1265.)，适合在生物相关领域应用的磁性纳米复合物需要具备四个基本特征:合适的颗粒尺寸、生物相容性、超顺磁性和高磁响应性及功能化的表面。功能化的表面是指颗粒表面有能够和生物分子接枝、形成共价键的官能团或功能基，以保证接枝后的磁性纳米复合物在生物体内输运过程中的稳定性。
[0003]磁性颗粒是否适合在生物体内应用，颗粒尺寸至关重要。颗粒尺寸过小，容易被肾脏清除；颗粒尺寸过大，容易被网状内皮组织吞噬；因此，合适的颗粒尺寸为30?150nm(J.Phys.D:Appl.Phys.2009, 42, 224003-1-9 ；Histochem.Cell B1l., 2008, 130, 845-875.)。对于磁性晶粒，磁响应性和超顺磁性都具有尺寸依赖性。以Fe3O4晶粒为例，在结晶度相似的情况下，磁响应性随着晶粒尺寸的增大而增高；但是，具有超顺磁性的Fe3O4晶粒的尺寸范围为 20 ?30nm(Angew.Chem.1nt.Ed.，2007, 46，4342-4345.)。若颗粒在溶液中分散性较好(类单分散)，由于晶粒尺寸较小，受布朗运动作用力的影响，此类磁性纳米粒子在外加磁场作用下很难从溶液中分离(ACS Appl.Mater.1nterfaces, 2012, 4, 5633-5642.);换言之，此类磁性纳米粒子的磁响应性低，加上晶粒尺寸小，不合适在生物体内使用。
[0004]增大磁性晶粒尺寸至适合在生物体内应用的范围(30?150nm)，固然能相对提高其磁响应性，但是会导致磁性晶粒由超顺磁性向铁磁性(剩磁和矫顽力较大)的转变。因此，如何控制晶粒尺寸，在提高磁性颗粒磁响应性的同时又能保持其超顺磁性，是磁性颗粒在生物体内得以应用的关键。研宄者发现，由尺寸小于30nm的Fe3O4的初级粒子自组装而形成的Fe3O4纳米团簇，能够满足上述要求。此类Fe 304纳米团簇多采用多元醇还原法制备(J.Phys.Chem.C，2007，111，5281-5285 ；J.Phys.Chem.C，2011，115，18923 - 18934 ；Angew.Chem.1nt.Ed., 2009, 48, 5875-5879.)。
[0005]聚吡咯(PPy)是一种表面富含氨基的导电聚合物，具有合成简单、表面性质可以调变的特点。在四氧化三铁/聚苯胺和四氧化三铁/聚吡咯磁性微/纳米复合物的制备及应用领域，研宄人员做了大量工作(CN102701277A;20141061728.9 ;DaltonTrans.2013, 42，1820-1826 ； Synth.Met.2013, 171，1-6.)。中国专利文献(申请号201410617728.9)公开了通过简单的脱掺杂处理，可以使聚吡咯表面被酸掺杂剂遮蔽的氨基释放出来，增加其表面氨基含量。
[0006]甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)是一种叶酸类似物和二氢叶酸还原酶抑制剂，它通过与肿瘤细胞中过度表达的叶酸受体的特异性结合，抑制肿瘤细胞中的二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成过程中一碳基团的转移受阻，导致肿瘤细胞DNA的生物合成受到抑制，阻碍其生长和繁殖(J.Mater.Chem.，2009，19，6400-6406.)。需要指出的是，要使接枝MTX的磁性靶药在生物体内起有效作用，必须使MTX以共价键的方式接枝到磁性载体上(Langmuir, 2005，21，8858-8864.)。为此，研宄者发展了多种改善磁性载体表面的方法。例如，用大分子或聚合物修饰磁核表面，其中包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙二醇-三氯三嗪复合物等(Small, 2006，2，785-792.；J.Mater.Chem.，2007，17，3354-3362 ；J.Mater.Chem.，2009, 19，6400-6406.)。然而，所有这些方法中，磁性复合载体的制备过程繁琐，且对磁性复合载体在生物体内应用应具备的特征缺乏考虑。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术的不足，提供一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，该法以Fe3O4纳米球形颗粒为原料，以吡咯为单体，通过原位聚合反应、脱掺杂处理，制备Fe304/PPy复合纳米球形颗粒；然后通过耦合反应，将MTX接枝到Fe304/PPy表面，获得Fe304/PPy/MTX磁性靶药。该方法获得的Fe304/PPy/MTX磁性靶药不仅满足适合在生物体内应用的特征，而且具有药物缓释性能，并对HeLa细胞有靶向特异性，能显著抑制HeLa细胞的生长。
[0008]一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，其特征在于，步骤如下:
[0009]a.在搅拌条件下，将乙酰丙酮铁溶解于乙二醇中，乙酰丙酮铁在乙二醇中的浓度为14.3?25mg/mL，再加入醋酸钠和聚乙二醇，醋酸钠和乙酰丙酮铁的物质的量之比为(3?6): 1，乙酰丙酮铁和聚乙二醇的质量比为(2?4): 1，搅拌0.5?Ih后，得混合液A ;
[0010]b.将混合液A转移至内衬为聚四氟的高压反应釜中，混合液在高压反应釜中的填充率为70?84%，封釜，升温至190?200°C，保温反应20?36h，将温度降至室温，得混合液B ;将混合液B中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体C ;
[0011]c.往上述固体C中加入0.1?0.5mol/L的盐酸水溶液，固体C在盐酸水溶液中的浓度为5?10mg/mL，超声分散0.5?lh，磁分离，留固体，往固体中加入体积浓度为I?3%的吡咯乙醇溶液，超声分散0.5?lh，得混合液D ；
[0012]所述固体C的质量与吡咯的体积之比为1: (I?1.5)，单位g/mL ；
[0013]d.往混合液D中加入浓酸，然后将混合液温度降至2?10 °C，滴加氧化剂的水溶液，保温搅拌1.5?3h，得混合液E，将混合液E中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体F ;
[0014]其中，混合液E中氢离子的浓度0.05?0.lmol/L ；
[0015]e.将固体F分散在浓度为I?2mol/L的氨水中，室温下搅拌3?6h，磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体G ;
[0016]所述的固体F在氨水中的浓度为5?10mg/mL ；
[0017]f.向固体G中加入甲氨蝶呤(MTX)的二甲亚砜溶液，甲氨蝶呤的浓度为1.5?5mg/mL，固体G与甲氨蝶呤的质量比为(3.33?6.67): 1，再加入耦合剂的水溶液，用碱调混合液的pH为8.2?8.8，在36?38°C避光条件下搅拌12?24h，得混合液H ；
[0018]所述耦合剂为失水剂和添加剂按物质的量之比为(3?6):1比例的混合，失水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC)，添加剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)；
[0019]g.将混合液H进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，将固体在40?60°C真空干燥，得磁性靶药。
[0020]根据本发明优选的，所述步骤a中搅拌速度均为300?400r/min ;优选的，所述步骤a中聚乙二醇分子量为4000?8000 ;优选的，所述步骤a中醋酸钠为无水或水合醋酸钠；
[0021]根据本发明优选的，所述步骤c中吡咯乙醇溶液采用经过减压蒸馏处理过的吡咯单体配制。
[0022]根据本发明优选的，所述步骤d中的浓酸为质量浓度36?38%的盐酸、质量浓度63?65%的硝酸、质量浓度95?98%的硫酸或质量浓度70?72%的高氯酸。
[0023]根据本发明优选的，所述步骤d中的氧化剂为过硫酸铵、过硫酸钾、三氯化铁或六水合三氯化铁，氧化剂与吡咯的物质的量之比为(0.5?1.5):1 ;
[0024]根据本发明优选的，所述步骤d中氧化剂的水溶液与混合液D的体积之比为(I?2):1。
[0025]根据本发明优选的，所述步骤f中甲氨蝶呤与耦合剂中添加剂的物质的量之比为1: (I ?2)；
[0026]根据本发明优选的，所述步骤f中耦合剂的水溶液与甲氨蝶呤的二甲亚砜溶液的体积比为(I?2):1 ;
[0027]根据本发明优选的，所述步骤f中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一，或者，氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一的水溶液；
[0028]上述抑制HeLa细胞生长的磁性靶药在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
[0029]根据本发明优选的，上述磁性革El药的有效作用浓度为0.1?lmg/mL ;优选的，有效作用浓度为0.3?0.5mg/mL。
[0030]本发明首先合成了具有超顺磁性、磁响应性高、颗粒分散均匀、颗粒尺寸满足生物体内应用要求的Fe304/PPy复合纳米球；将新合成的Fe304/PPy复合纳米球通过简单的脱掺杂处理，获得表面氨基更多的Fe304/PPy复合纳米球；然后采用耦合化学方法，使Fe304/PPy表面氨基和MTX分子中的羧基以酰胺键的形式形成共价键，制备了 Fe304/PPy/MTX磁性靶药。并对所制备的磁性靶药在模拟生物体内环境下的缓释行为，以及其对HeLa细胞的抑制性能进行了测试。研宄结果表明，所制备的Fe304/PPy/MTX磁性靶药不仅满足适合在生物体内应用的特征(即超顺磁性、磁响应性高