技术领域本发明涉及一种枸杞(LyCiumChinenseMiller)中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(LcGCS)及其编码基因与应用。
背景技术：
动植物在正常生长过程中，不仅会遭遇盐碱、重金属、干旱、冷、热等非生物胁迫，也会遇到创伤，虫害，病毒等生物胁迫。在这些胁迫条件下，体内会产生活性氧积累，导致，细胞内容物、细胞膜脂等损伤。植物进化出某些调节机制来应对这些逆境，例如产生大量的还原性物质和抗氧化酶。动植物通过调节谷胱甘肽(Glutathione,GSH)合成酶系例如γ-GCS(Glutamylcys-teineSynthetase)的的表达而增加还原性物质谷胱甘肽的合成。GSH是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽[DixonDPetal.,2005],它分为氧化型(GSSG)和还原型(GSH)。通常所说的谷胱甘肽是还原型的，它是植物体内非常重要的抗氧化物质，提高植物抵抗逆境的能力。GSH合成主要经过两步依赖ATP催化反应实现。在ATP功能下，谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸供能经过γ-GCS和GS(Glutathionesynthase)催化下合成GSH。在半胱氨酸充足的条件下，γ-GCS是GSH合成的首要的限制性酶基因。[NOCTORGetal.,2002]在大多数植物中，GCS限制了谷胱甘肽的合成速率。转录因子nrf2参与γ-GCS重链的合成，进而影响GCS的合成，最终上调合成谷氨酰半胱氨酸的合成量。[JaiswalAKetal.,2004]常规杂交育种技术，航天诱变技术，分子标记辅助育种，基因组学技术等可以选育抗逆境，抗病高产的作物。但这些技术分别存在育种周期长，辐射危害，筛选工作量大，成本较高等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶。本发明的第二个目的是提供枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因。本发明的第三个目的是提供含有枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因的重组载体、表达载体和重组菌。本发明的第四个目的是提供枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因在制备转基因植物的应用。本发明的技术方案概述如下：一种枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶，是SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因，是SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。含有枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因的重组载体、表达载体和重组菌。枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因在制备转基因植物的应用，是将枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因导入目的植物中，得到耐高NaCl逆境胁迫的和耐受镉离子的转基因植物。所述目的植物为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花、月季、洋桔梗、百合、安祖花、蝴蝶兰、大叶黄杨或香花槐。本发明的优点：本发明的枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因导入目的植物中，得到耐受镉离子能力高和耐盐能力高的转基因植物。附图说明图1.用P1、P2和P3、P4引物分别对枸杞cDNA的PCR产物(a)和(b)的电泳图。图2.LcGCS连接pMD18-T载体的PCR产物电泳图。图3.pMD18-T-LcGCS载体示意图。图4.LcGCS连接pET-28a载体的PCR验证结果。图5pET28a-LcGCS在大肠杆菌BL21中蛋白表达电泳图。图6.pCAMBIA2300-LcGCS酶切验证电泳图。图7.pCAMBIA2300-LcGCS载体示意图。图8.转基因烟草基因组和野生型(WT)PCR产物电泳图。图9.转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、大麦，小麦基因组PCR产物电泳图。图10.转基因月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰基因组PCR产物电泳图。图11.转基因大叶黄杨、香花槐基因组PCR产物电泳图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1枸杞谷氨酰半胱氨酸合成酶LcGCS基因的克隆利用Trizol试剂，从100mg的新鲜的枸杞(中华枸杞)叶片中提取总RNA，采用Transgentransecriptone-stepgDNAremovalandcDNAsynthesissupermix试剂盒，以枸杞总RNA为模板，OligodT18为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第1链。根据枸杞转录组数据库的Unigene序列设计由SEQIDNO.3所示的上游引物LcGCSL-F:5’GTGACACCCAATTGATTGCTATA3’和由SEQIDNO.4所示下游引物LcGCSL-R:5’CTGTTGTGGGGAAAATGTATGTC3’，PCR扩增枸杞中谷氨酰半胱氨酸合成酶LcGCS基因的长片段，PCR产物电泳图，见图1.(a)，再以此PCR产物稀释100倍后作为模板进行第二次PCR，第二次巢式PCR的上游引物由SEQIDNO.5所示的P1:5’CTTACTGAGCCAAGGCACAAAG3’和由SEQIDNO.6所示的引物P2:5’GCTGAATTGAAATGCACTCTCTC3’扩增得到完整的基因序列，PCR产物见图1.(b)。反应后利用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化，按照试剂盒说明书操作，得到纯化的LcGCSPCR片段。对PCR产物序列测序验证，获得长度为1611bp序列。与其它物种的GCS脱氧核苷酸序列比对，发现是LcGCS的ORF(openreadingframe)序列。在NCBI的ORFFinder网站预测到其蛋白序列，如SEQIDNO.1所示。其脱氧核苷酸序列如SEQIDNO.2所示实施例2重组载体pMD18-T-LcGCS的构建过程将序列表SEQIDNO.2所示的LcGCS基因与pMD18-T载体连接，反应条件:16℃，30min。连接产物转化E.ColiTop10。挑选白色菌落，菌落PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，如图2，与预期一致，将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了1611bp的该基因脱氧核苷酸序列，在NCBI进行blast，与番茄，马铃薯等同源性高，表明为该基因克隆成功。将LcGCS脱氧核苷酸序列与pMD18-T序列拼接组装成克隆载体pMD18-T-LcGCS，如图3所示。实施例3大肠杆菌原核重组表达载体pET28a-LcGCS的构建过程首先以pMD18-T-LcGCS质粒为模板，SEQIDNO.7、SEQIDNO.8分别所示的P3，P4为分别为上下游引物，扩增LcGCS基因。(SEQIDNO.7：CGCGGATCCATGGCCTTGATGTCTCAGGC)(SEQIDNO.8：ACGCGTCGACTCAGTAGAGAAGCTCCTCAAAGAC)其反应条件为：94℃，4min；(94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin50Sec)32cycles；72℃，8min。在P3中有BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中有SalI酶切位点(GTCGAC)，然后PCR产物和pET28a空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接产物转化E.ColiDH5α，涂布于含200mg/Lkana抗性的LB平板上，37℃培养。12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，如图4，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LcGCS构建正确。将构建好的原核表达载体pET28a-LcGCS转化大肠杆菌BL21。进行蛋白表达验证，得到预期大小(58.6KD)的LcGCS表达蛋白如图5。从左向右依次为pET28a空载体菌未诱导菌体蛋白、pET28a空载体菌诱导后菌体蛋白、pET28a-LcGCS表达载体菌未诱导菌体蛋白、pET28a-LcGCS表达载体菌诱导菌体蛋白实施例4微生物、植物真核重组表达载体pCAMBIA2300-LcGCS的构建首先以pMD18-T-LcGCS质粒为模板，P3，P4为分别(删除)为上下游引物，扩增LcGCS基因，其反应条件为：94℃，4min；(94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin50Sec)32cycles；72℃，8min。在P3中有BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中有SalI酶切位点(GTCGAC)，然后PCR产物和pCAMBIA2300空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接产物转化E.ColiDH5α，涂布于含100mg/L浓度kana抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，如图6(从左向右依次为pCAMBIA2300-LcGCS载体，pCAMBIA2300-LcGCS酶切产物)，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA2300-LcGCS构建正确。将LcGCS脱氧核苷酸序列与pCAMBIA2300序列拼接组装成表达载体pCAMBIA2300-LcGCS，如图7所示。实施例5用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58:pCAMBIA2300-LcGCS的构建。农杆菌感受态细胞制备1.将农杆菌C58单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养36h。2.将上述菌液2ml转入l00mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至(OD600值约为0.4-0.5)。3.冰浴30min后，4℃，5000r/min离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的ddH2O中。4.4℃，5000r/min离心10min，收集菌体，重悬于预冷的15％甘油中，每管200μL液氮速冻后，立即存于-80℃备用。植物表达载体的电击转化1.将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化；2.加入2-5μLpCAMBIA2300-LcGCS质粒，混匀，冰浴5min；3.转移至预冷的电击杯中；4.设置电击转化仪参数:1500V，5-6ms，电击转化；5.室温静置2min后加入500μLYEP液体培养基，28℃，180r/min振荡培养3-4h；6.室温4000r/min离心10min，吸出400μL上清液，将剩下的菌液混匀，涂布于含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平抗性的YEB平板上，倒置平板，28℃培养，36-48h，直至看到清晰的单菌落。7.挑取单菌落，菌落PCR验证。实施例6农杆菌介导的烟草遗传转化烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用含25％NaOCl(有效氯≥10％)20ml，浓盐酸4ml的水溶液，熏蒸灭菌1.5h，将种子放在MS培养基中，16h/8h光/暗周期，25±1℃培养。本实验用到的培养基如下表所示烟草的农杆菌转化侵染菌液的制备1.挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上培养24h。2.次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD600＝0.4-0.6)时，将菌液倒入50ml离心管，在5000r/min，4℃下离心10min，弃上清液，收集菌体。用等量的MS液体培养基重悬，使OD600＝0.9～1。外植体浸染1.将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5cm×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用含卡那霉素的无菌水清洗并用无菌滤纸吸净多余的液体，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养3天。2.将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。转基因苗移栽将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在珍珠岩，蛭石和腐殖土(1:2:2)的培养土中，覆盖薄膜保湿、透气，在25℃，培养7-10天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，并转移至温室中。实施例7转基因烟草分子检测和抗盐性检测转基因烟草基因组DNA的PCR检测:1.CTAB法提取T1代烟草总DNA；2.以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为P3、P4。取上述PCR产物5μl进行电泳检测，见图8，说明LcGCS基因已成功转入烟草。在温室正常生长的，5-7cm转基因烟草苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，叶片偏黄，而转基因烟草能够正常生长，生物量大，叶片较绿，能够开花结实，500mmol/L浓度的NaCl的条件下，生长一周以后，野生型烟草叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因烟草的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型烟草那样明显，基本能正常生长。在温室正常生长的，选取生长一致的转基因烟草苗和野生型对照苗，分别培养在含200μmol/L及300μmol/L浓度的CdCl2的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：200μmol/L处理组转基因烟草十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因烟草叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；300μmol/L处理组，转基因组烟草生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。实施例8本实验室通过种子胚生长点基因刷微创侵染法(荣非,王罡,季静,等.利用“微创刷”法获得抗草甘膦转基因大豆[J].大豆科学,2015,34(2).)对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花等农作物成熟胚转基因(LcGCS)，成功获得转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花植株，基因组PCR电泳图(如图9)，自左向右依次为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花的基因组和载体2300-LcGCS的PCR产物。在温室正常生长的，5-7个真叶转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCl的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，叶片偏黄，而转基因幼苗能够正常生长，生物量大，叶片较绿，能够开花结实，500mmol/L浓度的NaCl的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。在温室正常生长的，选取生长一致的转基因幼苗和野生型对照苗，分别培养在含200μmol/L及300μmol/L浓度的CdCl2的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：200μmol/L处理组转基因幼苗十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因幼苗叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；300μmol/L处理组，转基因组幼苗生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。实施例9本实验室利用农杆菌侵染法对月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰等花卉进行腋芽或茎鳞片微创法转基因(LcGCS)，获得转基因月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰植株，基因组PCR电泳图如图10，自左向右依次为月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰的基因组和载体2300-LcGCS的PCR产物。在温室正常生长的，5-7cm转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCl的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，叶片偏黄，不能正常开花，而转基因幼苗能够正常生长，叶片较绿，能够开花，500mmol/L浓度的NaCl的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长开花。在温室正常生长的，选取生长一致的转基因苗和野生型对照苗，分别培养在含200μmol/L及300μmol/L浓度的CdCl2的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：200μmol/L处理组转基因苗十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因苗叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；300μmol/L处理组，转基因苗生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。实施例10本实验室利用农杆菌侵染法对大叶黄杨、香花槐等乔木类树木进行转基因(LcGCS)，获得转基因大叶黄杨、香花槐植株，基因组PCR电泳图(如图11),自左向右依次为大叶黄杨、香花槐的基因组和载体2300-LcGCS的PCR产物。在温室正常生长的转基因树苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCl的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，叶片偏黄。而转基因树苗能够正常生长，叶片较绿。500mmol/L浓度的NaCl的条件下，生长一周以后，野生型苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基树苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。在温室正常生长的，选取生长一致的转基因树苗和野生型对照苗，分别培养在含200μmol/L及300μmol/L浓度的CdCl2的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：200μmol/L处理组转基因树苗十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因树苗叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；300μmol/L处理组，转基因树苗生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。