一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属医疗器械领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用。该套循环肿瘤细胞检测试剂盒包括免疫磁性微球、血液样本储存管、细胞提取装置；配套仪器包含磁分选设备和分析计数装置；试剂盒应用包含循环肿瘤细胞的计数、定量、及分子和基因水平的分析。本发明的优势在于使用简易的细胞提取盒进行循环肿瘤细胞的提取和分析，结合磁性细胞分选技术和免疫细胞化学技术进行外周血循环肿瘤细胞的检测，通过对循环肿瘤细胞的分析和计数，及对细胞分子及基因方面的分析，实现对循环肿瘤细胞的全方位分析，结果可靠性高。
【专利说明】—种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及一种肿瘤检测试剂盒及相关医疗设备，特别是一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)是指脱离肿瘤并进入血液循环的癌细胞。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于肿瘤的体外早期诊断，化疗药物的快速评估，肿瘤个体化治疗，肿瘤复发的监测及肿瘤新药物开发等。
[0003]采用磁性细胞分选技术分选CTCs是目前常用的方法之一，其原理是先将特异性抗体包被在有同源二抗的磁珠上制成免疫磁性微球，再与肿瘤细胞上的抗原结合成“肿瘤细胞一抗原抗体一磁球”复合物，该复合物具有磁响应性，可在外加磁场作用下向一定方向移动，肿瘤细胞得以富集，采用阳性筛选和阴性筛选结合的方法分选出需要的肿瘤细胞。免疫细胞化学计数可以对肿瘤细胞进行标记并计数，其原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点，使染色剂(荧光素、酶等)标记的抗体与特异性的肿瘤标志物(主要包括上皮细胞角蛋白CK、上皮细胞膜特异性抗原等)结合，通过酶和底物反应显色或其他显色方法来判断肿瘤细胞的存在，再由检测人员在显微镜下进行肿瘤细胞统计。将磁性分选计数与免疫细胞化学技术相结合可提高分选肿瘤细胞的准确性，提高诊断阳性率。
[0004]检测血液中的CTCs可分为以下两个步骤，(I)尽可能多的从患者的外周血中捕获CTCs ；(2)尽可能的动用现有的临床检测方法对捕获的肿瘤细胞进行个体化分析。由于肿瘤细胞往往处于去分化状态，循环中的肿瘤细胞常也是高度异质性的，而一些变异的肿瘤细胞往往由于捕获系统的低特异性和低效性而逃脱掉捕，从而出现漏网现象，并得到假阴性结果，导致错误的诊断。因此，CTCs检测系统存在的主要问题为如何发展一种高效并具有高特异性的循环血肿瘤细胞捕获材料及检测系统。
[0005]磁性细胞分选技术操作简单，且分选出的肿瘤细胞不丧失功能和活力，可立即用于分析和实验，但是分析出的假阳性率较高，检测不够准确。免疫细胞技术成熟，但分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原也可能呈阳性，检测也不够准确，而且检测人员对结果观察和判读的主观性较强，计数也不够准确。
【发明内容】
[0006]本发明专利的目的在于:针对现有技术存在的上述问题，提供一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用，该循环肿瘤细胞检测仪器结合上述不同检测方法，更为准确的进行循环肿瘤细胞的获取和检测。
[0007]为实现上述目的，本发明专利采用的技术方案为:将血液样本与免疫磁性微球混合后放置在细胞提取装置混合均匀，孵育5?60分钟后，使用磁分选设备对混合样本进行磁分离操作，磁分离后，去除上清；后对磁分选得到的细胞进行免疫染色、基因及分子水平分析。其中过程均在细胞提取装置中进行，可根据处理样本量选择合适大小的细胞提取装置。
[0008]一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用，所述检测试剂盒包括免疫磁性微球、血液样本储存管、细胞提取装置；配套仪器包含磁分选设备、分析计数装置、废物桶和计算机接口。所述血液样本储存管用于存储待检测的血液样本，所述细胞提取装置用于对样本血液进行免疫磁性细胞捕获、富集和对富集的靶细胞进行荧光染色，进一步分选出循环肿瘤细胞，所述废物桶通过导管与细胞提取装置连接，用于盛放废弃的血浆，所述分析计数装置包括荧光显微镜和高通量细胞影像分析仪，高通量细胞影像分析仪通过连续扫描荧光显微镜下图像，自动分析产生数据，该循环肿瘤细胞检测仪器还设置有计算机接口，通过计算机对细胞提取装置和分析计数装置进行控制。
[0009]一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用，其特征在于所述的免疫磁性微球的粒径范围为0.1?10微米，微球表面所含活性物为单一抗一 E P C A M抗体、叶酸、转铁蛋白、抗一丙酮酸激酶抗体，或几种活性物的组合。
[0010]一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用，其特征在于所述的细胞提取装置为不同体积容量的盒子，可盛血液样本容量为0.1?1000晕升,材料为透气聚苯乙烯,可用于血液样本混合、磁性分选、细胞培养和观测。
[0011]综上所述，由于采用了上述发明技术方案，本发明专利的效果为:循环肿瘤细胞检测试剂盒及配套仪器，设置有细胞提取装置、磁分选设备、分析计数装置；细胞提取装置结合磁性细胞分选技术和免疫细胞化学技术进行循环肿瘤细胞的富集和检测，通过分析计数装置对肿瘤细胞进行分析、计数，并实现对循环肿瘤细胞在分子及基因方面的分析，结果可靠性高；可减少人工操作时间和处理程序；另一方面，利用细胞提取装置、分析计数装置进行循环肿瘤细胞检测与计数，减少人工操作时间和处理程序。
[0012]本发明专利的特点在于:
[0013](I)与现有细胞培养或提取设备不同的是:本发明提出使用的细胞提取装置并不是现有的装置和技术，细胞提取装置是根据临床需要，为循环肿瘤细胞检测而专门提出并定制的。
[0014](2)细胞提取装置的使用可大大降低临床检测的成本；且磁分选、免疫染色、计数的流程均可在一个装置内完成，避免使用过程的污染；同时，细胞提取装置推广起来比较容易，认可度较高。
[0015](3)免疫磁性微球使用单一或多靶点联用的计数，可大大提高磁球对循环肿瘤细胞的抓捕效率。
[0016](4)从整体角度扩大了循环肿瘤细胞检测试剂盒的应用范围，其下游对提取的循环肿瘤细胞的分析应用包含基因及分子水平的评价。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明专利的工作流程示意图。
[0018]图中标记:1-血液样本储存管，2-细胞提取装置，3-分析计数装置(人工处理及计算机分析联用)，4-废物桶，5-洗液(磷酸缓冲液)。
【具体实施方式】[0019]为了使本发明专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明；
[0020]实施例1:
[0021]本实施例列举的循环肿瘤细胞检测仪器包括血液样本储存管1、细胞提取装置2、连接分析计数装置3和废物桶4，所述分析计数装置3包括荧光显微镜和高通量细胞影像分析仪，该循环肿瘤细胞检测仪器还设置有计算机接口，通过计算机对细胞提取装置2和分析计数装置3进行控制。
[0022]其中细胞提取装置2具体可为Thermo Scientific公司的Nunc OptiCell产品，但本发明的细胞提取装置并不局限于Nunc OptiCell,是对Nunc OptiCell产品的进一步升级。荧光显微镜的具体型号为BX-FL倒置荧光显微镜(北京长恒荣创科技有限公司)；高通量细胞影像分析仪的具体型号为Cellavista高通量细胞成像和分析工作站(罗氏公司);磁分选装置可选用专利(专利号:ZL200610148311和ZL03142274.8)中提及的磁分选设备。
[0023]参考图1，该循环肿瘤细胞检测仪器的工作流程是:所述血液样本储存管I内放置有经过优化的细胞保护剂，利用血液样本储存管采集、存储血液样本；细胞提取装置2中放有由特异性抗体具有同源二抗的磁珠制成的免疫磁性微珠，血液样本储存管I中的样本血液置入细胞提取装置中，免疫磁性微珠与样本血液中靶细胞上的抗原结合成“靶细胞一抗原抗体一磁珠”复合物，在磁场作用下该复合物富集，得以分离；细胞提取装置中还含有荧光素等染色剂，对富集的靶细胞进行荧光染色，进一步分选出循环肿瘤细胞；所述废物桶通过导管与细胞提取装置连接，用于盛放血液样本处理过程中废弃的血浆；分析计数装置3中的高通量细胞影像分析仪通过连续扫描荧光显微镜下图像，自动分析、产生数据。
[0024]本发明的循环肿瘤细胞检测仪器，设置有细胞提取装置2和分析计数装置3，细胞提取装置2结合磁性细胞分选技术和免疫细胞化学技术进行循环肿瘤细胞检测，通过分析计数装置对肿瘤细胞进行分析、计数，实现循环肿瘤细胞的准确检测与计数，可靠性高；另一方面，利用分析计数装置3进行循环肿瘤细胞分析与计数，减少人工操作时间和处理程序。
[0025]实施例2:细胞提取装置使用流程
[0026](I)打开细胞提取装置，用装好进样针头的注射器吸取7.5ml外周血样本，插入进样孔；
[0027](2)用1.0ml注射器吸取0.5ml免疫磁性微球样本，加入细胞提取装置中，摇床上振荡混匀；
[0028](3)混匀15分钟后，将细胞提取装置置于磁性装置上，进行磁分离；
[0029](4)磁分离后，食用进样注射器吸取上部分血液样本；
[0030](5)加入磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.4,0.lmol/L)洗涤I?3次；
[0031 ] (6)洗涤后，可对免疫磁性微球抓捕到的肿瘤细胞进行免疫染色分析。
[0032]实验数据显示，对肺癌A549细胞，当混合检测样本中存在100个A549细胞时，实际抓捕效率在70%以上；对乳腺癌MCF-7细胞，当混合检测样本中存在100个A549细胞时，实际抓捕效率在80%以上；对肝癌SMMC-7721细胞，当混合检测样本中存在100个A549细胞时，实际抓捕效率在70%以上。
[0033]本发明公开和揭示的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用，可通过借鉴本专利公开内容。尽管本发明的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒、配套仪器及应用已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【权利要求】
1.一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于循环肿瘤细胞检测试剂盒包括免疫磁性微球、血液样本储存管、与血液样本储存管连接的细胞提取装置；配套仪器包含磁分选设备、分析计数装置、与细胞提取装置连接的废物桶和计算机；所述分析计数装置是由荧光显微镜和高通量细胞影像分析仪组成；所述的计算机分别连接细胞提取装置和分析计数装置；使用时所述的细胞提取装置置于磁分选设备上。
2.如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于使用时将免疫磁性微球和血液样本置于细胞提取装置内，用于对样本血液进行免疫磁性细胞捕获、富集和对富集的靶细胞进行荧光染色、分选循环肿瘤细胞；废弃的血浆与细胞提取装置连接导管进入废物桶；高通量细胞影像分析仪通过连续扫描荧光显微镜下图像，自动分析产生数据；通过计算机对细胞提取装置和分析计数装置进行控制。
3.如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于所述的免疫磁性微球的粒径范围为0.1?10微米，微球表面活性物为单一抗一 E P C A M抗体、叶酸、转铁蛋白、抗一丙酮酸激酶抗体，或几种活性物的组合。
4.如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于所述的细胞提取装置为用于血液样本混合、磁性分选、细胞培养和观测的容量为0.1?1000毫升的盒子，该盒子的材料为透气聚苯乙烯。
5.如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于所述的细胞提取装置为Nunc OptiCell仪器。
6.如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器，其特征在于所述的荧光显微镜的为BX-FL倒置荧光显微镜；所述的高通量细胞影像分析仪为Cellavista高通量细胞成像和分析工作站。
7.—种如权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器的应用，其特征在于所述的试剂盒及配套仪器应用于肿瘤细胞分析。
8.如权利要求7所述的一种循环肿瘤细胞检测试剂盒和配套仪器的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞分析指抓捕外周血中的循环肿瘤细胞，并结合磁性细胞分选技术和免疫细胞化学技术进行外周血循环肿瘤细胞的检测，通过分析计数装置对肿瘤细胞进行分析、计数，实现对循环肿瘤细胞在分子及基因方面的分析。
【文档编号】G01N33/574GK103472227SQ201310426491
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】沈鹤柏, 梁晓飞 申请人:上海卫恒医疗器械有限公司