一种用于检测人源性BAX基因表达水平的引物组合及其应用的制作方法

本发明属基因
技术领域：
，本发明涉及一种用于检测人源性BAX基因表达水平的引物组合。
背景技术：
：BAX基因属于Bcl-2基因家族，是调节细胞凋亡的重要基因，BAX基因是被广泛研究的凋亡相关基因，BAX基因编码的BAX蛋白可拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用。BAX蛋白广泛分布于人体许多组织和细胞中，尤其在肝、肾小管、胰岛、胃腺体、心肌、淋巴结生发中心和神经元等组织表达较高。多种生理病理条件下，如缺氧、氧化还原状态的改变都可干扰蛋白在内质网中堆积，产生内质网应激，长时间过强的内质网应激可诱导细胞凋亡。许多细胞的凋亡过程中伴有BAX表达水平的升高。BAX促进细胞凋亡的可能机理主要是：(1)线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和ATP的合成功能受到破坏；(2)细胞氧化还原作用发生改变；(3)线粒体中的细胞凋亡相关分子凋亡酶激活因子APaf-1释放出来，与细胞色素C相互作用，激活Caspase线粒体凋亡通路。BAX过度表达后可形成同源二聚体，促进细胞色素C的释放，激活经典的线粒体凋亡通路。研究发现在NO供体硝普钠（SodiumNitroprusside,SNP）诱导的软骨细胞凋亡过程中BAX蛋白表达显著增高，其可加速软骨细胞凋亡的进程,而采用RNA干扰技术使BAX基因沉默后BAXmRNA和蛋白表达水平均明显下降，SNP诱导软骨细胞凋亡的作用明显被抑制。同样，对大鼠脑缺血再灌注损伤的研究发现，BAX在脑缺血再灌注损伤时表达增加，与Bcl-2形成同源二聚体促进细胞凋亡。BAX蛋白构象的改变或高表达可诱导线粒体介导的细胞凋亡，而低表达或表达缺失与肿瘤发生或进展密切相关。对子宫内膜癌的研究发现，随着手术分期及组织学分级的增加、肌层侵袭的加深及淋巴结的转移，BAX基因mRNA过表达阳性率逐渐增加，提示随着子宫内膜癌恶性程度的增加及分化程度的降低，在细胞恶性增殖更加活跃的同时，细胞自发凋亡也增加，肿瘤亦具有更强的侵袭转移能力。因此BAX基因mRNA的表达水平可作为判断高危因素和恶性生物学行为的指标之一，可协助临床制订个性化的综合治疗方案和随访。对BAX表达水平的研究除采用免疫组化和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mRNA水平研究,包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单,可应用SYBRgreen染料法检测，无需使用荧光探针，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助BAX表达水平的研究，整个PCR反应过程只需1.2小时即可完成。管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的基因,在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。细胞在应激反应时一些正常表达的基因会受到抑制，有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，因此不适宜用做内质网应激时的参考基因。核糖体蛋白基因产物是维持细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节,可用作内质网应激时的参考基因。技术实现要素：本发明通过设计人源性BAX基因的特异性引物和核糖体蛋白RPL19基因的特异性引物，将其用于BAX基因表达水平的检测。本发明的工作原理是应用荧光定量PCRSYBRgreen荧光染料的方法根据相对定量原理，即2-△△CT法确定基因表达水平。本发明包含两对引物，一对引物是针对人源性BAX基因的特异性引物；另一对引物是针对人的核糖体蛋白RPL19基因设计的特异性引物。根据NCBI公布的humanBAX的mRNA序列（序列号：NM_138761.3）设计BAX引物序列见表1：表1.BAX引物设计引物名称序列F-baxCGGGTTGTCGCCCTTTTCTAR-baxGTCCAATGTCCAGCCCATGA根据NCBI公布的humanRPL19的mRNA序列（序列号：NM_000981.3）设计引物序列见表2：表2.RPL19引物设计引物名称序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC本发明设计的两对引物可分别特异性检测BAX和RPL19基因的mRNA表达水平，无非特异性扩增，所选择的管家基因表达水平不受内质网应激影响，可对BAX基因的表达水平进行准确定量。本发明的检测系统采用SYBRgreen荧光染料方法，无需使用探针，试剂使用方便，只需加入相关检测模板即可，不需要繁琐的操作步骤，整个检测过程只需1.2h即可完成。附图说明图1为本发明实施例一中的BAX和RPL19基因扩增产物融解曲线，其中A为BAX基因扩增产物融解曲线，B为RPL19基因扩增产物融解曲线。图2为本发明实施例二中Manf蛋白对PD细胞模型BAX基因表达水平的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明实施例中采用诺唯赞的AcetaqSYBRsupermix，采用25微升反应体系。荧光定量PCR仪采用ABI7500。利用本发明的特异性引物组合和方法检测人源性BAX基因表达水平时，基本操作为：步骤1.细胞RNA提取采用商品化试剂盒提取细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，并控制提取质量OD260/280～2.0。本发明实施例采用天根总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作按说明书进行；步骤2.cDNA反转录取大约500ngRNA采用商品化试剂盒进行cDNA反转录。本实施例采用Takara的商品化试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）进行反转录，具体操作按说明书进行；步骤3.荧光定量PCR反应实验中每种模板分别加入两种荧光定量PCR反应体系中分别进行BAX和RPL19基因检测，一种反应体系包含组分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-bax）　　　各0.1～0.5μM下游引物（R-bax）各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA)5μl总体积25μl另一种反应体系包含组分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-rpl）　　　各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl）各0.1～0.5μM模板（1:5稀释的cDNA)5μl总体积25μl荧光定量PCR反应条件：95℃5min，然后再运行40个循环（具体95℃10s，60℃34s），退火时检测荧光信号。可在运行结束后进行融解曲线分析,检测引物扩增的特异性；步骤4.检测结果分析根据系统自动基线和设置的对数期阈值获得各个反应的CT值，计算2-△△CT值，即实验组BAX基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数，△△CT=（CTbax（实验组）-CTrpl19（实验组））-（CTbax（对照组）-CTrpl19（对组））。实施例一慢病毒感染细胞株BAX基因表达水平的检测将含有GRP78基因干扰序列的慢病毒感染SH-SY5Y细胞：SH-SY5Y细胞用含10%FBS的高糖DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱内培养，取对数生长期的SH-SY5Y细胞进行消化、计数，接种至96孔细胞培养板，5000个细胞/孔，次日使用不含FBS的DMEM培养基稀释RNAi慢病毒浓缩液，每孔加入10μl含RNA干扰序列的慢病毒浓缩液和90μl不含FBS的DMEM培养基，在37℃，5%CO2培养箱内培养24h，更换新鲜的含10%FBS的高糖DMEM培养基继续培养48h，收集细胞提取RNA，反转录后采用荧光定量PCR检测BAX表达水平。检测结果见表3：表3.慢病毒感染细胞与对照细胞BAX表达水平的比较表3结果表明慢病毒感染细胞BAX基因表达水平是对照组细胞的1.46倍，说明携带GRP78干扰序列的慢病毒感染细胞后可促进细胞凋亡。BAX和RPL19基因扩增产物融解曲线分别为单一融解峰（见图1），说明引物扩增特异性较好，无非特异性扩增条带。实施例二通过检测BAX基因表达水平研究Manf蛋白对细胞的保护作用帕金森病（ParkinsonDisease,PD）是一种椎体外系进行性神经退化性疾病，研究表明氧化应激损伤和α-突触核蛋白神经免疫反应是导致帕金森病的主要原因，都能产生应激反应。已证实MANF蛋白对多巴胺能神经元具有保护作用。通过采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作SH-SY5Y细胞损伤的帕金森病细胞模型可检测Manf蛋白的保护作用机制。将实验分为对照组（DMEM）组、6-OHDA（50μmol/L）组以及Manf+6-OHDA（50μmol/L）（4µg/ml）组。预先给予Manf蛋白4h后加入6-OHDA分别作用1h、7h和18h后收集细胞，提取RNA，反转录后采用荧光定量PCR测定BAX基因表达水平。通过与对照组比较，计算出各组BAX基因的相对表达水平（见图2），结果表明在Manf蛋白存在情况下，细胞BAX基因表达水平在1h和18h没有升高，甚至略有降低，而6-OHDA组在7小时和18hBAX基因表达水平较对照组有所升高，说明Manf蛋白对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，可能通过抑制BAX基因的表达来实现。通过上述的实施例可以知道，本发明的特异性引物组合及相应的方法，可以特异性检测人源性BAX基因的表达水平，避免同源性基因的干扰，并以不受内质网应激影响的RPL19作为内参，提高了人源性BAX基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。SEQUENCELISTING<110>同济大学苏州研究院<120>一种用于检测人源性BAX基因表达水平的引物组合及其应用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>1cgggttgtcgcccttttcta20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>2gtccaatgtccagcccatga20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>3cgagcgagctctttccttt19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR扩增引物<400>4agaccttcttcttgccacagc21当前第1页1 2 3