技术领域本发明属于药物化学领域。具体而言，本发明涉及一种如下通式I所示的含有类核苷结构的前药或其互变异构体、立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物，其制备方法，药物组合物及其作为抗丙型肝炎药物的用途。
背景技术：
丙型肝炎是丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，以下简称HCV)引起的一种严重威胁人类健康的肝脏疾病。1978年，丙肝病毒被首次发现；1989年，完成基因序列测定，HCV被确认为非甲型、非乙型肝炎的又一种主要病原体。根据HCV基因组异质性特性，目前可以分为6种类型，30个亚型。感染的类型有较强的地域性，我国以1型为主。2011年的研究表明，中国HCV感染者中，1型占58.2％，其中基因1a型为1.4％，基因1b型为56.8％。目前，全球范围内HCV感染者超过2亿，占世界总人口的3.3％。美国约有320万感染者，中国HCV患者超过了4000万人次，居世界之首，很多HCV感染者同时是乙肝甚至艾滋病患者，这增加了治疗的复杂性。目前还没有正式获得批准的丙肝疫苗，所以防止丙肝传播仍面临挑战。已有的慢性感染者病情正在发展中，预计未来10-20年将会迎来发病高峰。目前，丙肝药物欧美和日本市场约110亿美元，中国市场约2亿美元。预计2020年左右达到峰值，全球市场将会达到数百亿到1000亿美元。临床上治疗丙肝的标准方案是聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林，治愈标准是在治疗后24周内血液检测不到HCV的RNA。这种治疗方式副作用较大，包括抑郁、疲乏、流感样症状和贫血症等；治疗成本较高，标准疗程需要48周，费用约40,000美元。为解决上述问题，近年来针对丙肝病毒RNA基因序列的抗丙肝病毒的小分子化合物药物研发迅速成为热点，抗病毒药物将从干扰素时代进入小分子药物时代。目前，已有许多HCV蛋白酶抑制剂得到广泛研究，其中Telaprevir(替拉瑞韦，VX-950，商品名Incivek)和Boceprevir(波西普韦，SCH-503034，商品名Victrelis)已于2011年被批准上市。非结构蛋白NS5A的抑制剂也是一种作用于丙肝病毒RNA链的特异性抗病毒药物，多种基因型HCV病毒均具有显著的抑制作用。其中较为典型的药物是Daclatasvir，已经被批准上市，其与其它小分子药物的联合使用也受到研究人员的关注，目前是针对各种基因型治疗方法的重要组成部分。此外，以NS5B聚合酶为靶点的药物分为核苷类和非核苷聚合酶抑制剂两类。其中的索菲布韦是迄今为止最为高效的抗HCV药物，可有效对抗HCV基因型1、2、3、4和6感染，是首个纯口服抗丙肝药物，但是其价格十分昂贵(例如：索菲布韦每片在美国售价是1000美元，整个疗程需要将近84000美元，而Harvoni每片更是高达1100美元)。鉴于我国对HCV药物需求巨大，目前仍无成功开发抗HCV药物或具有潜力的候选药物。因此开发具有自主知识产权的抗HCV新药具有重要的战略意义。保肝护肝药主要是指促进肝细胞再生，减少肝细胞损害的药物。肝脏作为人体最大的代谢活动中心，对人体尤其重要，因此肝病的治疗中保肝护肝显得尤为重要。因此保肝护肝药物在临床上应用越来越受到重视和认可，用药市场规模保持着稳定增长，在所有肝病用药中仅次于抗病毒及免疫调节剂。在临床上，抗慢性肝炎病毒治疗一般会采用具有保肝、降酶、缓解炎症、调节免疫、降低氨基转移酶等功能的保肝护肝药物与抗肝炎病毒药物联用，以起到治疗清除病毒、调节免疫、恢复肝功能改善肝脏病理的作用，即达到“标本兼职”的治疗目的。然而，让病患同时服用抗病毒药物和保肝护肝药物，不仅患者顺应性差，同时也增加了患者的经济负担。因此，能够研究一种既具有抗丙肝病毒活性，且具有保肝护肝活性的双功能药物具有重要的理论意义和实际应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的抗HCV病毒和保肝、护肝双功能药物，本发明采用了拼合策略将抗丙肝药物NS5B抑制剂和具有治疗或辅助治疗肝病的药物整合在一个分子中，使其发挥双功能药物的作用，用于治疗病毒性肝炎等症。本发明的一个目的是提供一种通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物。本发明的另一个目的是提供本发明提供的化合物的制备方法。本发明的又一个目的是提供通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物作为NS5B抑制剂，保护肝细胞、肝脏组织，改善肝功能的用途，以及在制备治疗病毒性肝炎中的应用。本发明的再一个目的是提供包含通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物中的一种或多种的药物组合物。本发明的再一个目的是提供一种治疗病毒性肝炎，同时保护保护肝细胞、肝脏组织，改善肝功能、降低氨基转移酶的方法。本发明的技术方案如下：根据本发明的一个方面，通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X为羟基或卤素(F、Cl或Br)，R为其中Linker可以存在或不存在，A为已经上市的用于治疗或辅助治疗肝病的药物或其衍生物，A通过共价键与Linker连接，然后Linker通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接，当Linker不存在时，A直接通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接。根据本发明的一个方面，在所述通式I中，通式I所示的化合物优选为通式II所示含有类核苷结构的前药或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X优选为卤素(F、Cl或Br)，R为其中Linker优选为氨基酸、或不存在，A为已经上市的用于治疗或辅助治疗肝病的药物及其衍生物，A通过共价键与Linker连接，然后Linker通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接，当Linker不存在时，A直接通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接。R1，R2为H、C1-C5烷基。根据本发明的一个方面，在所述通式II中，通式II化合物优选为通式III所示含有类核苷结构的前药或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X优选为卤素(F、Cl或Br)，R为其中Linker优选为氨基酸、或不存在，A优选为硫普罗宁、双环醇、乙酰半胱氨酸、或其衍生物，A通过共价键与Linker连接，然后Linker通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接，当Linker不存在时，A直接通过共价键与核苷4位羟基氧原子连接。R1，R2分别优选自H、C1-C5烷基。根据本发明的一个方面，在所述通式III中,通式III化合物可以优选自以下通式III-A化合物，或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X优选为F、Cl；Linker优选为或不存在，当Linker不存在时，硫普罗宁或其衍生物直接通过酯键与核苷4位羟基氧原子连接，R1，R2分别优选自H、C1-C5烷基。R3，R4为氢原子或C1-C5烃基。根据本发明的一个方面，在所述通式III中，通式III化合物优选自以下通式III-B化合物，或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X优选为F、Cl；,Linker优选为或不存在，当Linker不存在时，乙酰半胱氨酸或其衍生物直接通过酯键与核苷4位羟基氧原子连接，R1，R2分别优选自H、C1-C5烷基。R3，R4为氢原子或C1-C5烃基。根据本发明的一个方面，在所述通式III中，通式III化合物优选自以下通式III-C化合物，或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：其中，X优选为卤素F、Cl；Linker优选为R3，R4为C1-C5烃基。根据本发明的一个方面，在所述通式III中选自下列化合物，或其立体异构体、立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物：通式Ⅰ所示的化合物可含有一个或多个手性中心，因此可存在立体异构体，即对映异构体、非对映异构体或其混合物。因此，本发明式Ⅰ所示的化合物可以为单个异构体或各异构体的混合物。本发明包括通式Ⅰ所示的化合物的任何前药形式。本发明还包括通式Ⅰ的化合物的可药用溶剂化物。本发明也包括通式Ⅰ所示的化合物的可药用氧化物，及其可药用盐和可药用溶剂化物。根据本发明的又一方面，本发明提供了通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物的用途，其作为NS5B抑制剂同时保护保护肝细胞、肝脏组织，改善肝功能的用途，和在制备用于治疗病毒性肝炎等疾病的药物中的用途。根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种包含治疗有效量的通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物中的一种或多种的药物组合物，其可以作为NS5B抑制剂，以及该组合物可以任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种NS5B抑制剂，其含治疗有效量的通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物中的一种或多种，以及该抑制剂可以任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。该组合物由治疗有效量的一种或多种通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物与至少一种可药用辅料组成。药用辅料的选择因施用途径和作用特点而异，通常是填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂等。式I化合物、其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物在上述组合物中的所占的比例为总重量的0.1％～99.9％，优选1％～99％。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂，如水等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；吸附载体，如高岭土和皂粘土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、和聚乙二醇等。另外，还可以在所述药物组合物中加入其它辅剂，如香味剂和甜味剂等。本发明还提供了通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物的可药用的组合物的制备方法。通常将通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物与可药用辅料相混合，经常规的制备方法制成适于一定途径施用的形式(剂型)。剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、软膏、膜剂、霜剂、气雾剂、注射剂、栓剂等。优选片剂和胶囊剂。本发明化合物的使用剂量一般为每天1～1000mg，分单次或多次使用。但在必要时，可适当偏离上述剂量。专业人员可根据具体情况和专业知识，确定最佳剂量。这些情况包括疾病的严重程度、患者的个体差异、制剂的特性和给药途径等。此外，本发明还提供了通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物，或其可药用的组合物作为人用药物的用途。根据本发明的又一方面，本发明还提供了治疗病毒性肝炎等症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物中的一种或多种或者本发明的所述药物组合物给患者。本发明提供的化合物或组合物可以口服、注射(静脉、肌肉、皮下和冠状动脉内)、舌下、经颊、经直肠、经尿道、经阴道、经鼻、吸入或局部途径施用。优选的途径是口服。用于口服时，可以将其制成常规的固体制剂，如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，或制成液体制剂，如水或油悬浮剂，或其它液体制剂，如糖浆等；用于肠外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明还提供了通式I所示的含有类核苷结构的前药或其立体异构体，立体异构体混合物或其药学上可接受的溶剂合物，在制备NS5B抑制剂的人用药物中的用途。本发明的化合物或其药物组合物可用于丙型肝炎的治疗，同时具有保护肝组织、肝细胞、改善肝功能、降低氨基转移酶的作用。具体实施方式实施例1：化合物III-1的合成步骤一：将529mg(1.0mmol)IV-1溶于10mL无水二氯甲烷中，冰浴下加入452mg(1.0mmol)V-1(制备方法参考Chemistry-AEuropeanJournal,2014，20,6526-6531)及DMAP122mg(1.0mmol)，搅拌1h，过滤，滤液用二氯甲烷(30mL)稀释，依次用水(10mL)及饱和食盐水(10mL)洗涤，分离有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得白色固体III-1，收率：29％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(s,1H),7.46(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.30-7.35(m,3H),7.29–7.22(m,3H),7.19(d,J＝7.4Hz,1H),6.79(s,1H),6.16(d,J＝18.1Hz,1H),6.06(d,J＝8.3Hz,2H),6.00(s,2H),5.64–5.53(m,1H),4.50-4.60(m,3H),4.38–4.20(m,3H),4.20–4.04(m,1H),3.90-4.00(m,7H),3.77(s,3H),2.17(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),1.46-1.55(m,3H),1.38(d,J＝7.7Hz,3H),1.27(s,1H),1.24(d,J＝6.3Hz,6H),LC-ESI-MS:[M+H]+1327。实施例2：化合物III-2的合成步骤一：将529mg(1.0mmol)IV-1溶于10mL无水二氯甲烷中，室温下加入405mg(1.0mmol)V-2(制备方法参考PolymerChemistry,2011，2,906-913)环己基碳二亚胺412mg(2.0mmol)及DMAP12.2mg(0.1mmol)，搅拌6h，TLC检测反应完全。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得白色固体VII-2，收率43％，LC-ESI-MS:[M+H]+916，直接用于下一步反应。步骤二：将183mg(0.2mmol)VI-2溶于10mL无水二氯甲烷中，室温下加入2mL(体积比：二氯甲烷/三异丙基硅烷/三氟乙酸＝5/1/1)溶液，反应约1h，TLC检测反应完全，小心加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。剩余物硅胶柱层析纯化得到白色固体III-2，收率51％。1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.57(s,1H),8.55(d,J＝7.8Hz,1H),7.71(d,J＝7.7Hz,1H),7.38(t,J＝7.6Hz,2H),7.20(dd,J＝18.6,7.6Hz,3H),6.18–5.88(m,2H),5.63(d,J＝7.8Hz,1H),5.34(s,1H),4.86(dt,J＝12.2,6.0Hz,1H),4.35–4.16(m,3H),4.08–3.88(m,2H),3.87–3.72(m,1H),3.54(dd,J＝12.9,6.8Hz,1H),2.86(d,J＝6.9Hz,1H),1.43–1.26(m,6H),1.23(d,J＝6.9Hz,3H),1.16(d,J＝6.1Hz,6H).LC-ESI-MS:[M+H]+675。实施例3：化合物III-3的合成步骤一：将529mg(1.0mmol)IV-1溶于5mL二甲基亚砜中，加入4mL醋酐和1.5mL醋酸，室温搅拌48小时，小心加入饱和食盐水和乙酸乙酯，分离有机相依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得淡黄色胶状物IV-2，收率25％，LC-ESI-MS:[M+H]+590。将118mg(0.2mmol)V-2溶于无水二氯甲烷，冰浴条件下加入0.3mL二氯亚砜的二氯甲烷溶液(1M)，反应液缓慢升温至室温，并搅拌2h，减压浓缩除去溶剂，得黄色胶状物直接用于下一步反应。步骤二：将上述胶状物溶于1mL无水四氢呋喃中，室温下加入93mg(0.2mmol)V-2及碳酸钾55mg(0.4mmol)，搅拌6h，TLC检测反应完全。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得白色固体VI-3，收率45％，LC-ESI-MS:[M+H]+916。步骤三：将36.6mg(0.04mmol)VI-3溶于1mL无水二氯甲烷中，室温下加入0.5mL(体积比：二氯甲烷/三异丙基硅烷/三氟乙酸＝5/1/1)溶液，反应约1h，TLC检测反应完全，小心加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。剩余物硅胶柱层析纯化得到白色固体III-3，收率70％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.56(s,1H),8.53(d,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.5Hz,1H),7.28(t,J＝7.5Hz,2H),7.21(dd,J＝18.0,7.6Hz,3H),6.15–5.71(m,2H),5.61(d,J＝7.8Hz,1H),5.55(d,J＝6.2Hz,1H),5.49(d,J＝6.2Hz,1H),5.34(s,1H),4.84(dt,J＝12.0,6.0Hz,1H),4.31–4.14(m,3H),4.11–3.85(m,2H),3.85–3.73(m,1H),3.54(dd,J＝12.0,6.5Hz,1H),2.84(d,J＝7.0Hz,1H),1.45–1.23(m,6H),1.21(d,J＝6.9Hz,3H),1.19(d,J＝6.1Hz,6H).LC-ESI-MS:[M+H]+704。实施例4：化合物III-4的合成步骤一：将529mg(1.0mmol)IV-1溶于10mL无水二氯甲烷中，室温下加入405mg(1.0mmol)VI-3环己基碳二亚胺412mg(2.0mmol)及DMAP12.2mg(0.1mmol)，搅拌12h，TLC检测反应完全。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得白色固体VI-4，LC-ESI-MS:[M+H]+916，直接用于下一步反应。步骤二：将183mg(0.2mmol)VI-4溶于10mL无水二氯甲烷中，室温下加入2mL(体积比：二氯甲烷/三异丙基硅烷/三氟乙酸＝5/1/1)溶液，反应约1h，TLC检测反应完全，小心加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。剩余物硅胶柱层析纯化得到白色固体III-4，收率：62％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.60(s,1H),8.61(d,J＝7.5Hz,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),7.22(m,3H),6.19–5.90(m,2H),5.69(d,J＝7.8Hz,1H),5.36(s,1H),5.12～5.06(m,1H),4.89(dt,J＝12.2,6.0Hz,1H),4.37–4.15(m,3H),4.18–3.98(m,2H),3.57(dd,J＝12.9,6.8Hz,1H),2.88(d,J＝6.9Hz,1H),2.24(s,3H),1.48–1.23(m,6H),1.18(d,J＝6.1Hz,6H).LC-ESI-MS:[M+H]+675。实施例5：化合物III-5的合成步骤一：将118mg(0.2mmol)IV-2溶于无水二氯甲烷，冰浴条件下加入0.3mL二氯亚砜的二氯甲烷溶液(1M)，反应液缓慢升温至室温，并搅拌2h，减压浓缩除去溶剂，得黄色胶状物直接用于下一步反应。将上述胶状物溶于1mL无水四氢呋喃中，室温下加入93mg(0.2mmol)V-3及碳酸钾55mg(0.4mmol)，搅拌6h，TLC检测反应完全。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得白色固体VI-5，收率45％，LC-ESI-MS:[M+H]+916。步骤三：将36.6mg(0.04mmol)VI-5溶于1mL无水二氯甲烷中，室温下加入0.5mL(体积比：二氯甲烷/三异丙基硅烷/三氟乙酸＝5/1/1)溶液，反应约1h，TLC检测反应完全，小心加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。剩余物硅胶柱层析纯化得到白色固体III-5，收率51％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.59(s,1H),8.60(d,J＝7.6Hz,1H),7.68(d,J＝7.6Hz,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,2H),7.21(m,3H),6.17–5.95(m,2H),5.69(d,J＝7.5Hz,1H),5.65(d,J＝6.2Hz,1H),5.50(d,J＝6.2Hz,1H),5.37(s,1H),5.22～5.16(m,1H),4.84(dt,J＝12.2,6.0Hz,1H),4.35–4.17(m,3H),4.18–3.90(m,2H),3.53(m,1H),2.85(d,J＝6.9Hz,1H),2.21(s,3H),1.44–1.22(m,6H),1.16(d,J＝6.1Hz,6H).LC-ESI-MS:[M+H]+704。实施例6：化合物III-6的合成步骤一：将529mg(1.0mmol)IV-1溶于10mL无水四氢呋喃中，室温下加入465mg(1.0mmol)VI-5(制备方法参考Synthesis，1990,12,1159-66)及三乙胺202mg(2.0mmol)，搅拌6h，TLC检测反应完全。减压浓缩除去溶剂。剩余物硅胶柱层析纯化得VI-6，直接用于下一步。步骤二：将210mg(0.2mmol)VI-6溶于10mL无水二氯甲烷中，室温下加入2mL(体积比：二氯甲烷/三异丙基硅烷/三氟乙酸＝5/1/1)溶液，反应约1h，TLC检测反应完全，小心加入饱和碳酸氢钠溶液，分离有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。剩余物硅胶柱层析纯化得到白色固体III-6，收率45％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.50(s,1H),8.55(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(d,J＝7.5Hz,1H),7.28(t,J＝7.5Hz,2H),7.25(m,3H),6.17–5.75(m,2H),5.62(d,J＝7.8Hz,1H),5.75(d,J＝6.5Hz,1H),5.54(d,J＝6.5Hz,1H),5.35(s,1H),4.89(dt,J＝12.0,6.0Hz,1H),4.35–4.19(m,3H),4.21–3.99(m,2H),3.91–3.83(m,1H),3.44(dd,J＝12.0,6.5Hz,1H),2.94(d,J＝7.0Hz,1H),1.46–1.25(m,6H),1.20(d,J＝6.9Hz,3H),1.18(d,J＝6.1Hz,6H).LC-ESI-MS:[M+H]+748。实施例7:抗丙肝病毒活性(HCV,EC50)以及细胞毒性(CC50)由于缺乏理想的HCV体外感染细胞和动物模型，一般情况下，HCV病毒活性评价会采用HCVRNA复制中起关键作用的酶建立细胞外的分子复制模型。化合物对细胞内HCV复制子的抑制活性(EC50)的结果作为评价其抗丙肝病毒活性是国际上惯用的方法，而同时细胞毒活性(CC50)的同步测试用于排除由于细胞毒性造成的假阳性结果。实验方案：huh7细胞是目前仅有的能够支持HCV病毒(JFH-1Strain)体外感染的细胞模型，它是由含有HCVreplicon的huh7细胞经IFN作用清除病毒基因组后得到的适应细胞株，能够体外被HCVJFH-1病毒感染，并能产生感染性的子代病毒。J399EM是转染了EGFP的HCV全长突变株，可以产生与JFH-1野生型具有相同感染能力的病毒，同时通过在NS5A区域插入EGFP编码序列，可以直接在感染细胞内观察NS5A-EGFP融合蛋白荧光。本试验采用J399EM病毒感染Huh7细胞8小时，然后用PBS清洗，再加入不同浓度样品，继续培养72小时。在样品处理后，于荧光酶标仪上检测HCV蛋白荧光，激发波长为488nm，发射波长为516nm，读取相对荧光强度(RFU)，进行样品对HCV的抑制作用的检测，按公式计算HCV病毒抑制率。MTT法检测细胞毒性：掺入MTT，4小时后加入MTT溶解液，6小时后在酶标仪上570nm处测得OD值。结果表明，本发明提供的化合物表现出与索菲布韦相似的活性和治疗指数，表明该化合物在肝细胞内可与索菲布韦一样能够在细胞内快速降解成为活性代谢产物的形式发挥抗HCV的作用。表1本发明化合物的抗丙肝病毒活性(HCV,EC50)以及细胞毒性(CC50)结果实施例8:CCl4肝损模型的保护作用研究取体重24～28g的雄性小鼠实验前，按体重随机分成3组，每组10只小鼠，分设空白对照组、CCl4组、阳性对照组(硫普罗宁45mg/kg)、索菲布韦对照组(200mg/kg)、专利化合物组(200mg/kg)。化合物组每24h灌胃给药1次，给药7天，空白对照组和模型组灌服等容量的生理盐水。在第7次给药后1h，除空白组小鼠外，其它两组小鼠腹腔注射0.1％CCl4油溶液造模。于12小时后，各鼠取血，测定血清谷丙转氨酶ALT(评价肝功能最重要的指标)。结果表明，CCl4模型组小鼠的ALT异常升高，硫普罗宁(阳性对照)能显著逆转这种升酶作用，相比较下，索菲布韦则没有这方面的活性。而本发明提供的化合物具有明显的降酶作用，活性与硫普罗宁相当。由于缺乏理想的HCV感染动物模型，直接评价本发明提供的化合物对HCV引起肝损伤的保护作用不可行，但理论上以及临床应用的角度来讲，本发明提供的化合物的保肝护肝的作用对于HCV引起的炎症反应同样具有保护作用。表2本发明化合物的CCl4肝损模型的保护作用研究结果组别ALT下降水平索菲布韦-硫普罗宁++III-1+++III-2++III-3++III-4+III-5+III-6++“ALT”的浓度水平与模型组相比，无明显变化：“-”下降15％～30％：“+”；下降30％～50％：“++”；下降50％以上“+++”。实施例9:体外PK性质研究取受试化合物III-2(1mg/mL)测试其人模拟胃液、模拟肠液、人血浆、人肝微粒体中的稳定性。结果表明，III-2在模拟胃液中稳定性高(1小时的代谢率<5％)，III-2在模拟肠液(5分钟代谢率均大于90％)、血浆(5分钟代谢率均大于99％)和肝微粒体(5分钟代谢率均大于99％)中可快速降解并释放出索菲布韦和硫普罗宁。该结果证明测试化合物经口服可经肠道、血浆、肝脏快速代谢，并释放出原型药物。与之前发现的通过索菲布韦的嘧啶氮原子衍生化的类似化合物II-A-1(CN201510932904.2)相比，其在模拟胃液中的稳定性更高，而在模拟肠液、血浆和肝微粒体中的代谢转化速率更快。考虑到药物的吸收主要发生在小肠，因此，与索菲布韦的嘧啶氮原子衍生物(CN201510932904.2)相比，本专利从索菲布韦的核苷羟基上进行衍生，所得化合物其体外的PK性质更有利于其在体内转化并实现吸收，预计其作为双功能的前药分子发挥抗丙肝“标本兼治”的疗效更佳。实施例10：受试化合物的化学稳定性研究取受试化合物III-2测试(100mg)，放置于40±2℃、75±5％的稳定箱中，进行加速稳定性实验。1个月的实验表明，III-2的降解率<1％(新增杂质含量)，而与之前发现的索菲布韦的嘧啶氮原子衍生化的类似化合物II-A-1(CN201510932904.2)相比，其化学稳定性具有明显优势(同等条件下，II-A-1的降解率为4.5％)。因此，与索菲布韦的嘧啶氮原子衍生化的类似化合物相比，本专利从索菲布韦的核苷羟基上通过进行衍生，所得化合物的化学稳定性更高，有利于其进一步开发为双功能的抗丙肝候选药物。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。