杂构多核苷酸及其使用方法

专利名称：杂构多核苷酸及其使用方法
技术领域：
本发明涉及使用L-DNA检测核酸的方法和组合物。
背景技术：
核酸检测试验是分子生物学研究和医学诊断的重要工具。许多检测样品中的特定核酸分子的核酸探针试验都是以检测表明发生了杂交、连接、引物延伸和复制事件的信号为基础。核酸检测是鉴定微生物、监测基因表达和类型和鉴定组织和血样试验中的关键。
已有各种DNA杂交技术用于检测含有大量序列区域的样品中一种或多种选择的多核苷酸序列的存在。在一种依赖片段的捕获和标记的方法中，含有选择的序列的核酸片段通过杂交而被捕获到固定的探针上。通过与含有可检测的报道部分的第二探针杂交而标记该捕获的片段。或者，可采用各种方法，包括标记核苷酸的引物延伸掺入、利用标记的引物进行的扩增、化学标记反应、标记探针的连接、以及杂交复合物的交联，在捕获之前标记该核酸片段。
现有试验的一个缺点是探针与非想要的靶序列之间或不同的探针之间的交叉-杂交可能干扰试验的性能。因此，需要对此进行改进，以避免交叉-杂交，同时保持良好的试验性能。

发明内容
一方面，本发明包括含有杂构多核苷酸(heteroconfigurational polynucleotide)的多核苷酸组合物，该杂构多核苷酸含有D型多核苷酸序列部分和与其共价连接的L型多核苷酸序列部分。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含5-50个L-核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含5-50个D-核苷酸。
在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种L型2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种L型核苷酸，包括1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含一种D型2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分含有至少一种L型核苷酸，包括1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些实施例中，至少一种D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分包含选自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯和氨基磷酸酯的核苷酸间连接键。
在一些实施例中，前述任一权利要求的组合物中的杂构多核苷酸包含选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤和7-脱氮尿苷的核苷酸碱基。
在一些实施例中，该杂构多核苷酸包含选自2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和2-硫代嘧啶的核苷酸碱基。
在一些实施例中，该组合物含有与L型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸。在一些实施例中，该第一互补核苷酸含有至少一种L型核苷酸。在一些实施例中，该第一互补多核苷酸含有至少一种L型2′脱氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，该第一互补多核苷酸含有至少两种肽核酸亚基。
在一些实施例中，该第一互补多核苷酸连接于固相载体。在一些实施例中，该固相载体包括聚苯乙烯、玻璃、硅胶、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基(polyethyleneoxy)或尼龙。在一些实施例中，该固相载体包括小颗粒、珠、膜、玻璃料、载玻片、平板、显微机械加工芯片、链烷硫醇-金层(alkanethoil-gold layer)、无孔表面、可寻址阵列或凝胶。在一些实施例中，该固相载体包括珠、聚苯乙烯珠和/或尼龙膜。在一些实施例中，该固相载体包括选自纳米颗粒、微球体或脂质体的小颗粒。在一些实施例中，该固相载体是玻璃。在一些实施例中，所述第一互补多核苷酸通过可切割的连接物连接于该载体。在一些实施例中，该可切割的连接物包含羰基，该第一互补多核苷酸通过该羰基与该载体连接。
在一些实施例中，组合物含有与D型多核苷酸序列部分杂交的第二互补多核苷酸。
在一些实施例中，组合物含有可检测的标记物，如荧光染料、荧光猝灭剂、能量转移对、量子点(quantum dot)或化学发光前体。在一些实施例中，该标记物包括荧光素、罗丹明或花青。在一些实施例中，该标记物连接于与D型多核苷酸序列部分杂交的第二互补多核苷酸。
还提供的是含有5-100个L型核苷酸的不同序列多核苷酸阵列，其中，多核苷酸被固定在固相载体上的可寻址位置。在一些实施例中，该固相载体包括聚苯乙烯、玻璃、硅胶、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或尼龙。在一些实施例中，该固相载体包括小颗粒、珠、膜、玻璃料、载玻片、平板、显微机械加工芯片、链烷硫醇-金层、无孔表面、可寻址阵列或凝胶。在一些实施例中，该固相载体包括珠、聚苯乙烯珠和/或尼龙膜。在一些实施例中，该固相载体包括选自纳米颗粒、微球体或脂质体的小颗粒。在一些实施例中，该固相载体是玻璃，如可控空隙玻璃(contolled pore glass)。在一些实施例中，所述第一互补多核苷酸通过可切割的连接物连接于该载体。在一些实施例中，该可切割的连接物包含羰基，该第一互补多核苷酸通过该羰基与该载体连接。在一些实施例中，该固相载体被制成96孔模式。在一些实施例中，至少一种多核苷酸含有标记物。在一些实施例中，该标记物包括荧光染料、猝灭剂、能量转移染料、量子点、洋地黄毒苷、生物素、迁移率改变剂、多肽、稳定杂交的部分或者化学发光前体。在一些实施例中，至少一种固定的多核苷酸包含以下结构 式中，S是固相载体；A是连接物；X是具有3个或多个连接位点的连接物；Y是O、NH或S，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基；L是氢或标记物；NL是L型核苷酸序列；ND是D型核苷酸序列；m是0-100的整数；n是5-100的整数；q是0-100的整数。
在一些实施例中，A是可切割的连接物。在一些实施例中，A包含一个或多个以下结构 在一些实施例中，(ND)m和(NL)n、(NL)n和(ND)q通过连接物相互连接。在一些实施例中，该连接物含有一个或多个乙烯氧亚基。在一些实施例中，m＝0。在一些实施例中，m＝q＝0。
还提供各种方法。在一些实施例中，本发明包括形成多核苷酸杂交物的方法，包括提供含有D型多核苷酸序列部分和与之共价连接的L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸，使该杂构多核苷酸与第一互补多核苷酸杂交，形成该第一互补多核苷酸与该L型多核苷酸序列部分之间的双链体。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含5-50个L型核苷酸。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包括5-50个L型核苷酸。在一些实施例中。该L型多核苷酸序列部分包括至少一种L型2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。在一些实施例中，该L型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含一种D型2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，D型多核苷酸序列部分含有至少一种为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。在一些实施例中，该D型多核苷酸序列部分包含至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。在一些实施例中，至少一种D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分包含选自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯和氨基磷酸酯的核苷酸内连接键。在一些实施例中，该第一互补多核苷酸包含至少一种L型核苷酸。在一些实施例中，该第一互补多核苷酸含有至少一种L型2′脱氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。在一些实施例中，该第一互补多核苷酸含有至少两种肽核酸亚基。在一些实施例中，可从所述杂交物分离未杂交的第一互补多核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括检测该杂交物。在一些实施例中，所述方法包括对该杂构多核苷酸进行引物延伸。在一些实施例中，该方法包括使用核酸酶切割该杂构多核苷酸。在一些实施例中，该方法包括将该杂构多核苷酸连接于杂交到其末端毗连位置上的多核苷酸。在一些实施例中，该杂交物固定在固相载体上。
还提供试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包括上述杂构多核苷酸和固相载体，在该固相载体上连接有至少一种含L型多核苷酸序列部分的多核苷酸，该L型多核苷酸序列部分与该杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分互补。在一些实施例中，试剂盒含有多种固相载体，各载体连接有含有L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸，该L型多核苷酸序列部分包含与所述多种载体中的其它固相载体上的L型多核苷酸序列部分的序列不同的独特序列。在一些实施例中，该试剂盒包含处于不同位置的杂构多核苷酸的可寻址阵列，阵列中各多核苷酸含有L型杂构多核苷酸序列部分，该部分含有与阵列中其它位置上的杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分的序列不同的独特序列。在一些实施例中，该试剂盒包括至少10种不同的杂构多核苷酸，各多核苷酸含有与其它杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的独特序列。在一些实施例中，该试剂盒含有至少100种不同的杂构多核苷酸，各多核苷酸含有与其它杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的独特序列。
结合附图和以下描述，本发明的这些和其它特征将更明了。


图1显示寡核苷酸的D型DNA部分和该寡核苷酸的镜像L型DNA部分。
图2显示杂构寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交，和该杂构多核苷酸/靶杂交物的引物延伸。
图3显示标记的杂构寡核苷酸/靶杂交物的示范性实施例，其中(a)L型序列部分的末端共价连接于标记物；(b)D型序列部分共价连接于标记物；(c)靶标被多重标记；和(d)通过与标记的核苷酸5′-三磷酸的引物延伸掺入标记物。
图4显示杂构寡核苷酸探针与第二探针的连接。
图5显示使用杂构寡核苷酸引物进行PCR，形成L型序列标记的扩增子。
图6显示包含L型序列的固定寡核苷酸的可寻址阵列。以圆圈(“○”)代表的各位置可包含独特的L型序列。该L型序列可与杂构寡核苷酸的互补L型序列杂交。
图7显示标记有荧光染料(F)和猝灭剂(Q)的探针，由此，通过接近非杂交状态的猝灭剂而猝灭荧光(左)。当与靶序列杂交后，荧光染料和猝灭剂物理上分开得足够远，使得产生荧光。
图8显示示范性连接反应，接着PCR扩增。
图9显示可寻址阵列上的固定的标记杂交物的示范性实施例。
图10显示固定的标记杂交物的示范性例子，其中，该靶序列的多个核苷酸被标记，一个位置可被标记为对照。
图11显示使用标记的双脱氧核苷酸5′-三磷酸在SNP位点(X)对杂构寡核苷酸/靶杂交物进行的引物延伸。可将延伸的杂交物变性，使延伸的引物与靶标分离、纯化和检测。
图12显示点状阵列上杂交的平均荧光强度的定量、三维图像。
具体实施例方式
以下将涉及本发明一些实施方式的详细内容，这些实施方式的实施例将在后面的实施例中阐述。虽然本发明以代表性实施方式进行描述，但是，应该理解的是，不能认为本发明受到这些实施方式的限制。相反，本发明覆盖可包含于本发明范围之内的所有变化、改动和等价形式。
定义按照《有机化合物的立体化学》〔(1994)，E.Eliel和S.Wilen，John Wiley&Sons，Inc.，纽约〕使用立体化学的术语。
术语“构型”指区分立体异构体(相同结构的异构体)的原子空间排列，而非由于构象不同而产生的差异。构象异构体是构象不同的立体异构体。本文新的组合物的绝对构型是由它们的手性中心所确定(如糖碳原子)。手性碳用字母符号表示其旋转R表示顺时针，S表示逆时针；由Cahn、Ingold和Prelog的键优先原则定义〔《有机化学》，第15版(2000)，J.McMurry，Brooks/Cole，Pacific Grove，CA，第315-319页〕。
术语“异构”指含有由不同立体化学构型组成的亚基的化合物。
“核苷酸碱基”指含氮的、在与互补的核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物配对时能形成Watson-Crick氢键的杂环部分，如嘌呤、7-脱氮嘌呤或嘧啶。典型的核苷酸碱基是天然产生的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和天然产生的核苷酸碱基的类似物(Seela，美国专利号5446139)，如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮腺嘌呤、次黄嘌呤、烟云杯伞素、硝基吡咯〔Bergstrom，1995，J.Amer.Chem.Soc.，1171201-09〕、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤(Seela，美国专利号6147199)、7-脱氮鸟嘌呤(Seela，美国专利号5990303)、2-氮杂嘌呤(Seela，WO 01/16149)、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、4-甲基吲哚、吡唑啉酮[3，4-D]嘧啶、“PPG”〔Meyer，美国专利号6143877和6127121；Gall，WO 01/38584〕、和亚乙酰基腺嘌呤〔Fasman(1989)，《生物化学和分子生物学实践手册》，第385-394页，CRC出版社，Boca Raton，F1〕。
“核苷”指由核苷酸碱基连接于糖(如呈天然的β或α端基异构构型的核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖)的C-1′碳组成的化合物。所述糖可以是取代或未取代的。取代的核糖包括但不限于其一个或多个碳原子(如2′-C原子)被一个或多个相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或卤素基团取代的那些核糖，其中各R独立为H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。核糖例子包括核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖和2′-烷基核糖，如2′-O-甲基、4′-α-端基异构核苷酸、1′-α-端基异构核苷酸〔Asseline，1991，Nucl.Acids.Res.，194067-74〕、2′-4′-和3′-4′-连接的和其它“锁定的”(locked)或“LNA”双环糖修饰物(WO 98/22489、WO 98/39352、WO 99/14226)。多核苷酸内的代表性LNA糖类似物包括以下结构
式中，B是任何核苷酸碱基。
糖类包括在2′或3′位置上的修饰，如甲氧基、乙氧基、烯丙基氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷和核苷酸包括天然D构型异构体(D型)以及L构型异构体(L型)〔Beigelman，美国专利号6251666；Chu，美国专利号5753789；Shudo，EP0540742；Garbesi(1993)，Nucl.Acids Res.，214159-65；Fujimori(1990)，J.Amer.Chem.Soc.，1127435；Urata，1993，Nucleic Acids Symposium Ser.No.2969-70〕。当核苷酸碱基是嘌呤如A或G时，所述核糖通常连接于该核苷酸碱基的N9位置。当核苷酸碱基是嘧啶如C、T或U时，该戊糖通常连接于该核苷酸碱基的N1位置〔Kornberg和Baker，1992，《DNA复制》，第二版，Freeman，San Francisco，CA〕。
“核苷酸”指核苷的磷酸酯，作为单体单元或者位于核酸之内。“核苷酸5′-三磷酸”指在其5′位置上具有三磷酸酯基团的核苷酸，有时称为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”，以具体指出该核糖的结构特征。三磷酸酯基团还包括取代各个氧的硫，例如α-硫代-核苷酸5′-三磷酸。关于核酸化学的综述，可参见Shabarova，Z.和Bogdanov，A.，《核酸的高级有机化学》“Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids”，VCH，纽约，1994。
在本文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，指核苷酸单体的单链或双链聚合物，包括通过核苷酸间的磷酸二酯键连接如3′-5′和2′-5′、反向连接、如3′-3′和5′-5′、支链结构或核苷酸间类似物而连接的2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸与平衡离子如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等相结合。多核苷酸可全部由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。多核苷酸可由核苷酸碱基和糖类似物组成。多核苷酸大小通常从几个单体单元(如通常在本领域中将其称为寡核苷酸时，为5-40个单体单元)到几千个单体核苷酸单元。除非另有说明，否则不论在什么时候表示多核苷酸，都应理解为核苷酸顺序从左到右是5′到3′，且除非另有说明，否则A表示脱氧腺苷、C表示脱氧胞苷、G表示脱氧鸟苷、T表示胸苷。
术语“杂构寡核苷酸”指含有不同构型的核苷酸组成的寡核苷酸。杂构寡核苷酸具有一个或多个L型核苷酸部分和一个或多个D型核苷酸部分。
“核苷酸间类似物”指多核苷酸的磷酸酯类似物或非磷酸酯类似物。磷酸酯类似物包括(i)C1-C4烷基膦酸酯，如甲基膦酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C1-C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；和(v)二硫代磷酸酯。非磷酸酯类似物包括其糖/磷酸酯部分被酰胺键取代的化合物，如2-氨基乙基甘氨酸单元，通常称为PNA〔Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)，Science，2541497-1500〕。
“多肽”指包括蛋白质、合成肽、抗体、肽类似物和肽模拟物的聚合物，其中其单体是氨基酸，并通过酰胺键相互连接。当氨基酸是α氨基酸时，不论是L-光学异构体还是D-光学异构体都可使用。此外，也包括非天然的氨基酸，例如valanine、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可用于本发明。用于本发明的所有氨基酸可是D-或L-光学异构体。此外，其它肽模拟物也可用于本发明。关于一般综述，可参见Spatola，A.F.，《氨基酸、肽和蛋白质的 化学和生物化学》，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，纽约，第267页，1983。
术语“氨基酸”指天然产生的氨基酸和合成的氨基酸，以及含有氨基和羧酸基团的氨基酸类似物。
“连接位点”指在某部分或分子如猝灭剂、荧光染料或多核苷酸上的位点，连接物或其它部分可通过该位点进行共价连接，或者能够被共价连接。
“连接物”指含有共价键或将其一部分或其自身共价连接于另一部分(如将猝灭剂连接于多核苷酸)的原子链的分子的化学部分。“可切割连接物”是具有一个或多个可由反应或条件而断裂的共价键的连接物。例如，分子中的酯是可被试剂如氢氧化钠切断的连接物，结果产生含有羧酸酯的片段和含羟基的产物。
“反应性连接基团”指分子上的化学反应性取代基团或部分，如亲核的或亲电子的，能与另一分子发生反应形成共价键。反应性连接基团包括活性酯类，它们通常被用于与氨基连接。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯具有针对脂肪族氨基的选择性，可形成非常稳定的脂肪族酰胺产物。它们与芳族胺、醇和苯酚(酪氨酸)以及组氨酸的反应速率相对较低。NHS酯与胺在非水性条件下的反应是容易进行的，因此可用它们衍生化小肽和其它低分子量的生物分子。实际上，含羧酸的任何分子或经化学修饰而含有羧酸的任何分子可被转化成其NHS酯。NHS酯具有具改善水溶性的磺酸基团。
“取代的”在本文指分子中有一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能团或部分取代。例如，未取代的氮是-NH2，而取代的氮是-NHCH3。代表性的取代基包括但不限于卤素，如氟和氯；C1-C8烷基；硫酸基；磺酸基；氨基；铵；酰氨基；腈；硝基；烷氧基(-OR，其中R是C1-C12烷基)；苯氧基；芳基；苯基；多环芳基；杂环基；水溶性基团以及连接部分。
“烷基”指从母链烷烃、烯烃或炔烃的单个碳原子上除去一个氢原子而得到的饱和或不饱和的、支链、直链、支链、环状、或取代的烃基。典型的烷基由1-12个饱和和/或不饱和碳组成，包括但不限于甲基、乙基、氰基乙基、异丙基、丁基等。
“亚烷基(alkyldiyl)”指饱和或不饱和的、支链、直链、环状或取代的1-12个碳原子烃基，具有两个单价自由基中心，这两个单价自由基中心从母链烷烃、烯烃或炔烃的相同碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而产生。典型的亚烷基包括但不限于1，2-亚甲基(-CH2CH2-)、1，3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等。“亚烷氧基(alkoxydiyl)”指具有两个单价自由基中心的烷氧基，其中一单价自由基中心由除去氧的氢原子而获得，另一单价自由基中心由除去碳原子的氢原子而获得。代表性的亚烷氧基包括但不限于亚甲氧基(-OCH2-)或1，2-亚乙氧基或亚乙烯氧基(-OCH2CH2-)。“亚烷基氨基”(alkylaminodiyl)指具有两个单价自由基中心的烷基氨基基团，其中一个自由基由除去氮的氢原子获得，另一个自由基由除去碳原子的氢原子而获得。代表性的亚烷基氨基包括但不限于-NHCH2-、-NHCH2CH2-和-NHCH2CH2CH2-。“亚烷基酰胺基”(alkylamidediyl)指具有两个单价自由基中心的烷基酰胺基团，其中一个自由基由除去氮的氢原子获得，另一自由基由除去碳原子的氢原子获得。代表性的亚烷基酰胺基包括但不限于-NHC(O)CH2-、-NH(CO)CH2CH2-和-NH(CO)CH2CH2CH2-。
“芳基”指5-14个碳原子的单价芳族烃基，由除去母芳环系统一个碳原子的一个氢原子而获得。代表性的芳基包括但不限于从苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等获得的基团，包括取代的芳基。
“亚芳基”指未饱和的5-14个碳原子的环状或多环烃基，具有共轭共振电子系统和至少两个单价自由基中心，其中所述自由基由除去母芳基化合物的两个不同碳原子的两个氢原子而获得，包括取代的亚芳基。
“取代的烷基”、“取代的亚烷基”、“取代的芳基”、“取代的亚芳基”分别指其一个或多个氢原子独立被其它取代基取代的烷基、亚烷基、芳基和亚芳基。典型的取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、R、OH、-OR、-SR、SH、NH2、NHR、NR2、-+NR3、-N＝NR2、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N2+、-N3、-NHC(O)R、-C(O)R、-C(O)NR2、-S(O)2O-、-S(O)2R、-OS(O)2OR、-S(O)2NR、-S(O)R、-OP(O)(OR)2、-P(O)(OR)2、-P(O)(O-)2、-P(O)(OH)2、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-CO2-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-C(NR)NR2，其中R独立为-H、C1-C6烷基、C5-C14芳基、杂环或连接基团。取代基还包括二价的桥连官能团，如二叠氮基(-N＝N-)、酯、醚、酮、磷酸酯、亚烷基和亚芳基。
“杂环”指环系统中具有其一个或多个环原子是杂原子如氮、氧和硫(相对于碳)的分子。
“可酶促延伸的”指一种核苷酸，它能(i)通过聚合酶的作用被酶促掺入多核苷酸的末端；(ii)支持进一步的引物延伸。可酶促延伸的核苷酸包括核苷酸5′-三磷酸，即dNTP和NTP以及它们的标记形式。
“可酶促掺入的”指能通过聚合酶的作用经酶促掺入多核苷酸的末端的核苷酸。可酶促掺入的核苷酸包括dNTP、NTP以及2′，3′-双脱氧核苷酸5′-三磷酸(即ddNTP)以及它们的标记形式。
“终止子核苷酸”指能通过聚合酶的作用经酶促掺入多核苷酸的末端，但之后不能被延伸的核苷酸，即，终止子核苷酸可酶促掺入但不可酶促延伸。终止子核苷酸的例子包括ddNTP和2′-脱氧，3′-氟核苷酸5′-三磷酸及其标记的形式。
“靶标”、“靶多核苷酸”和“靶序列”指待检测其存在与否的特殊的多核苷酸序列，它是与互补的多核苷酸如引物或探针杂交的对象。靶序列可由DNA、RNA及其类似物组成，包括它们的组合。靶标可以是单链的，也可以是双链的。在引物延伸过程中，与引物形成杂交双链体的靶多核苷酸也可称为“模板”。模板可用作另一互补核酸的合成的样板〔《生物医学和分子生物学简明词典》，1996，CPL Scientific Publishing Services，CRC出版社，Newbury，UK〕。用于本发明的靶序列可衍生自任何活的或曾经活着的生物体，包括但不限于原核生物、真核生物、植物、动物和病毒。靶序列可源自细胞核，如基因组DNA，或可源自核外核苷酸，如质粒、线粒体核酸、各种RNA等。如果靶核酸是RNA的话，可先将其反转录成cDNA。存在各种方法，用于获得用于本发明组合物和方法的靶核酸序列。当通过从生物学样品中分离获得靶序列时，优选的分离技术包括(1)有机抽提，接着乙醇沉淀，如使用苯酚/氯仿有机试剂〔如Ausubel等编辑，1993，《分子生物学的目前方法》，第1卷，第2章，第I部分，JohnWiley&Sons，纽约〕，或者DNA自动提取仪(如341型DNA提取仪，AppliedBiosystems，Foster City，CA)；(2)固相吸附方法〔如Boom等，美国专利号5234809；Walsh等，1991，Biotechniques，10(4)506-513〕；和(3)盐诱导的DNA沉淀法〔如Miller等，1988，Nucleic Acids Research，16(3)9-10〕。
术语“探针”指能通过与靶多核苷酸序列的碱基互补而形成双链体结构的多核苷酸。例如，探针可被标记，如被猝灭剂部分或由一个报道子和猝灭剂组成的能量转移对标记。
“引物”指设计用于与靶序列、探针或连接产物的互补的引物特异性部分杂交、并进行引物延伸的序列明确的寡核苷酸。引物起到核苷酸聚合的起始位点的作用〔《生物医学和分子生物学简明词典》，1996，CPL Scientific PublishingServices，CRC出版社，Newbury，UK〕。
术语“双链体”指核酸的分子间或分子内双链部分，该部分通过核苷酸碱基的Watson-Crisk、Hoogsteen或其它序列特异性相互作用可发生碱基配对。双链体可由引物和模板链或探针和靶链组成。“杂交物”指通过碱基特异性相互作用(如氢键)而形成的核酸的双链体、三链体或其它碱基配对复合物。
术语“引物延伸”指使用模板依赖性聚合酶沿着5′到3′方向使与靶序列退火的引物延伸的过程。根据某些实施例，在适当的缓冲液、盐、pH、温度和核苷酸三磷酸(包括其类似物和衍生物)的存在下，模板依赖性聚合酶在退火引物的3′端开始，将与该模板链互补的多核苷酸掺入，以产生互补的链。
术语“标记物“指可被连接到多核苷酸的任何部分，该部分(i)可提供可检测的信号；(ii)可与第二标记物相互作用，从而改变由第二标记物(如FRET)提供的可检测信号；(iii)可使杂交(即双链体形成)稳定；(iv)赋予捕获功能，即疏水性亲和力、抗体/抗原、离子配位；或(v)改变物理特性，如电泳迁移率、疏水性、亲水性、溶解度或色谱行为。可采用大量的已知技术中的任何一种，使用已知的标记物、连接键、连接基团、试剂、反应条件和分析和纯化方法实施标记。标记物包括能产生或猝灭可测荧光、化学发光或生物发光信号的发射光或吸收光的化合物〔Kricka，L.，Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992)，Academic出版社，San Diego，第3-28页〕。用于标记生物分子的荧光报道染料包括荧光素(例如，美国专利号5188934、5654442、6008379、6020481)、罗丹明(例如，美国专利号5366860、5847162、5936087、6051719、6191278)、二苯嗪(benzophenoxazines)(例如，美国专利号6140500)、供体或受体的能量转移染料对(例如，美国专利号5863727、5800996、5945526)和花青(例如，Kubista，WO 97/45539)，以及任何其它能产生可检测信号的荧光标记物。荧光染料的具体例子包括6-羧基荧光素、2′，4′，1，4-四氯荧光素、和2′，4′，5′，7′，1，4-六氯荧光素(如美国专利号5654442)。
另一类标记物是使杂交稳定的部分，它们起到增强、稳定或影响双链体的杂交的作用，如嵌入剂、小沟槽粘合剂和交联官能团〔Blackburn，G.和Gait，M.编辑，《DNA和RNA结构》，NucleicAcids in Chemistry and Biology，第2版，1996，牛津大学出版社，第15-81页〕。另一类标记物通过特异性或非特异性捕获影响到分子的分离或固定，例如生物素、洋地黄毒苷和其它半抗原〔Andrus，《PCR探针和引物的5′非同位素标记的化学方法》，1995，PCR2 A PracticalApproach，牛津大学出版社，牛津，第39-54页〕。非反应性标记方法、技术和试剂可在《非反应性标记，实践介绍》(Garman，A.J.，1997，Academic出版社，San Diego)中查阅。
在本文中，“能量转移”指激发基团(如荧光报道染料)的激发态能量通过空间或通过键转移给其它基团(如猝灭剂部分)的过程，该过程可能减弱(猝灭)或驱散或转移能量。可通过荧光共振能量转移、直接的能量转移和其它机制发生能量转移。确切的能量转移机制并不限制本发明。应理解，本申请中提及能量转移的任何内容都包括所有的这些机制不同的现象。
“能量转移对”指参与能量转移的任何两个部分。通常，所述部分的一个起到荧光报道子(即供体)的作用，另一部分起到荧光猝灭剂(即受体)的作用〔《荧光共振能量转移》，Selvin P.(1995)，Methods Enzymol，246300-334；dosRemedios C.G.(1995)，J.Struct.Bio1.，115175-185；《共振能量转移方法和应用》，Wu P.和Brand L.(1994)，Anal Biochem，2181-13〕。荧光共振能量转移(FRET)是两个部分之间的距离依赖性相互作用，其中，激发能量(即光)从供体(“报道子”)转移给受体而不发射光子。受体可以是荧光，并以较长的波长发射转移的能量，或者，它可以是非荧光，并起到消除报道子的可检测荧光的作用(猝灭)。FRET可以是分子间或分子内的事件，依赖于供体和受体的分离的相反第六能量(inverse sixth power)，使其可用于远距离比较生物大分子的维度。因而，如果两个部分之间的距离受到一些可检测的量而变化时，能量转移对的光谱特征在一些可测量方法中将产生整体变化。已发展了掺入了荧光供体-非荧光受体组合的自猝灭探针，主要用于检测蛋白质水解〔Matayoshi，(1990)Science 247954-958〕和核酸杂交〔《能量转移和荧光猝灭的检测》，Morrison，L.，Nonisotopic DNA Probe Techniques，L.Kricka编辑，Academic出版社，SanDiego，(1992)，第311-352页；Tyagi S.(1998)Nat.Biotechnol.1649-53；TyagiS.(1996)Nat.Biotechnol 14303-308〕。在大多数应用中，供体和受体染料不同，在这种情况下，可通过受体的光敏荧光或供体荧光的猝灭的发生检测FRET。
术语“猝灭”指由猝灭剂部分通过(不论何种形式机制的)能量转移引起荧光报道子部分的荧光减少。因此，荧光报道子的发光因猝灭剂的存在导致发射信号的强度比期望的低，甚至完全无信号。
术语“退火”和“杂交”可交互使用，指一个核苷酸与另一核苷酸的碱基配对相互作用，结果形成双链体或其它较高等级的结构。主要的相互作用是通过Watson/Crisk和Hoogsteen型氢键的碱基特异性，即A/T和G/C。
术语“固相载体”指可在其上合成、连接或固定寡核苷酸的任何固相材料。固相载体包括术语如“树脂”、“固相”和“载体”。固相载体可以由有机聚合物如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺组成，以及它们的共聚物和移植物。固相载体还可以是无机物，如玻璃、硅石、可控空隙玻璃(CPG)或反相硅石。固相载体的构型可以是珠、球体、颗粒(particle)、细粒(granule)、凝胶或表面。表面可以是平坦的，基本上平坦的或非平坦的表面。固相载体可以是多孔或无孔，可具有膨胀或非膨胀性能。固相载体可以被制成孔、凹陷或其它容器、器皿、特征或定位的形式。多个固相载体可被制成各种位置的阵列，对于机器人传送试剂而言是可寻址的，或者根据检测方法而制造，包括激光照射和共聚焦或偏斜光收集的扫描。
“阵列”或“微阵列”指固相载体上或器皿排列中存在的多核苷酸的预定空间排列。某些阵列模式指“芯片”或“生物芯片”〔M.Schena编辑，MicroarrayBiochip Technology，BioTechnique Books，Eaton Publishing，Natick，MA(2000〕。阵列可包含低密度数量的可寻址位置，如2到约12，中等密度如约上百或更多的位置，或者高密度数量，如上千或更多。通常，阵列模式是几何学形状规则的，这考虑到了制作、操作、放置、堆放、试剂引入、检测和储存。阵列可以被制作成行列的形式，各位置之间具有规律性间隔。或者，各位置可成束状(bundle)、混合或均匀地掺合，以进行均等的处理或采样。阵列可包含大量的通过检测方法(包括激光和共聚焦或偏斜光收集的扫描)而制作的可寻址位置，这样各位置在空间上可寻址，适用于高通量处理、机器人传送、掩蔽或试剂采样。
术语“终点分析”指仅当反应基本完成时才采集数据的方法。
术语“实时分析”指PCR过程中定期性监测。在各预定的热循环过程中或各循环中用户定义的阶段，使用某些系统如ABI7700和7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行监测。使用FRET探针实时分析PCR，测量每轮循环的荧光染料信号变化，优选减去任何内部的对照信号。代表性杂构寡核苷酸组合物在一些实施例中，本发明的组合物包括具有多种用途(如用于分子生物学和核酸诊断试验)的杂构寡核苷酸。杂构寡核苷酸是含有至少一种连接于至少一种D型(D构型核苷酸)序列部分的L型(L构型核苷酸)序列部分。所述序列部分可通过任何方式相互连接，通常通过键或连接物连接。在一些实施例中，D型序列部分含有至少5个D-核苷酸，通过杂交到其L型序列互补物而形成稳定的双链体。在一些实施例中，杂构寡核苷酸包括通过键或连接物共价连接于D型序列部分的L型序列部分，该L型序列部分包含5-50个L-核苷酸，该D型序列部分包含5-50个D-核苷酸。本发明化合物糖部分的L构型与大多数天然产生的核苷如胞苷、腺苷、胸苷、鸟苷和尿苷的核糖部分的D构型相反。糖的L构型由1′、3′和4′碳原子以及核糖的2′碳原子的手性所确定。L型核苷酸是天然产生的D型核苷酸的镜像、对映立体异构体。图1显示DNA寡核苷酸的镜像D型和L型部分。绝对构型在1′、3′和4′不对称手性碳位置标出。RNA在2′位置具有额外的手性碳。
在一些实施例中，本发明包括含有至少一个标记物的标记的杂构寡核苷酸。通常，标记物可通过键或连接物共价连接于杂构寡核苷酸。标记物可以是上述定义的标记物，如荧光染料、猝灭剂、能量转移染料、量子点、洋地黄毒苷、生物素、迁移率改变剂、多肽、使杂交稳定的部分或化学发光前体。代表性的荧光染料标记物包括选自荧光素、罗丹明和花青结构类型的化合物，代表性的结构如下
猝灭剂标记物通过分子内荧光共振能量转移(FRET)作用而经历荧光染料发射的荧光能量转移。猝灭剂可自身是荧光性的或非荧光性的(例如，参见Reed，WO 01/42505；和Cook，WO 00/75378)。猝灭剂标记物包括选自荧光素、罗丹明、硝基花青(Lee，美国专利号6080868)的化合物、和如芳基叠氮结构类型的化合物。
标记物还可包含使杂交稳定的部分，如小沟槽粘合剂、嵌入剂、聚阳离子(如多赖氨酸和精胺)或者交联官能团。杂交稳定剂可增加碱基配对的稳定性，即亲和性，或者引物和靶标或探针和靶标的杂交速率〔Corey(1995)，J.Amer.Chem.Soc.，1179373-74〕。杂交稳定剂起到增加碱基配对的特异性的作用，这可以极佳的互补寡核苷酸与靶序列之间Tm的大差异为例证，其中所得的双链体含有一个或多个Watson/Crick碱基对的错配〔Blackburn，G.和Gait，M.编辑，《DNA和RNA结构》，在《核酸化学和生物学》中，第2版，1996，牛津大学出版社，第15-81页和337-46页〕。代表性的小沟槽粘合剂包括Hoechst33258〔Rajur(1997)，J.Org.Chem.，62523-29〕、偏端霉素、纺锤菌素(Gong(1997)Biochem.and Biophys.Res.Comm.，240557-60〕和CDPI1-3(美国专利号5801155；WO 96/32496)。小沟槽粘合剂的一个例子是CDPI3，由下式表示 式中，L是连接于杂构寡核苷酸的位点(Dempcy，WO 01/31063)。
当标记物的连接物连接于杂构寡核苷酸的核苷酸碱基时，虽然其它的连接位点也可以使用，但核苷酸碱基的连接位点通常为嘌呤核苷酸碱基的8位、7-脱氮嘌呤核苷酸碱基的7或8位、嘧啶核苷酸碱基的5位。标记物的连接物可以是任何亚烷基或亚芳基连接物，或其取代的形式，包括以下结构B-C≡C-CH2(OCH2CH2)mNR1-LB-C≡C-CH2(OCH2CH2)mNR1-X-L式中，B是核苷酸碱基；L是标记物；R1是H或C1-C8烷基；m是0、1或2(Khan，美国专利号5770716和5821356；Hobbs，美国专利号5151507)；X是酰胺结构，包含以下代表性结构 其中n是1-5的整数。
标记的杂构寡核苷酸可具有连接于其核苷酸碱基的标记物。代表性的例子是结构I 式中，L是标记物；B是核苷酸碱基，包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤和7-脱氮鸟苷；R10是H、OH、卤化物、叠氮化物、胺、烷基胺、烷基(C1-C6)烯丙基、烷氧基(C1-C6)、OCH3或OCH2CH＝CH2；R15是H、磷酸酯、核苷酸间磷酸二酯或核苷酸间类似物；R16是H、磷酸酯、核苷酸间磷酸二酯或核苷酸间类似物；和R17是键或连接物。含有炔丙基或乙烯基的代表性连接物如下所示
式中，n是0、1或2。
或者，标记的杂构寡核苷酸可具有连接于5′末端的标记物。代表性的例子是结构II 式中，L、B和R10和R15的定义如结构I所述。各Y独立为O、NH、NR或S，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基。R18可以是连接键或任何共价连接物，用于连接杂构寡核苷酸和标记物的5′磷酸酯或磷酸酯类似物。例如，R18可以是长1-100的乙烯氧基链(也称为聚乙烯氧基或PEO)单元，-(CH2CH2O)n-，其中n为1-100；C1-C12亚烷基、取代的C1-C12亚烷基；C5-C14亚芳基和取代的C5-C14亚芳基。R18的代表性例子如下所示 其中n是1-10。
或者，标记的杂构寡核苷酸可在其3′末端连接有标记物。代表性的例子是结构III 式中，L、Y、B、R10、R16和R18的定义如结构I和结构II的定义。
标记的杂构寡核苷酸可含有一个以上标记物。杂构寡核苷酸的一个实施例包含含有报道子染料和猝灭剂的能量转移对，从而可在报道子染料和猝灭剂之间发生荧光能量转移。报道子染料可以是任何合适的染料，如荧光素、罗丹明、1，2-二二酮(dioxetane)化学发光染料、香豆素、萘胺、花青或bodipy染料。
通常，报道子染料通过第一键连接于杂构寡核苷酸，猝灭剂通过第二键连接于杂构寡核苷酸。报道子染料和猝灭剂的取向为，当标记的杂构寡核苷酸杂交到靶多核苷酸序列时，报道子染料不被猝灭剂完全猝灭，当标记的寡核苷酸未与靶多核苷酸序列杂交时，报道子染料被猝灭剂有效猝灭。
在一些实施例中，报道子染料和猝灭剂标记物共价连接于杂构寡核苷酸的末端。例如，报道子染料和猝灭剂中有一个连接于3′端，另一个连接于5′端。
可以选择报道子/猝灭剂杂构寡核苷酸的核苷酸序列，使其包含足够的自我互补性，能形成稳定的发夹结构，这是由于存在侧接与靶标互补的D型序列部分的互补L型DNA序列部分的缘故，当该杂构寡核苷酸未与互补的靶序列杂交时，该L型DNA序列部分形成双链体。在此实施例中，报道子和猝灭剂部分可位于各L型序列部分的远端，这样，在形成发夹结构时，该报道子和猝灭剂部分非常靠近，当内部D型序列部分杂交到互补的靶序列时，报道子和猝灭剂部分远离。可通过序列设计优化形成发夹的报道子/猝灭剂杂构寡核苷酸的热熔点性能(Tm)，以便在不存互补靶序列时，报道子产生的荧光能被猝灭剂有效猝灭，而在存在互补靶序列并形成杂交双链体后，不发生猝灭，或者基本上不发生和不可测量，而荧光增加。通过这样的作用，可检测样品中特异性靶序列的存在，且在一些情况中可进行定量。当靶序列在PCR复制子中时，可监测和检测PCR。
在一些实施例中，本发明包括标记有能量转移对的杂构寡核苷酸，该能量转移对含有供体和受体。供体染料吸收第一波长光，并发射激发能量。受体染料能吸收供体染料发射的激发能量，作为应答，产生第二波长的荧光。能量转移对具有可用于同时检测混合物(如DNA测序)中的多个标记底物的优点。可在一组能量转移染料中使用一种供体染料，这样各染料对相同的波长具有强吸收。然后改变能量转移组中的受体染料，可通过它们各自的发射最大值而通过光谱分辨这些受体染料。
供体染料可通过促进供体和受体染料间有效能量转移的连接物而连接于受体染料〔如参见Lee，美国专利号5800996；Lee，美国专利号5945526；Mathies，美国专利号5654419；Lee(1997)，Nucleic Acids Res.252816-22〕。或者，可在杂构寡核苷酸上的不同连接位点标记供体染料和受体染料。例如，可用供体染料在5′末端标记该杂构寡核苷酸，用受体染料在3′末端标记该杂构寡核苷酸。
含有能量转移染料对的供体和受体染料可以是能经受能量转移过程的任何荧光部分，包括荧光素、对甲氨基酚、罗丹明、花青、酞菁、squaraine、bodipy、香豆素或二苯嗪。
通常，供体染料和受体染料之间的连接物含有如下显示的结构 式中，Z是NH、S或O；R21是连接于供体染料的C1-C12烷基；R22是键、C1-C12亚烷基，或具有至少一个不饱和键的5或6元环，或连接于羰基碳的稠合环结构；R23包括将连接物连接于受体染料的官能团。R22可以是环戊烯、环己烯、呋喃、硫代呋喃、吡咯、吡唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、唑、茚、苯并呋喃、硫代萘、吲哚和萘或它们的取代形式。具体而言，连接物可具有以下结构 式中，n为2-10，通常而言，R23可包含以下结构 式中，R24是C1-C12烷基，Z的定义同上。
在一个实施例中，供体染料和受体染料之间的连接物包括赋予该连接物一定程度结构刚性的官能团，如烯烃、二烯烃、炔烃、具有至少一个不饱和键的5或6元环或稠合环结构。能量转移对的供体染料和受体染料可通过连接物而连接，该连接物具有以下代表性结构 式中，(D/A)是供体染料或受体染料，X可以是 苯环可被如磺酸、膦酸和/或其它带电基团取代。
在一些实施例中，杂构寡核苷酸或标记的杂构寡核苷酸可通过连接键或连接物共价于固相载体。寡核苷酸的连接和固定可在以下情况发生(1)在寡核苷酸合成过程中(原位)；或(2)可预先合成寡核苷酸，然后在溶液中通过偶联、点样(spotting)、固定或沉积方法连接于固相载体。
例如，固相载体可以是聚苯乙烯、可控空隙玻璃、硅胶、硅石、聚丙烯酰胺、磁珠、聚丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或它们的共聚物或移植物。在一些实施例中，固相载体可含有小颗粒、珠、膜、玻璃料、载玻片、平板、显微机械加工芯片、链烷硫醇-金层、无孔表面、可寻址阵列、凝胶或固定多核苷酸的基质。
在一些实施例中，可通过可切割的或不可切割的连接物将杂构寡核苷酸连接于此固相载体。可切割的连接物可因化学试剂、光或其它条件而断裂。例如，连接物可包含以下一种或多种结构 含酯的连接物可被碱性试剂如水性、水蒸气或气相的氢氧化铵〔Kempe，美国专利号5514789〕、无水胺〔Kempe，美国专利号5750672〕、水性氢氧化物试剂以及水性胺切断。可根据其速率和猝灭剂部分与固相载体之间的连接键的所需稳定性选择酯连接物。例如，草酸酯连接键相对不稳定，实际上，在室温下在浓氢氧化铵中它在几分钟内完全断裂。琥珀酸酯连接键在相同的条件下可能需要一个小时或更多才断裂。醌和二乙醇酸酯连接键对碱性解离具有中等稳定性。烷氧基甲硅烷基连接物可被强碱和氟化物试剂切割。二硫化物连接物可被还原剂如二硫苏糖醇(DTT)切割。
在一些实施例中，使用不可切割的连接物在固相载体上合成杂构寡核苷酸。然后可直接将该寡核苷酸用于杂交和其它目的。不可切割的连接物对于亚磷酰胺合成方法的酸性、碱性和氧化条件下稳定。不可切割的连接物可包括乙烯氧基单元、亚烷基、磷酸酯和/或酰胺官能团。
杂构寡核苷酸，不论是标记的还是未标记的，都可含有标准核苷酸碱基、糖和核苷酸间连接键的各种修饰和类似物。这些修饰和类似物可存在于寡核苷酸序列中的任何位置，并以任何适当的频率出现。这些修饰和类似物可存在于L型核苷酸、D型核苷酸或两者之中。
除了天然产生的磷酸二酯连接键外，本发明的寡核苷酸可含有一个或多个包含磷酸酯类似物(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯)的核苷酸间连接键。其它核苷酸间连接键包括DNA或RNA的糖/磷酸酯骨架已被一个或多个非环状的、非手性的和/或中性聚酰胺连接键所取代的那些连接键。一类核苷酸间类似物是肽核酸(PNA)家族。使核苷酸碱基通过酰胺键连接于连接物的2-氨乙基甘氨酸多酰胺连接是PNA的一个例子，已得到很好的研究，并显示具有异常的杂交特异性和亲和性〔Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science，2541497-1500；Egholm(1993)，Nature，365566-68〕。PNA可以相同或相反的方向杂交到其靶互补物上。但是，反向双链体(其中，PNA的羧基末端结合于DNA的5′末端，PNA的氨基末端结合于DNA的3′末端)通常更稳定〔Egholm(1993)，Nature，365566-68〕。已知PNA探针以高特异性和亲和性与靶DNA序列结合〔Coull，美国专利号6110676〕。本发明的杂构寡核苷酸包含PNA-DNA嵌合物，具有不连续的PNA和L型核苷酸序列部分。实际上，在任何组合或序列中共价连接PNA单体与亚磷酰胺核苷，可合成这些嵌合物。已开发了合成PNA-DNA嵌合物的有效自动化方法〔Vinayak(1997)，Nucleosides&Nucleotides，161653-56；Uhlmann(1997)，Angew.Chem.，Intl.Ed.Eng.，352632-35；Uhlmann，EP 829542；Van derLaan(1997)Tetrahedron Lett.，382249-52；Van der Laan(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.，8663-68〕。
核苷酸碱基类似物的具体例子包括如2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤或2-硫代嘧啶。
2′或3′位置上的糖修饰包括如C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C5-C14芳氧基、C5-C14芳基、氨基、C1-C6烷基氨基、氟、氯或溴。其它糖修饰可包括例如4′-α-端基异构核苷酸、1′-α-端基异构核苷酸、2′-4′L型LNA、2′-4′D型LNA、3′-4′L型LNA或3′-4′D型LNA。任何这些修饰可出现在L型序列部分、D型序列部分或两种之中。
代表性合成方法可采用亚磷酰胺方法，使用市售获得的亚磷酰胺核苷(ChemGenes公司，Ashland，MA；Applied Biosystems，Foster City，CA；Caruthers，美国专利号4415732)、载体如硅石、可控空隙玻璃(Caruthers，美国专利号4458066)和聚苯乙烯(Andurs，美国专利号5047524和5262530)和自动合成仪如392型、394型、3948型、3900型和Expedite DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在固相载体上合成杂构寡核苷酸〔Caruthers，美国专利号4973679；Beaucage(1992)，Tetradron，482223-2311〕。可以常规的3′到5′方向、其中5′被保护、3′-亚磷酰胺核苷的合成方法进行寡核苷酸合成，如IV。或者，可以5′到3′方向、其中3′被保护、5′为亚磷酰胺核苷的方法合成寡核苷酸，如V〔Wagner(1997)，Nucleosides&Nucleotides，161657-60〕。
对于结构式IV和V，代表性的取代基包括其中R1选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基(如氰基乙基)、C5-C14芳基、和取代的C5-C14芳基；R2是外向环(egocyclic)氮保护基团，如苄氧基、异丁酰基基、乙酰基、苯氧基乙酰基、芳氧基乙酰基、二甲基甲脒、二烷基甲脒和/或二烷基乙脒；R3是酸不稳定性保护基团，如DMT、MMT、pixyl、三苯甲基和三烷基甲硅烷基，其中烷基是C1-C6烷基；和R4和R5各自选自C1-C6烷基(如异丙基)、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基、取代的C5-C14芳基；或者，R4和R5一起形成C5-C14环烷基或C5-C14杂环烷基。
代表性的亚磷酰胺核苷IV和V是通常用于DNA合成的L构型的单体。用于制备本发明组合物的其它单体试剂包括D型亚磷酰胺核苷、RNA亚磷酰胺核苷、2-氨乙基甘氨酸以及其它，它们具有适当的保护基团。可设计好自动合成仪程序，使其能在任何循环过程中传送安装在合成仪上试剂传送瓶中的L型和D型亚磷酰胺核苷。因而，杂构多核苷酸可使用L型和D型核苷酸的任何序列合成。
可根据各核苷的糖和核苷酸碱基的保护和亚磷酸化的已知程序和方法制备L型和D型亚磷酰胺核苷，用于寡核苷酸合成。D型核苷衍生自天然产生的D-DNA来源。可采用任何合适的合成方法制备L型亚磷酰胺核苷。例如，可由L核糖制备L型亚磷酰胺核苷，该L核糖可通过一系列步骤由L木糖制得〔Chu，美国专利号5753789；Fujimori〔1992)，Nucleosides&Nucleotides，11341-49；Beigelman，美国专利号6251666；Furste，WO 98/08856〕。
在一些实施例中，先用具有下式结构VI的标记的固相载体的方法合成标记的杂构寡核苷酸
其中，S是固相载体；A是连接物；X是具有三个或多个连接位点的连接物；L是标记物；Y选自O、NH、NR和S，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基和取代的C5-C14芳基；R3是可酸切断的保护基团或具有可酸切断的保护基团的核苷。使标记的固相载体与酸性试剂反应，以除去该可酸切断的保护基团。亚磷酰胺核苷单体具有可酸切断保护基团R3。将激活剂加到去保护的标记固相载体中，从而在Y和该核苷酸单体(可以是L型核苷或D型核苷)的3′或5′末端之间形成键。然后使固相载体与氧化剂反应，以将三价的核苷酸间亚磷酸酯转变成磷酸酯。步骤包括(1)去保护可酸切断的保护基团；(2)偶联核苷单体；(3)以循环的方式重复进行氧化，直到完成L型和D型核苷酸的所需序列。在氧化步骤之前或之后可进行额外的加帽步骤，以除去正在延伸的寡核苷酸上任何未反应的3′或5′羟基。
在一些实施例中，作为最后的偶联步骤，将亚磷酰胺标记物试剂偶联于寡核苷酸的末端，对其3′或5′末端进行标记。
标记的固相载体VI的代表性例子包括 式中，n为1-12，S是固相载体，A、L、Y和R3的定义见结构VI中的定义。
标记的固相载体VI的另一代表性例子是 式中，DMT是4，4′-二甲氧基三苯甲基。
标记的固相载体VI的另一代表性例子是 式中，R1是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C5-C14芳基或取代的C5-C14芳基；R2是外向环氮保护基团，如苄氧基、异丁酰基、乙酰基、苯氧基乙酰基、芳氧基乙酰基、二甲基甲脒、二烷基甲脒和/或二烷基乙脒。
对于一些应用，可能需要制备多种除独特序列部分外具有共同或保守的序列部分的杂构寡核苷酸。例如，在需要一组在其5′端具有共同的L型核苷酸序列、在其3′端具有不同的D型核苷酸序列的杂构寡核苷酸时，可在固相载体上，以5′到3′的方向，先用L型3′-保护(如DMT)的5′亚磷酰胺核苷(如V)开始合成。固相载体通常位于柱、顶端、孔、点或其它容器或位置中。合成规模可从几纳摩尔到一微摩尔或数微摩尔，虽然也可合成更多或更少的量。可通过依次添加L型3′-保护的5′亚磷酰胺核苷合成结合于该固相载体的L型核苷酸的序列(如包含5-50或更多的核苷酸)。可将该固相载体存储备用，或立即使用。可将其分配到多个容器或位置中，用于后续合成不同D型核苷酸序列。当该固相载体为珠或颗粒形式时，柱、顶端或其它容器形式可以分开时，可将珠以等量或不等量分配在两个或多个柱、顶端或其它容器中，并再收集起来，用于后续添加D型3′-保护的5′亚磷酰胺核苷。当该固相载体是固体表面、膜或玻璃料，可将该载体分开、碾碎、撕裂、切开，或者以其它分配方式处理，用于随后D型核苷酸序列的分开合成。D型序列部分的合成可以是平行或连续进行；在L型序列部分合成后立即或顺次进行直到达到需要。更通常，可先分别合成D型和L型序列部分，然后将它们连接形成嵌段聚合物，或者，可先合成一部分，接着顺次加入具有相反构型的单体。
可通过在合适的溶剂中(在该溶剂中，标记物和杂构寡核苷酸都是可溶的或略微可溶的)，采用本领域已知的方法，将标记物上的反应性连接基团(如猝灭剂部分)与该杂构寡核苷酸偶联，从而形成标记的杂构寡核苷酸。对于标记的方法，可参见Hermanson，Bioconjugate Techniques，(1996)，Academic出版社，San Diego，CA，第40-55、643-71页；Garman，1997，Non-Radioactive LabellingA Practical Approach，Academic出版社，伦敦。可除去起始原料或不需要的副产物，纯化得到出粗的标记杂构寡核苷酸，较佳在低温下并将其干燥保存，或保存在溶液中，以备用。
标记物可在其一个取代基位置上具有反应性连接基团，如猝灭剂的芳基-羧基基团或荧光素或罗丹明的5-或6-羧基，以用于通过连接键而共价连接。在一些实施例中，将标记物连接于杂构寡核苷酸的连接键不应(i)干扰杂交的亲和力或特异性；(ii)消除猝灭；(iii)干扰引物延伸；(iv)抑制聚合酶活性；或(v)不利地影响标记物的产生荧光、猝灭、捕获或杂交稳定特性。亲电子反应性连接基团与亲核基团如多核苷酸上的氨基和巯基形成共价键。亲电子反应性连接基团的例子包括活性酯、异硫氰酸酯、磺酰氯、磺酸酯、甲硅烷基卤化物、2，6-二氯三嗪、亚磷酰胺、马来酰胺、马来酰亚胺、卤代乙酰、环氧化物、烷基卤、烯丙基卤、醛、酮、酰叠氮、酐和碘乙酰胺。活性酯包括琥珀酰亚胺基(NHS)、羟基苯并三唑基(HOBt)和五氟苯基酯。
可预先形成、分离、纯化和/或特征分析标记物试剂的NHS酯，或者可原位形成该NHS酯，并使其与杂构寡核苷酸的亲核基团反应。通常，标记物的羰基通过与以下组合反应而被激活，从而获得NHS酯(1)碳二亚胺(carnodiimide)试剂，如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、EDC〔1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)；或脲试剂如TSTU〔O-(N-琥珀酰亚胺)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯〕、HBTU〔(O-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯〕或HATU〔O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯〕和(2)激活剂，如HOBt(1-羟基苯并三唑)或HOAt(1-羟基-7-叠氮苯并三唑)；和(3)N-羟基琥珀酰亚胺。
代表性的非核苷的亚磷酰胺标记物试剂具有以下通式VII 式中，L被保护或未保护，形成标记物；X是连接物或连接键；R30和R31分别为C1-C12烷基、C4-C10芳基和/或含有达10个碳原子的环烷基，或者R30和R31与亚磷酰胺的氮原子一起形成饱和的氮杂环；R32是亚磷酸酯保护基团，它防止寡核苷酸延伸〔Theisen(1992)，《寡核苷酸的荧光染料亚磷酰胺标记》，在Nucleic Acid Symposium Series No.27中，牛津大学出版社，牛津，第99-100页〕。通常，R32对于寡核苷酸合成条件是稳定的，并能用对杂构寡核苷酸或标记物的整合无不利影响的试剂从合成的寡核苷酸产物中除去。代表性的R32取代基包括(i)甲基；(ii)2-氰基乙基(-CH2CH2CN)；或(iii)2-(4-硝基苯基)乙基〔-CH2CH2(对硝基苯基)〕。亚磷酰胺标记物试剂的代表性例子包括其中(i)R30和R31各自是异丙基、(ii)R30和R31一起形成吗啉基、(iii)X是C1-C12烷基、和(iv)R32是2-氰基乙基的标记物试剂。或者，连接物X可以是 式中，n为1-10。代表性的亚磷酰胺标记物试剂具有结构式VIII 亚磷酰胺标记物试剂VII或VIII可与羟基(如共价连接于固相载体的杂构寡核苷酸的5′末端OH)在温和的酸激活条件下(如四唑)反应，形成核苷酸间亚磷酸酯基团，该基团之后被氧化成核苷酸间磷酸酯基团。在一些例子中，该亚磷酰胺标记物试剂含有的官能团在该试剂的合成过程中或在其接着用于标记杂构寡核苷酸的过程中需要被保护。所使用的保护基团依赖于官能团的性质，对于本领域技术人员而言是显而易见的〔Greene，T.和Wuts，P.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley&Sons，纽约，1991〕。作为使用5′-保护的3′-亚磷酰胺核苷(如IV)的通用3′到5′方向合成方法的结果，标记物将连接到寡核苷酸的5′末端。或者，当用3′-保护的5′-亚磷酰胺核苷(如V)的5′到3′合成方法时，寡核苷酸的3′末端被标记上亚磷酰胺标记物试剂(Vinayak，美国专利号6255476)。
其它亚磷酰胺标记物试剂(包括核苷性的和非核苷性的)都能在杂构寡核苷酸的其它位点进行标记，如在3′末端、核苷酸碱基、核苷酸间连接键、糖。在核苷酸碱基、核苷酸间连接键和糖位点上的标记得以实现内部标记和多个标记。
L型寡核苷酸阵列在一些实施例中，本发明包括含有固定的L型核苷酸的寡核苷酸阵列。含L型核苷酸的寡核苷酸(也称为“L型多核苷酸”或“L型寡核苷酸”)包含能与靶多核苷酸中的L型互补物(如杂构寡核苷酸的L型序列部分)杂交的L型核苷酸序列。通常，L型序列部分长至少为5个L-核苷酸，其长度可多至100或更多。阵列可包含两个到几千个含L型核苷酸的寡核苷酸的独特或相同的序列。在一个实施例中，该阵列上各位置具有预选择量的独特序列，如1皮摩尔到1纳摩尔。
在一些实施例中，固定的寡核苷酸含有本发明的杂构寡核苷酸。在一些实施例中，固定的寡核苷酸不含有杂构寡核苷酸。在一些实施例中，固定的寡核苷酸含有L型核苷酸但不含有D型核苷酸。
在本发明的阵列中，一个或多个L型寡核苷酸固定在各可寻址位置上。可寻址位置可以是器皿、分隔的区域、点或其它构型的排列，这样试剂、光、加热、冷却或其它操作可精心地针对这些分开的位置。该阵列为所有位置提供共同的操作，如通过冲洗阵列表面而对各位置平行洗涤、或直接照射整个表面、或对多孔微滴定板的各孔施加真空压力。
在一些实施例中，该阵列中的载体可含有一种或多种膜、珠或包被或未包被的颗粒。载体可含有磁性或顺磁性材料。
载体可含有结合的或固定的可空间寻址的L型核苷酸寡核苷酸或者特殊的配体，该寡核苷酸含有预定的捕获序列。
本发明的阵列和载体可具有各种几何学形状和构型，并可用大量不同已知的制作技术中的任何一种制成。代表性的制作技术包括但不限于原位合成技术(Southern，美国专利号5436327)；光介导的原位合成技术(Fodor，美国专利号5744305)；机器人点样技术〔Cheung(1999)，Nature Genetics，2115-19；Brown，美国专利号5807522；Cantor，美国专利号5631134；Drmanac，美国专利号6025136〕；或其上连接有寡核苷酸的珠阵列(Walt，美国专利号6023540)。本发明的固相载体还可包括大量固定在微滴定板中的硅圆片上的L型寡核苷酸(Rava，美国专利号5545531)。此外，本发明还包括固定在微球体或珠上的大量L型寡核苷酸，这些微球体固定于、安放在或以其它方式放置在光纤的末端。可由成束的光纤制作阵列组合物。由标记的L型寡核苷酸或其标记的杂交复合物产生的可检测信号可产生独特的光信号，可对该光信号进行解码，使单个位点所处的位置与杂交序列相关(Walt，美国专利号5244636和5250264)。
含L型核苷酸的固定寡核苷酸的一个例子具有结构式IX 式中，S、A、X和Y的定义如上述结构VI的定义。NL是L型核苷酸的序列；ND是D型核苷酸的序列；m是0-100的整数；n是5-100的整数；q是0-100的整数。在一些实施例中，q＝0和m＞0。在一些实施例中，m＝0。
在一些实施例中，固定的含L型核苷酸的寡核苷酸含有至少5个L型核苷酸，可含有或不含有D型核苷酸。寡核苷酸中任何D型核苷酸可出现在该序列的任何部分。因此，结构式IX还可具有以下例子 以及具有多个L型和D型核苷酸部分的例子。
固相载体可以是任何合适的材料，如聚苯乙烯、玻璃如可控空隙玻璃、硅胶、硅石、聚丙烯酰胺、磁珠、聚丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基和/或它们的共聚物或移植物。固相载体的形式可以是小颗粒、珠、膜、玻璃料、载玻片、平板、显微机械加工芯片、烷烃硫醇-金层、无孔表面、可寻址阵列或固定多核苷酸的基质。在一个实施例中，固相载体是尼龙膜。在另一实施例中，固相载体是聚苯乙烯珠。
代表性杂交方法本发明包括形成多核苷酸杂交物的方法，包括提供含有D型多核苷酸序列部分和共价连接于该D型多核苷酸序列部分的L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸，使该杂构多核苷酸与至少第一互补多核苷酸杂交，在该第一互补多核苷酸和(1)该L型多核苷酸序列部分、(2)该D型多核苷酸序列部分或(3)在(1)和(2)两者之间形成双链体。
在一些实施例中，通过使杂构多核苷酸与全部或部分L型多核苷酸序列部分互补的第一互补多核苷酸杂交而形成杂交物。在一些实施例中，通过使杂构多核苷酸与部分或全部D型多核苷酸序列部分互补的第一互补多核苷酸杂交而形成杂交物。在一些实施例中，在杂构多核苷酸、与全部或部分D型多核苷酸序列部分互补的第一互补多核苷酸以及与全部或部分L型多核苷酸序列部分互补的第二互补多核苷酸之间形成杂交物。在一些实施例如上述的实施例中，当该杂构多核苷酸和互补多核苷酸都不连接于或固定于固相载体时，在溶液中进行杂交。
在一些实施例中，含有杂构多核苷酸的杂交物被捕获或固定在固相载体上。在一些实施例中，该杂交物含有杂构多核苷酸和与全部或部分L型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸，其中，该第一互补多核苷酸连接于固相载体。在一些实施例中，该杂交物含有杂构多核苷酸和与全部或部分L型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸，其中该杂构多核苷酸连接于固相载体。在一些实施例中，杂交物含有杂构多核苷酸和与全部或部分D型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸，其中，该第一互补多核苷酸连接于固相载体。在一些实施例中，杂交物含有杂构多核苷酸和与全部或部分D型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸，其中，该杂构多核苷酸连接于固相载体。在一些实施例中，在杂构多核苷酸、与全部或部分D型多核苷酸序列部分互补(和杂交)的第一互补多核苷酸和与全部或部分L型多核苷酸序列部分互补(和杂交)的第二互补多核苷酸之间形成杂交物，其中，该第一互补多核苷酸或第二互补多核苷酸或杂构多核苷酸连接于固相载体。在上述实施例中，可通过共价或非共价实现连接或固定。此外，在上述实施例中，可在固定、连接或捕获在载体上之前、当中或之后形成杂交物。
杂交物可含有一个或多个双链体、三链体或其它高级别结构，其中至少杂构寡核苷酸的L型序列部分或D型序列部分的核苷酸碱基通过特殊的相互作用与互补多核苷酸中的相应核苷酸碱基配对。在一些实施例中，杂构多核苷酸包括具有5-50个L-核苷酸的L型序列部分，该L型序列部分通过连接键或连接物共价连接于具有5-50个D-核苷酸的D型序列部分。图2显示了代表性的杂构寡核苷酸(上面的结构)与互补“靶”多核苷酸(下面的结构)之间的杂交。在此阐述性实施例中，杂构寡核苷酸的D型序列部分与靶标中的所有或部分D型互补物杂交。
执行与本发明的寡核苷酸杂交的方法将根据结合于载体的捕获多核苷酸和溶液中将被捕获的多核苷酸的性质而变〔Bowtell(1999)，Nature Genetics，2125-32；Brown(1999)，Nature Genetics，2133-37〕。关于杂交的其它参考文献可参见WO 02/02823 A2和本文所引用的文献。
在一些实施例中，杂构寡核苷酸和靶多核苷酸(或互补寡核苷酸)之一或两者共价连接有一个或多个标记物。各标记物可产生可标记的信号，或者能促进后续反应、转变或与其它试剂相互作用产生可检测的信号。或者或此外，各标记物可使杂交稳定，促进引物延伸，或者促使标记的杂构寡核苷酸/靶杂交物或其衍生产物的捕获、复合或多价螯合。在一些实施例中，该标记物可以是荧光染料、猝灭剂、能量转移染料、量子点、洋地黄毒苷、生物素、迁移率改变剂、多肽、杂交稳定部分以及化学发光前体。
可在含有具有不同序列的多个靶多核苷酸的混合物中通过杂交形成含有杂构寡核苷酸和一个或多个互补寡核苷酸的杂交物。然后，如果需要，可从杂交物中分离除去未杂交的靶多核苷酸，并检测该杂交物。在一些实施例中，这样的分离步骤是不需要的，因为可以均一形式检测杂交物，其中可检测信号由杂构寡核苷酸和互补靶序列之间的杂交产生。
在一些实施例中，靶多核苷酸包括含SNP核酸、mRNA、cRNA、cDNA或基因组DNA。在一些实施例中，靶标包含与杂构寡核苷酸互补的合成的多核苷酸序列或序列部分。
杂交的杂构寡核苷酸可包括报道子和猝灭剂。报道子或猝灭剂可通过连接键或连接物各自共价连接于杂构寡核苷酸的L型序列部分或D型序列部分。例如，报道子可通过连接物连接于L型序列部分，猝灭剂可通过连接物连接于D型序列部分。
在一些实施例中，可在靶多核苷酸固定于固相载体上时进行杂交。
可使标记的杂构寡核苷酸/靶标杂交物变性，然后使标记的杂构寡核苷酸与具有互补的L型序列部分的另一寡核苷酸杂交，形成杂构寡核苷酸/L多核苷酸杂交物。构型特异性是杂构寡核苷酸的有利特征，它们的L型序列部分仅与互补的L型序列部分杂交，同样，它们的D型序列部分仅与互补的D型序列部分杂交。构型特异性，即正交性尽可能减少或消除了多种核酸杂交试验中常见的靶向步骤和捕获步骤之间的交叉杂交。
虽然L型和D型多核苷酸序列相互碱基配对不稳定，但是它们在非手性环境中的性能必然是相当的。例如，采用亚磷酰胺合成方法的镜像亚磷酰胺核苷的合成效率必然是相当的。使用非手性标记试剂进行的化学标记反应同等有效。可采用相同的方法对镜像、对映体L型和D型寡核苷酸进行纯化和分析，并获得相同的结果，只要环境是非手性的。例如，典型的反相HPLC分析将为镜像L型和D型寡核苷酸提供相同的图谱和滞留时间。但应注意的是，其单个核苷酸不是相同的L型或D型构型的相同序列的杂构寡核苷酸是非对映异构体，不具有相同的性能。
L型双链体的杂交性能与D型双链体天然相当，虽然是正交性的(orthoganal)。例如，特定序列中所有的L型寡核苷酸结合其L型互补寡核苷酸的Tm与相同序列中所有D型寡核苷酸与其D型互补物结合时的Tm是相同的。双链体的杂构寡核苷酸中非互补性L型或D型序列部分的存在可能对亲和性(稳定化或去稳定化)有某种影响。
杂构寡核苷酸的靶序列特异性部分长度足以与互补靶序列发生特异性退火。提供序列特异性退火的探针设计的详细的描述，除本文的描述外，还可在如以下文献中找到Diffenbach和Dveksler，《PCR引物，实验室手册》，ColdSpring Harbor出版社，1995；和Kwok等，Nucl.Acid Res.，18999-1005；1990。
本发明的荧光剂/猝灭剂杂构寡核苷酸可用作各种DNA扩增/定量策略中的检测试剂，如5′-核酸酶试验、链替换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚动循环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)、寡核苷酸连接试验(OLA)、连接酶链式反应(LCR)〔Barany，美国专利号5494810〕、连接酶检测反应(LDR)(Barany，美国专利号6312892和6027889)、转录介导的扩增(TMA)和Q-β复制酶。荧光剂/猝灭剂杂构寡核苷酸探针也可用于直接检测其它液相或固相(如阵列)试验中的靶标。此外，可以任何形式使用这些探针，包括如分子信标、Scorpion probesTM、Sunrise probesTM、点亮探针(light up probe)、InvaderTM检测探针和TaqManTM探针。例如可参见Cardullo，R.(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858790-8794；Stryer，L.(1978)，Ann.Rev.Biochem.，47819-846；Rehman，F.N.(1999)，Nucleic Acids Research，27649-655；Gibson，E.M.，(1996)Genome Methods，6995-1001；Livak，美国专利号5538848；Wittwer，C.T.(1997)，BioTechniques，22176-181；Wittwer，C.T.，(1997)，BioTechniques，22130-38；Tyagi，WO 95/13399；Tyagi，美国专利号6037130、6150097和6103476；Uehara(1999)，BioTechniques，26552-558；Whitcombe，(1999)，NatureBiotechnology，17804-807；Lyamichev，(1999)，Nature Biotechnology，17292；Daubendiek(1991)，Nature Biotechnology，15273-350；Nardone，WO99/64432；Nadeau，美国专利号5846726和5928869；和Nazarenko美国专利号5866336。
在一些实施例中，本发明包括一方法，其中标记的杂构多核苷酸探针和第二寡核苷酸探针作为一探针组相邻杂交到靶多核苷酸上。在适当的条件下，相邻杂交的探针可连接在一起，形成连接产物，条件是它们在连接前含有适当的反应性基团，例如(不限于)，游离的3′-羟基或5′磷酸酯基团(如参见图4)。一些连接反应可包含一个以上的杂构寡核苷酸探针或一个以上第二探针，以使得能区分含一个或多个不同核苷酸的靶序列(图8)。
在一些实施例中，靶序列包含上游或5′区域、下游或3′区域和位于上游区域和下游区域之间的SNP核苷酸。该SNP是一种可通过可连接的探针对(“探针组”)而被检测的核苷酸，可代表多个等位靶基因座上的一种多态型核苷酸。在一些实施例中，与靶标的SNP位点互补的核苷酸碱基可存在于靶特异性探针对的杂构寡核苷酸探针(第一探针)或第二探针的最近端上。当探针组的探针杂交到适当的上游和下游靶区域时，与SNP互补的核苷酸碱基与该靶序列上的SNP碱基配对，杂交的探针可连接起来形成连接产物(图8)。但是，与SNP互补的核苷酸碱基上的错配碱基可干扰连接，即使两个探针完全杂交到它们各自的靶区域。因此，可区分出少至仅有一个核苷酸不同的高度相关序列。
图8显示代表性连接反应。通过混合含有下述成分的探针组，可区分双等位基因座中的两个潜在的等位基因(1)两种荧光染料标记的探针，它们的序列仅在其末端的(不论3′还是5′)SNP互补位点(N1和N2)不同；(2)磷酰基化的杂构寡核苷酸探针，其中波浪线是L型序列部分；和(3)含有靶标的样品。两种荧光染料D1和D2是不同的，可经光谱相区别。所有这三种探针将在适当的条件下与靶序列杂交，但只有含杂交的SNP互补物的染料标记的探针将与杂交的磷酰基化杂构寡核苷酸探针连接。含有与X(N1)互补的末端核苷的探针连接到5′磷酸酯-杂构寡核苷酸探针，而含有错配的末端核苷(N2)的探针不连接。例如，如果在样品中仅有一个等位基因存在，其中所述SNP位点X是G核苷酸，N1是C、N2是T，则仅N1是C的探针将连接形成连接产物。可而将连接产物与未连接的N2探针相分离，或者分别检测或通过检测相区分，然后标记物D1的检出表明SNP位点是G。如果两个标记物D1和D2可被检测到，则可推断两个等位基因形式(X＝G和A)存在于杂合个体中。
在一些实施例中，探针组在第一探针或第二探针的末端不含有SNP互补物基因座。而待检测的靶SNP基因座核苷酸位于5′或3′靶区域中。待检测的核苷酸可以位于末端或在中间。具有与其各自靶区域完全互补的靶特异性部分的探针将在高度严谨条件下杂交。相反，在靶特异性部分中具有一个或多个错配碱基的探针将不与它们各自的靶区域杂交。杂构寡核苷酸第一探针和第二探针都必然杂交到靶标上，产生连接产物。
在一些实施例中，设计探针组中的杂构寡核苷酸探针和第二探针，使其具有相似的熔点温度(Tm)。其中，探针包括SNP位点，可将含有该SNP位点互补物的探针的Tm设计成比探针组中其它不含SNP位点互补物的其它探针低约4-6℃。还可将含有SNP位点互补物的探针的Tm设计成具有接近连接温度。这样，含有错配核苷酸的探针在此连接温度下将更容易从靶标中解离。因此，连接温度提供区分如靶标中潜在的多个等位基因的另一种方法。
本发明的连接剂可含有任何数量的酶或化学(即，非酶的)试剂。例如，连接酶是酶性的连接剂，它在适当的条件下，在DNA或RNA分子中的相邻核苷酸杂交到互补的序列上时，在它们的3′-OH和5′-磷酸酯间形成磷酸二酯键。温度敏感型的连接酶包括但不限于噬菌体T4连接酶和大肠杆菌连接酶。热稳定性连接酶包括但不限于Taq连接酶、Tth连接酶和Pfu连接酶。热稳定性连接酶可从嗜热或高度嗜热的微生物中获得。
用于偶联探针的化学连接剂包括但不限于激活剂、缩合剂和还原剂，如碳二亚胺试剂、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亚胺/胱胺、二硫苏糖醇(DTT)和紫外光。自动连接，即在缺乏连接剂的情况下的自发连接也在本发明的范围之内。核苷酸间连接键可以是磷酸二酯键。其它代表性核苷酸间连接键包括二硫键、氨基磷酸酯、乙酰基、焦磷酸酯，以及在适当的反应性基团之间形成的键，如α-卤代酰基和硫代磷酸酯基团之间形成的硫代磷酰基乙酰基氨基基团，和硫代磷酸酯与甲苯磺酸酯或碘化物基团之间形成的硫代磷酸酯。关于适当的反应性基团的化学连接方法和描述的详细方案除文中给出的文献中有记载外，还可参见以下文献Xu，(1999)Nucleic Acid Res.，27875-81；Gryaznov，(1993)Nucleic Acid Res.211403-08；Gryaznov，(1994)Nucleic Acid Res.222366-69；Kanaya，(1986)Biochemistry 257423-30；Luebke，(1992)Nucleic AcidsRes.203005-09；Sievers，(1994)Nature 369221-24；Liu，(1999)Nucleic Acids Res.263300-04；Wang，(1994)Nucleic Acids Res.222326-33；Purmal，(1992)Nucleic AcidsRes.203713-19；Ashley，(1991)Biochemistry 302927-33；Chu，(1988)Nucleic AcidsRes.163671-91；Sokolova，(1988)FEBS Letters 232153-55Naylor，(1966)Biochemistry 52722-28；and Letsinger，美国专利号5476930。
连接包括至少一个循环的连接。在一些实施例中，可进行一个或多个循环，包括(1)使第一探针和第二探针的适合连接的靶特异性部分与它们各自的互补靶区域杂交；(2)将第一探针的3′端和第二探针的5′端连接，形成连接产物；和(3)使核酸双链体变性，从靶链上分离出连接产物。可通过热循环连接反应而重复循环，以线性递增连接产物的量，也可不重复进行。
连接之后，可将连接产物杂交到“捕获”寡核苷酸上。捕获寡核苷酸可固定在固相载体上，并可被制作成可寻址阵列。连接产物的L型核苷酸部分(“标记”)可与固定的寡核苷酸的L型核苷酸序列部分互补。
还包括在本发明范围之内的是连接技术，如空隙填充连接(gap-fillingligation)，包括(但不限于)空隙填充OLA和LCR、桥键寡核苷酸连接和矫正连接(可参见如Ullman，美国专利号5185243；Backman，EP 320308、EP 439182和WO 90/01069)。
在一些应用中，由于靶标拷贝数量或检测敏感性低的缘故，靶序列的检测可能受到妨碍。可采用适当的方法扩增靶序列，如聚合酶链式反应(PCR)，详细内容可参见M.Innis，PCR Protocols，Academic出版社，纽约(1990)。在一些实施例中，连接后，可采用PCR用特殊的引物组扩增连接产物(如可参见F.Barany等，WO 97/45559)。
任选地，可采用任何方法纯化连接产物，在至少一轮连接循环之后从连接反应混合物中除去至少一些未连接的探针、靶DNA、酶或附属的试剂。这些方法包括但不限于分子量/大小排除方法，如凝胶过滤层析或透析、基于序列特异性杂交的洗脱法(pullout method)、亲和捕获技术、沉淀、电泳、层析、吸附或其它核酸纯化技术。本领域熟练的技术人员将认识到，在扩增之前纯化连接产物可减少扩增连接产物所需引物的量，从而减少检测靶序列的成本。此外，在扩增前纯化连接产物可减少扩增过程中的可能的副反应，并减少杂交过程中未连接探针的竞争。
在一些实施例中，本发明包括包含引物延伸的方法，其中，杂构寡核苷酸引物杂交到靶多核苷酸，形成杂构寡核苷酸/靶标杂交物。在一些实施例中，杂构寡核苷酸引物包含具有5-50个L-核苷酸的L型序列部分，该L型序列部分通过连接键或连接物共价连接于具有5-50个D-核苷酸的D型序列部分。在一些实施例中，该D型序列部分的3′末端核苷酸具有3′羟基。杂交物的标记杂构寡核苷酸链的D型序列部分的3′末端被引物延伸试剂延伸。图2的底部结构显示杂构寡核苷酸/靶标杂交物的引物延伸，其中，点状的箭头表示核酸链合成中核苷酸5′三磷酸从双链体的杂构寡核苷酸引物的3′末端掺入。该反应包括聚合酶、一种或多种可酶促掺入的核苷酸5′-三磷酸和缓冲液。采用引物延伸方法可形成一个或多个标记的多核苷酸片段。
本发明的扩增包括用于扩增核酸序列(线性地或指数地)的各种技术。这些技术的例子包括但不限于体外转录、PCR和其它使用引物延伸步骤的方法。扩增方法可包括热循环或可等温进行。扩增方法通常包括至少一轮扩增循环，即依次进行以下步骤将引物杂交到连接产物或靶序列的引物特异性部分；使用聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸链；使新形成的核酸双链体(复制子)变性，分离两条链。可重复进行些循环，也可不重复进行。
图5显示使用杂构寡核苷酸引物的代表性聚合酶链式反应。通过杂构寡核苷酸引物的D型序列部分的3′端的引物延伸，在PCR复制子中掺入L型序列部分，作为“标签(tag)”。由于L型核苷酸不与D型核苷酸形成稳定的碱基配对，扩增的靶标部分限制于引物的D型核苷酸。扩增后，所得复制子的一条链的5′末端含有L型序列标签。
在一些实施例中，本发明的方法包括监测感兴趣mRNA的相对浓度的方法和试验。可从样品如组织中分离出mRNA群，然后用反转录酶将其转变成更稳定的cDNA。复制mRNA或cDNA序列的一个方法是利用mRNA的3′端的聚-A尾和含有聚-A和聚-T的引物。或者，可使用基因特异性引物复制(如扩增)感兴趣的具体cDNA。复制mRNA和cDNA的方法包括PCR、滚动循环扩增和体外转录(IVT)。在一些实施例中，使用含有多种不同序列特异性标签的阵列检测或定量mRNA种类。
杂构寡核苷酸引物还可用于IVT(体外转录)中，其中，引物序列包括5′端的T7 RNA聚合酶启动子序列。可从各cDNA分子转录获得RNA(cRNA)的多个拷贝。例如，可通过标记的核糖核苷酸5′-三磷酸直接将标记物掺入，或者在第二反转录酶反应中掺入，以产生标记的cDNA。标记的cDNA和cRNA可杂交到它们的固定在固相载体上的互补序列。在一些实施例中，由杂构寡核苷酸引物的引物延伸得到的cDNA的L型序列部分可杂交到固定于载体上的互补寡核苷酸的互补L型序列部分上。
阵列和制备它们的方法如上所述是周知的，例如，在WO 02/02823和本文所引用的文献中，以及在如Microarry Biochip Technology，M.Schena编辑，Eaton出版，BioTechniques Books Division，Natick，MA 01760。在一些实施例中，将通用的L-DNA阵列点样到固定于96孔微滴定板底部的孔状膜上，该膜由亲水的PTFE(Multiscreen Resist-Rl，Milipore)、聚丙烯(Acro Well Plate，Pall)或尼龙(Cuno-white，Cuno)制成。例如，在一些实施例中，每4.5mm直径的孔中固定有大约1-15纳摩尔的寡核苷酸。
可将许多固定的寡核苷酸排列在可寻址的位置上(图6)。可在各位置固定含有不同L型序列的寡核苷酸。如果cDNA被标记，可根据可检测信号的存在和缺乏，推断任何具体位置上是L型序列。各种不同的标记取向是可行的(图9)。标记的对照位置可建立基线、背景值和提供信号的归一化(图10)。
本发明还包括基因表达分析方法，其中，靶多核苷酸是cDNA，通过使杂构寡核苷酸引物与RNA靶多核苷酸杂交，形成引物/靶标杂交物，然后使用引物延伸试剂延伸该引物/靶标杂交物的3′，形成cDNA转录子，从而形成cDNA转录物。引物延伸反应包括至少一种反转录酶、一种或多种核苷酸5′-三磷酸和缓冲液。可标记一种或多种核苷酸5′-三磷酸，以产生多个标记的转录子cDNA，各含有L型DNA部分(图3d)。或者，可标记杂构寡核苷酸。图3b显示D型部分含有标记物的一个例子。图3c显示杂构寡核苷酸杂交到含有几个检测标记物的互补多核苷酸的例子。然后可在水解条件下(如高pH、RNA酶切割和/或某些盐如Mg+2和Zn+2)水解该RNA。然后采用旋转柱方法(spin column method，Qiagen)、硅胶处理、超滤(Microcon)或沉淀方法纯化所得的标记的cDNA，去除过量的引物和核苷酸。
在一些实施例中，本发明还包括用于分析许多mRNA序列的高通量试验。可设计和合成基因特异性反转录酶引物，它可进行选择性复制和扩增。各特异性序列可是杂构寡核苷酸的部分或全部D型序列部分。各基因特异性序列可标记有杂构寡核苷酸中的特殊L型序列部分。与杂构寡核苷酸中的该特殊的L型序列部分互补的L型互补物可包含于固定的寡核苷酸中。当待检测有限量的mRNA序列(如100)时，这个数量的固定的寡核苷酸构成了可用于任何样品的阵列。通过适当的变性洗涤途径，L型的阵列可重复使用多次，或者可使用它们一次然后丢弃。
在D型固定的寡核苷酸通过序列特异性杂交而“捕获”D型核酸分析物(如cDNA)的阵列中，可能会发生交叉杂交的问题。检测信号时可能或出现假阳性结果，这是因为D型核酸分析物与不互补的且含有一个或多个错配碱基的D型固定核苷酸发生非特异性结合。除了假阳性外，持续的和高水平的背景信号也可能限制检测能力、灵敏性和产生模糊的结果。本发明提供不与D型序列(甚至是那些以Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对方式互补的D型序列)发生有效杂交的L型序列。换言之，L-DNA不能有效地与D-DNA发生交叉杂交。因此，L型结合基序提供正交性，即，核酸的分子识别性能中的另一特异性尺度。此外，因为L型核酸不是核酸酶降解的底物，该通用阵列具有更大稳定性、耐久性、持久性和存储期等优点。
试剂盒通过将标准的引物对和探针制成试剂盒，并由机器人分配到容器中(如试管、孔、阵列位置和点)，可进行用于描绘单核苷酸多态型(SNP)、等位基因区分或疾病相关基因分析的高通量试验。
实施例已描述了本发明，以阐述性方式而非限制性方式提供下述实施例。
实施例1杂构寡核苷酸的合成从ChemGenes(Ashland Technology Centre，200 Homer Avenue，Ashland，MA 01721)购得L-DNA亚磷酰胺。在ABI 394 DNA/RNA合成仪上，使用0.2μmolDNA循环、接着进行标准的合成循环，合成了L-DNA-D-DNA寡核苷酸〔ABI3948，《核酸合成和纯化系统》，Perkin Elmer公司，1995，第4章自动化学〕。将标准的DNA酰胺(amidite)放置到位置1-4，将L-DNA酰胺放置在位置5-8。在合成后，用氢氧化铵从载体上切下寡聚物，55℃过夜去保护。除去氨，将沉淀物溶解在水中。采用UV分光光度法测定样品的浓度，并以ddH2O制备100mM的原液。
实施例2L-DNA结合到阵列上图12显示实验的结果，其中，制得8个不同的探针(各有6份重复)的8×6阵列〔固定探针PNA-ZIP32(非互补对照)、D-LNA、D-DNA、PNA-NH2、L-DNA、PNANHAc、PNANHAcSH和PNANH2SH〕，接着与含有四种寡聚物X-SM03205bCF(L-DNA，“cf”)、寡聚物X-SM032 04b CF(D-DNA，“cf”)、寡聚物X-SM032 02b TF(L-DNA，“tita”)或寡聚物X-SM032 01 TF(D-DNA，“tita”)之一的不同寡核苷酸溶液杂交。前两种探针含有与固定探针序列互补的序列(如果忽视构型的话)。接着的两种探针含有不与任一固定的探针互补的序列。
从图12可以看出，“cf”L-DNA探针可与互补的L-DNA和最后三种PNA探针杂交，但不与其它探针杂交。“cf”D-DNA探针与互补的D-DNA和最后三种PNA探针杂交，但不与其它探针杂交。D和L“tita”探针都不显著地结合于任一种固定的探针，这是由于没有序列互补性。
本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请都以相同的程度纳入本发明作为参考，即使各单独的出版物、专利或专利申请被具体或单独地指出它们被纳入作为参考。
现已完全描述了本发明，本领域技术人员将理解，在不偏离本发明精神或范围的情况下可对本发明进行许多修改和改变。
权利要求
1.多核苷酸组合物，其特征在于，它含有含D型多核苷酸序列部分和与该D型多核苷酸序列部分共价连接的L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50个L-核苷酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有5-50个D-核苷酸。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50个L-核苷酸。
5.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个L型2′-4′LNA核苷酸。
6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。
7.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。
8.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。
9.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
10.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个D型2′-4′LNA核苷酸。
11.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。
12.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。
13.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。
14.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
15.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，至少一个D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分含有选自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯的核苷酸间连接键。
16.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述杂构多核苷酸含有选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤和7-脱氮鸟苷的核苷酸碱基。
17.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述杂构多核苷酸含有选自2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和2-硫代嘧啶的核苷酸碱基。
18.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，该组合物含有与所述L型多核苷酸序列部分杂交的第一互补多核苷酸。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少一个L型多核苷酸。
20.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少一个L型2′脱氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。
21.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少两个肽核酸亚单元。
22.如权利要求18-21中任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一互补多核苷酸连接于固相载体。
23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述固相载体包括聚苯乙烯、玻璃、硅胶、硅石、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯、聚乙烯氧基或尼龙。
24.如权利要求22或23所述的组合物，其特征在于，所述固相载体包括小颗粒、珠、膜、玻璃料、载玻片、平板、显微机械加工芯片、链烷硫醇-金层、无孔表面、可寻址阵列或凝胶。
25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述固相载体是珠。
26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述固相载体是聚苯乙烯珠。
27.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述固相载体是尼龙膜。
28.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述固相载体是选自纳米颗粒、微球体或脂质体的小颗粒。
29.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述固相载体是玻璃。
30.如权利要求22-29中任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一互补多核苷酸通过可切割的连接物连接于所述载体。
31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述可切割的连接物含有羰基，所述第一互补多核苷酸通过该羰基连接于所述载体。
32.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有与所述D型多核苷酸序列部分杂交的第二互补多核苷酸。
33.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有可检测的标记物。
34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述标记物包括荧光染料、荧光猝灭剂、能量转移对、量子点或化学发光前体。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述标记物包括荧光素、罗丹明或花青。
36.如权利要求33-35中任一项所述的组合物，其特征在于，所述标记物连接于与所述D型多核苷酸序列部分杂交的第二互补多核苷酸。
37.一种形成多核苷酸杂交物的方法，其特征在于，所述方法包括提供含有D型多核苷酸序列部分和连接于该D型多核苷酸序列部分的L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸，使该杂构多核苷酸与第一互补多核苷酸杂交，形成该第一互补多核苷酸和该L型多核苷酸序列部分之间的双链体。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50个L-核苷酸。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有5-50个D-核苷酸。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有5-50个L-核苷酸。
41.如权利要求37-40任一项所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个L型2′-4′LNA核苷酸。
42.如权利要求37-40任一项所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。
43.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。
44.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。
45.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述L型多核苷酸序列部分含有至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
46.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个D型2′-4′LNA核苷酸。
47.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个为1′-α-端基异构核苷酸或4′-α-端基异构核苷酸的L型核苷酸。
48.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-β端基异构构型。
49.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一个含核糖、阿拉伯糖、木糖或吡喃糖的L型核苷酸，呈1′-α端基异构构型。
50.如权利要求37-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述D型多核苷酸序列部分含有至少一种含核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖或2′-O-甲基核糖的L型多核苷酸。
51.如权利要求37-50中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个D型多核苷酸序列部分和L型多核苷酸序列部分含有选自2-氨乙基甘氨酸、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯的核苷酸间连接键。
52.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少一个L型核苷酸。
53.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少一个L型2′脱氧核糖或2′-4′LNA核苷酸。
54.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一互补多核苷酸含有至少两个肽核酸亚单元。
55.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其特征在于，将未杂交的第一互补多核苷酸与所述杂交物分离。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测杂交物。
57.如权利要求37-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括对所述杂构多核苷酸进行引物延伸。
58.如权利要求37-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括用核酸酶切割所述杂构多核苷酸。
59.如权利要求37-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述杂构多核苷酸连接于与其末端毗邻处杂交的多核苷酸。
60.如权利要求37-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述杂交物固定在固相载体上。
61.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1-17中任一项所述的杂构多核苷酸；固相载体，其上连接有至少一种含L型多核苷酸序列部分的多核苷酸，该L型多核苷酸序列部分与所述杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分互补。
62.如权利要求61所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括许多固相载体，各载体连接有杂构多核苷酸，该杂构多核苷酸含有L型多核苷酸序列部分，该L型多核苷酸序列部分含有与所述许多固相载体中其它固相载体上的L型多核苷酸序列部分的序列不同的独特序列。
63.如权利要求61所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有处于不同位置的杂构多核苷酸的可寻址阵列，各多核苷酸含有L型杂构多核苷酸序列部分，该L型杂构多核苷酸序列部分含有与所述阵列其它位置上的杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分的序列不同的独特序列。
64.如权利要求61-63中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少10种不同的杂构多核苷酸，各杂构多核苷酸含有与其它杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的独特序列。
65.如权利要求64所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少100种不同的杂构多核苷酸，各杂构多核苷酸含有与其它杂构多核苷酸中的L型多核苷酸序列部分不同的独特序列。
全文摘要
公开了利用含有D型多核苷酸序列部分和与该D型多核苷酸序列部分共价连接的L型多核苷酸序列部分的杂构多核苷酸的方法、组合物和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1982325SQ20061014253
公开日2007年6月20日 申请日期2002年12月23日 优先权日2001年12月21日
发明者S·M·马蒂斯克, B·V·施罗德, R·S·维纳亚克, L·L·格林菲尔德 申请人:阿普里拉股份有限公司