一种纳米流感疫苗及构建方法和应用与流程

本发明涉及疫苗制造技术领域，更具体涉及一种纳米流感疫苗，所述的疫苗通过在人源铁蛋白笼形结构表面展示三串联重复流感病毒m2e多肽，制备出能够显著增强m2e免疫原性、具有交叉保护效力的纳米流感疫苗。

背景技术：

流感病毒是危害人类健康的一种比较常见的呼吸道病毒，季节性流感在全球每年大约导致300～500万人患病以及25～50万人死亡。潜在新的流感病毒株的出现及流行对人类健康造成极大的威胁。

目前，接种疫苗是预防流感最有效的途径。使用中的流感疫苗主要为灭活、减毒或重组三价、四价流感疫苗，通过诱导产生针对流感病毒主要抗原ha或na的特异性抗体来提高机体抵抗流感病毒感染的能力。由于流感病毒的ha、na持续发生抗原漂移以及不同流感病毒亚型之间发生重组，疫苗每年都需要更新。季节性流感流行或流感大爆发时，很难及时生产充足的疫苗。而且动物宿主来源的流感病毒，如禽流感病毒h5n1、h7n9和猪流感病毒h1n1的跨物种传播使开发具有广谱保护效力的通用流感疫苗迫在眉睫。

对交叉保护流感疫苗的研究主要集中在甲型流感病毒的两个保守抗原表位：基质蛋白2的胞外功能区(m2e)和血凝素2多糖肽(ha2gp)。m2是非糖基化的同源四聚体跨膜蛋白，在a型、b型流感病毒中起质子通道作用。在a型流感病毒中，m2蛋白由三片段构成：胞外n-末端区域(m2e，1～23氨基酸残基)，跨膜α-螺旋以及胞内c-末端区域。与ha和na相比，m2e在不同的a型流感病毒中高度保守，因而成为研制通用流感疫苗的潜在靶标。

纳米技术为疫苗制备提供了新的策略。多种纳米级材料，如多聚体、脂质体、纳米簇、病毒样颗粒、铁蛋白被用来修饰抗原以优化其特性。其中，铁蛋白是由24聚体组成八面体对称蛋白笼形结构，它在生命体中广泛存在。人源铁蛋白有两种亚基组成：h链(rhf，21kda)和l链(19kda)。24个rhf亚基也可以在体外自组装形成蛋白笼形结构，外直径约12nm，内部是6-8纳米的空腔。铁蛋白的n末端伸向外表面，易于进行基因修饰，融合蛋白及多肽。高度有序重复抗原在微生物体表面以5～10nm间隔分布时易于诱导产生强烈的t细胞依赖的抗体反应。铁蛋白表面相邻氨基末端之间距离在这一范围内，理论上有利于展示抗原诱导产生强烈的抗体反应。铁蛋白自身也可能会起到佐剂作用，人淋巴细胞如b细胞，cd4⁺t淋巴细胞，cd8⁺t淋巴细胞表面拥有rhf特异性的结合位点，可能会更有利于展示抗原被免疫细胞识别。而且，铁蛋白对热、ph变化以及化学变性都有很好的抗性，具 有高度稳定性。因此，铁蛋白是稳定的、生物兼容的纳米载体，适合用于抗原展示。本发明利用铁蛋白作为载体展示多拷贝的m2e多肽，有望开发一种具有交叉保护效力的新型纳米流感疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种纳米流感疫苗，所述的疫苗为3m2e-rhf重组蛋白，其蛋白质序列为seqidno.2所示，编码3m2e-rhf重组蛋白的基因序列为seqidno.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种纳米流感疫苗的制备方法，通过在人源铁蛋白h链的氨基末端连接三段串联的m2e多肽(3m2e-rhf)，利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白，纯化后即得到展示3m2e多肽的铁蛋白纳米颗粒。

本发明的最后一个目的在于提供了一种纳米流感疫苗在制备流感病毒疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种纳米流感疫苗，其蛋白质序列为seqidno.2所示。

一种纳米流感疫苗，其制备步骤包括：

(1)、将seqidno.1所示序列插入质粒pet28a，得到重组质粒pet28a/3m2e-rhf。

(2)、重组质粒pet28a/3m2e-rhf大肠杆菌中表达并经过分子筛柱和蔗糖密度梯度离心纯化蛋白。

一种纳米流感疫苗在制备流感病毒疫苗中的应用，包括利用本发明的3m2e-rhf重组蛋白与其他佐剂联合制备成流感病毒疫苗，或是本发明的3m2e-rhf重组蛋白与其他有效成分组合制备为多联疫苗。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

a、本发明利用原核表达系统大肠杆菌表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活病毒，相比传统的鸡胚制备流感疫苗方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；

b、利用人源铁蛋白作为抗原展示载体，生物相容性好，铁蛋白自身可能起到佐剂效果，显著提高m2e抗原的免疫原性。纳米疫苗的使用无需额外添加佐剂，从而简化疫苗制备过程；

c、本发明疫苗采用滴鼻途径进行免疫，与常用的肌肉注射免疫途径相比，使用更加安全方便，损伤小，而且更接近流感病毒自然入侵宿主的途径，有利于诱导产生交叉保护效力；

d、本发明利用m2e在不同亚型流感病毒中序列的高度保守性，有望发展成为具有交叉保护效力的通用流感疫苗。

e、3m2e-rhf纳米颗粒。生理条件下，3m2e-rhf纳米颗粒由24聚体自组装形成八面体对称体制的中空笼形结构。3m2e-rhf纳米颗粒经滴鼻途径免疫balb/c小鼠，诱导产生大量m2e特异性的igg抗体。而且3m2e-rhf保护小鼠抵抗了同型和异型流感病毒的感染。自组装铁蛋白展示保守性抗原肽为新型疫苗的开发提供新的策略。

附图说明

图1为3m2e-rhf纳米颗粒疫苗的构建示意图；

其中a图为3m2e-rhf蛋白表达序列构建示意图，b为3m2e-rhf纳米颗粒组装示意图。

图2为纯化的3m2e-rhf蛋白的鉴定图。

图2中a为纯化的3m2e-rhf蛋白的sds-page电泳图。

图2中b为纯化的3m2e-rhf蛋白的westernblot鉴定图。

图3为3m2e-rhf组装纳米颗粒的透射电镜表征图。

图4为免疫血清中m2e特异性igg抗体滴度变化统计图。

图5a为a/puertorico/8/34(h1n1)流感病毒感染后肺病毒滴度统计图。

图5b为a/puertorico/8/34(h1n1)流感病毒感染后小鼠体重变化统计图。

图5c为a/puertorico/8/34(h1n1)流感病毒感染后小鼠存活率统计图。

图6a为a/chicken/jiangsu/7/2002(h9n2)流感病毒感染后肺病毒滴度统计图。

图6b为a/chicken/jiangsu/7/2002(h9n2)流感病毒感染后小鼠体重变化统计图。

图6c为a/chicken/jiangsu/7/2002(h9n2)流感病毒感染后小鼠存活率统计图。

具体实施方式

本发明实施例详细说明了一种新型纳米流感疫苗的制备方法及其免疫效果在小鼠体内的验证过程。本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

3m2e-rhf纳米流感疫苗的制备方法，其步骤为：

(1)构建出3m2e-rhf蛋白表达质粒pet28a/3m2e-rhf：

pcr扩增rhf序列：以编码人铁蛋白h链序列(rhf)的质粒pet-rhf(由drpaolosantambrogio(milan,italy)惠赠)为模板(nanoscale,2012,4,188)，senseprimer：5'ccggtgtaatggaagctccgacggaggaggaggatctatgacgaccgcgtccacctc3'，reverseprimer：5'ccgctcgagttagctttcattatcactgtc3'；

3m2e序列：ncbi中查找到m2e的核酸序列(geneid:956528)，化学合成3m2e序列。 以合成的3m2e核酸序列为模板，senseprimer：5'gggaattccatatgatgtctctgctgaccgagg3'，reverseprimer：5'gaggtggacgcggtcgtcatagatcctcctcctccgtcggagcttccattacacc3'，m2e氨基酸序列为mslltevetpirnewgcrcngssd，与a/puertorico/8/34(h1n1)流感病毒中m2e序列一致。

以pcr产物rhf和3m2e为模板，overlap-pcr扩增出3m2e-rhf序列，senseprimer：5'gggaattccatatgatgtctctgctgaccgagg3'，reverseprimer：5'ccgctcgagttagctttcattatcactgtc3'，98℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min30s，扩增30个循环，获得seqidno.1所示的3m2e-rhf核苷酸序列。扩增产物经过nde1和xho1双酶切后将3m2e-rhf序列插入到表达载体pet28a中，构建出3m2e-rhf蛋白表达质粒pet28a/3m2e-rhf。经测序验证目的基因序列正确。

(2)将质粒pet28a/3m2e-rhf用cacl2法转化入大肠杆菌e.colibl21(λde3)中，用lb培养基37℃、180r/min培养菌体至od600在0.4～0.6之间，添加iptg至终浓度为1mm，20℃继续诱导16h，4℃、6000g离心10min收集菌体，将菌体重悬于组装缓冲液(20mmtris-hcl，50mmnacl，ph8.0)中，超声破碎40min后，10,000g离心30min，收集上清放于70℃水浴锅中水浴10min，10,000g离心30min去除沉淀。收集上清用截留量为100kda超滤管浓缩后，经superose610/300gl(购自ge公司)分子筛柱收集目的蛋白洗脱峰，浓缩蛋白经过蔗糖密度梯度离心，吸出目的蛋白层，经透析浓缩纯化出3m2e-rhf蛋白纳米颗粒。1l的初始od600在0.4～0.6的菌液，经诱导纯化后，大约可以纯化出0.5mg3m2e-rhf蛋白，3m2e-rhf蛋白的氨基酸序列为seqidno.2所示。

(3)对纯化3m2e-rhf蛋白进行表征。将纯化蛋白用于sds-page，以纯化的rhf(21kda)做对照(图2a)，在35～40kda之间可以看到3m2e-rhf蛋白单体条带。用anti-ferritinheavychainantibody(购自abcaminc.,cambridge,ma)做一抗，westernblot进一步验证3m2e-rhf(图2b)的表达。对组装3m2e-rhf纳米颗粒进行透射电镜(图3)表征。其中透射电镜样品制备步骤为：将铜网吸附在含有0.5mg/ml3m2e-rhf纳米颗粒的液滴上吸附2min，用滤纸轻轻吸去镍网边缘溶液，然后用2％磷钨酸染色10min。将铜网放置空气中自然干燥，用200kv透射电镜检测。

实施例2：

3m2e-rhf纳米颗粒流感疫苗免疫效果在小鼠体内的验证，其步骤为：

(1)将6～8周大的balb/c小鼠随机分组，分别用10μg的3m2e-rhf纳米颗粒、2.6μg的3m2e合成多肽(与3m2e-rhf纳米颗粒相比含等摩尔的m2e)、6.3μg的rhf 纳米颗粒(与3m2e-rhf纳米颗粒相比含等摩尔的rhf)和pbs经滴鼻途径分别对balb/c小鼠进行免疫，共免疫三次，相邻两次免疫之间间隔三周。每次免疫后两周采集小鼠血清，储存于-20℃，elisa检测m2e特异性抗体。抗体检测结果显示三次免疫后3m2e多肽和rhf纳米颗粒免疫小鼠和pbs对照组小鼠一样，血清中均未检测到m2e特异性igg抗体，而3m2e-rhf纳米颗粒诱导产生大量m2e特异性igg抗体(图4)，证明3m2e-rhf纳米颗粒诱导产生了强烈的体液免疫应答。

(2)小鼠经三次免疫一个月后，用20μl10ld50的同源人流感病毒株a/puertorico/8/34(h1n1)和异源的禽流感病毒株a/chicken/jiangsu/7/2002(h9n2)分别感染免疫小鼠，连续两周观测小鼠体重变化和存活率，小鼠体重减少超过25％即视为死亡。病毒感染第四天采集4只小鼠的肺，用于肺病毒滴度检测。

肺病毒滴度测定采用组织细胞半数感染量(tcid50)法。肺匀浆液1000rpm离心10min，收集上清。向96孔板每孔中加入2×10⁴个mdck细胞，37℃培养箱中培养12小时后，用10倍梯度稀释的肺匀浆液上清去感染mdck细胞，每孔100μl，每个样品每个浓度梯度做4个重复。37°培养箱孵育1h后，用200μl添加抗生素的无血清培养基dmem替换细胞培养上清液，继续放入培养箱培养三天，每天观察细胞病变状况。三天后，用红细胞凝集试验确定流感病毒的存在，用reed&muench方法对病毒滴度进行计算。a/puertorico/8/34(h1n1)感染肺病毒滴度测定结果显示3m2e-rhf纳米颗粒免疫组小鼠的肺病毒滴度显著降低，而3m2e多肽和rhf纳米颗粒免疫组小鼠的肺病毒滴度较pbs组并没有显著性差异(图5a)，说明3m2e-rhf纳米颗粒抑制了病毒在肺部的扩增。a/puertorico/8/34(h1n1)病毒感染后，3m2e-rhf纳米颗粒免疫组小鼠体重经过轻微的减少后便开始回升(图5b)，最后存活率为100％(图5c)，其他免疫组小鼠均在病毒感染后一周全部死亡，说明3m2e-rhf纳米颗粒保护小鼠抵抗了同型流感病毒的死亡性感染。a/chicken/jiangsu/7/2002(h9n2)感染肺病毒滴度测定结果显示3m2e-rhf纳米颗粒免疫组小鼠的肺病毒滴度有所降低，虽然与对照免疫组相比并没有显著性差异(图6a)。病毒感染后，3m2e-rhf纳米颗粒免疫组小鼠体重在感染第八天开始回升(图6b)，最后存活率为100％(图6c)，而其他免疫组小鼠体重持续减少，均在病毒感染后一周全部死亡，说明3m2e-rhf纳米颗粒保护小鼠抵抗了异型禽流感病毒的死亡性感染。

sequencelisting

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>一种纳米流感疫苗及构建方法和应用

<130>一种纳米流感疫苗及构建方法和应用

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>819

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtctctgctgaccgaggtggaaacacccatcaggaacgagtggggctgcagatgtaat60

gggagctccgacggatctggaggaggaggaatgagtctgctgactgaggtggaaacccct120

attcggaacgaatggggctgccgctgtaatggatctagtgatggaagcggaggaggagga180

atgtccctgctgacagaggtggaaaccccaattagaaacgagtggggctgccggtgtaat240

ggaagctccgacggaggaggaggatctatgacgaccgcgtccacctcgcaggtgcgccag300

aactaccaccaggactcagaggccgccatcaaccgccagatcaacctggagctctacgcc360

tcctacgtttacctgtccatgtcttactactttgaccgcgatgatgtggccttgaagaac420

tttgccaaatactttcttcaccaatctcatgaggagagggaacatgctgagaaactgatg480

aagctgcagaaccaacgaggtggccgaatcttccttcaggatatcaagaaaccagactgt540

gatgactgggagagcgggctgaatgcgatggagtgtgcattacatttggaaaaaaatgtg600

aatcagtcactactggaactgcacaaactggccactgacaaaaatgacccccatttgtgt660

gacttcattgagacacattacctgaatgagcaggtgaaagccatcaaagaattgggtgac720

cacgtgaccaacttgcgcaagatgggagcgcccgaatccggcttggcggaatatctcttt780

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leuleuthrgluvalgluthrproileargasnglutrpglycysarg

354045

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505560

thrgluvalgluthrproileargasnglutrpglycysargcysasn

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glyserseraspglyglyglyglysermetthrthralaserthrser

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glnvalargglnasntyrhisglnaspserglualaalaileasnarg

100105110

glnileasnleugluleutyralasertyrvaltyrleusermetser

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tyrtyrpheaspargaspaspvalalaleulysasnphealalystyr

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pheleuhisglnserhisglugluarggluhisalaglulysleumet

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alaleuhisleuglulysasnvalasnglnserleuleugluleuhis

195200205

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thrhistyrleuasngluglnvallysalailelysgluleuglyasp

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245250255

glutyrleupheasplyshisthrleuglyaspseraspasngluser

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