一种基于结构类似物交叉反应性制备玉米赤霉醇单克隆抗体的方法与流程

本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，特别涉及一种基于结构类似物交叉反应性制备玉米赤霉醇高灵敏度单克隆抗体的方法。
背景技术：
：alpha-玉米赤霉醇，又称玉米赤霉醇(zearalanol,zal)，化学名称右环十四酮酚，是霉菌毒素玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)的还原产物，是一种植物性雌激素，能提高植物抗寒抗冻能力。上世纪60年代发现zal具有促进反刍动物体内蛋白质沉积的功能，能够明显提高牛羊饲料转化效率，缩短牛羊育肥周期，因此被当作反刍动物促生长剂广泛应用，较为普遍的是采用埋置形式。随后研究证明，zal对单胃动物如大鼠、狗及猴子是有害的，特别是对生殖方面有危害。虽然zal在体内大部分会被代谢掉，但仍有一部分会残留在埋置部位。如果食用含有zal残留的牛羊肉，会导致食用者促性腺激素水平降低、内分泌失调、生长发育障碍和人体第二性征发育不良，而且还具有潜在的致癌性。1996年，欧盟明确禁止在畜禽养殖中使用zal，要求向欧盟各国输入的畜牧产品不得检出其残留物。2002，我国农业部第193号公告中明确禁止zal作为增重剂用于任何食源性动物，并切在食源性动物的任何可食组织中均不得检测到。但是由于zal作为牛羊增重剂增重效果好、经济回报高等特点，仍被非法使用。为了减少zal危害，专家学者建立了很多种zal检测方法。目前常用的检测方法包括理化法如hplc，gc/ms，lc/ms等，免疫学检测方法如放射免疫分析法(ria)、elisa、荧光免疫分析(fia)、化学发光免疫分析(clia)及免疫传感器(immunosensor)。理化检测方法虽然准确、灵敏度高，但耗时长，费用高。而免疫学检测方法简单，灵敏度高，特异性强，耗时短，费用低，使用便捷，可进行大批量筛检，因而近些年免疫学检测方法得到快速发展。决定免疫学检测方法灵敏度的关键是抗体的质量，目前有关报道zal免疫学检测抗体灵敏度均是ng级，有的甚至是更高，主要是因为zal人工抗原的质量不确定。在制备人工抗原过程中完全或部分改变了zal物质的抗原决定簇，因此导致制备的抗体灵敏度不高，甚至不能刺激机体产生抗zal抗体。技术实现要素：针对现有的zal抗体制备存在的不足，本发明从抗原制备源头开始，通过抗体的非特异性反应(交叉反应性)，利用zal结构类似物抗原制备，zal阻断elisa筛选，建立一种zal抗体制备新方法，为研发高灵敏的zal免疫学检测方法奠定了基础。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种玉米赤霉酮人工抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)称取2mgzan溶解于2ml无水吡啶中，然后加入4mg的cmo，在旋转蒸发仪上115℃控温回流2h，再旋转蒸发干燥；用甲醇洗涤制备的干燥物2次，每次1ml，旋转蒸发干燥；用1ml双蒸水重新溶解所得干燥物，2m的naoh调节溶液ph值到8.0；用等体积甲苯抽提3次，弃甲苯层，留水相层；最后把所得水相用等体积乙酸乙酯萃取3次，弃水相，留乙酸乙酯相，旋转蒸发干燥，得到zan-o；(2)用1mldmf溶解zan-o，磁力搅拌，搅拌的同时加入2mgedc和1.2mgnhs，继续搅拌2h，记为a液；(3)称取5mgbsa加入500μl质量分数0.3％nahco3溶液中，记为b液；(4)将b液进行磁力搅拌，边搅拌边缓慢滴加入a液，滴加结束后继续搅拌2h；(5)取出步骤(4)的a和b混合液，装入制备好的透析袋内，对pbs透析3天，第一天换透析液8次，第二天换透析液6次，第三天换透析液4次，得到zan-o-bsa。采用同样的方法，用ova替代bsa，制备得到zan-o-ova。一种基于结构类似物交叉反应性制备玉米赤霉醇高灵敏度单克隆抗体的方法，包括以下步骤：(1)动物免疫选取健康的spf级6周龄雌性balb/c小鼠6只，利用zan-o-bsa进行免疫，免疫剂量每次50μgzan-o-bsa/只；采用背部皮下的免疫方式，4-6个点注射，共免疫四次，免疫间隔3-4周；第一次免疫时把zan-o-bsa用pbs稀释成100μgzan-o-bsa/200μl，然后加入等量的fca乳化，充分乳化后，注入balb/c小鼠皮下200μl；后续三次强化免疫时，用fia替换fca进行乳化；(2)免疫效果测定四免10天后，将免疫balb/c小鼠断尾采血10μl，加入到990μlpbs中，5000rpm离心10min，弃沉淀留上清用于血清效价和抑制效价的测定；(3)阳性杂交瘤筛选选取血清效价高，抑制效价好的balb/c小鼠作为细胞融合用小鼠；用高压无菌处理的pbs稀释zan-o-bsa至50μgzan-o-bsa/200μl，直接注射到融合用小鼠腹腔进行超强免疫；3天后，摘取眼球放血，完毕后抻颈处死小鼠，小鼠尸体置于75％酒精中浸泡5min；超净台上无菌取小鼠脾脏与ns0细胞进行融合，小鼠脾脏细胞与ns0细胞融合后，均匀的融合细胞悬液按100μl/孔分别加入到96孔酶标板上，共铺板10块酶标板，960个孔，置于37℃、5％co2培养箱中；再筛选能分泌抗zal单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；(4)单克隆抗体的制备向balb/c小鼠体内注入石蜡400μl/只以诱发炎症，7-10天后注入制备好的能分泌抗zal单克隆抗体的杂交瘤细胞，观察小鼠腹部变化，当小鼠腹部出现明显肿大且腹部皮肤紧绷时采集腹水，然后3000r/min离心5min，去细胞及杂质留上清，得到玉米赤霉醇单克隆抗体。一种基于玉米赤霉酮人工抗原制备的玉米赤霉醇高灵敏度单克隆抗体建立的玉米赤霉醇酶联免疫、化学发光、时间分辨、荧光偏振检测方法。一种基于玉米赤霉酮人工抗原制备的玉米赤霉醇高灵敏度单克隆抗体在制备玉米赤霉醇胶体金试纸条及拉曼增强胶体金试纸条方面的应用。一种基于玉米赤霉酮人工抗原制备的玉米赤霉醇高灵敏度单克隆抗体在制备玉米赤霉醇试剂盒方面的应用。半抗原、抗原和抗体之间的特异性结合，其分子机制是抗原分子表面存在着能与抗体相互作用的部位即抗原决定簇，是抗原表位的空间结构与抗体分子超变区互补以及氢键、疏水性、静电作用等形成的低能势共同作用的结果，也即抗体是从抗原决定簇的立体结构而不是从抗原的全面分子排列来“认识”抗原的，因此，半抗原分子的空间构象对抗体免疫学特性有决定性影响，半抗原分子改造或偶联过程中如果空间结构发生变化，则很可能制备不出所需要的抗体。zan的分子量为320.38，属于小分子半抗原物质，由于其自身结构简单，只具有免疫反应性，可以与相应的抗体结合；但不具有免疫原性，因此不能直接刺激机体产生相应的抗体，必须与大分子的载体物质如bsa，ova，匙孔血蓝蛋白(klh,keyholelimpethemocyanin)或非抗原性的多聚赖氨酸等偶联后，才能具有免疫原性，通过刺激动物机体产生针对zan的抗体。小分子与载体蛋白偶联是否成功需要进行质量鉴定，鉴定方法一般包括紫外扫描鉴定、凝胶电泳鉴定、红外光谱法(ir)鉴定、质谱鉴定及动物免疫鉴定。紫外扫描、凝胶电泳、红外光谱及质谱鉴定只是根据物质特征吸收峰有无变化、载体蛋白分子质量变化情况来初步判定半抗原与载体蛋白是否偶联在一起，但不能确定偶联方式是否正确，即偶联过程中是否对半抗原的特征结构(半抗原的抗原决定簇)产生影响，如果偶联过程中半抗原的抗原决定簇被破坏，则即使半抗原与载体蛋白偶联在一起，能刺激动物机体产生抗体，但所产生的抗体并不是针对半抗原的抗体。因此，半抗原与载体蛋白偶联是否成功，是否能刺激机体产生针对半抗原的抗体，最好的方法是通过免疫动物来确定，或者用已知的半抗原的抗体来确定。发明人在研究中发现制备的玉米赤霉烯酮抗体与玉米赤霉酮有交叉反应性，但和bsa及ova没有交叉反应性，因此，本发明用制备的zan-o-bsa及zan-o-ova包板测定zen抗体效价，以确定是否偶联正确，结果两个人工抗原均能测定到zen抗体效价，说明本发明的偶联方法正确，且制备的人工抗原是成功的，制备过程并没有改变zan的抗原决定簇，为后面抗体的制备奠定了良好的基础。zal及zan均属于小分子化合物，根据分子抗原决定簇数目计算公式，分子量小于1万，抗原决定簇只有1个。zan和zal二者只是在七位碳原子上结构有所不同，zal的c7位碳原子为羟基，而zan为酮基，二者的抗原决定簇可能有一定的交叉重合，因此产生交叉反应性。以前的研究证明zen抗体与zan及zal有一定的交叉反应，说明三者的抗原决定簇至少有部分是重叠的。从zen结构上分析可以看出zen中c11-c12位点双键肯定是抗原决定簇的一部分，同时c7位点的结构也应该抗原决定簇一部分，正是由于这两个部位结构的不同，导致zen单克隆抗体与zan及zal交叉反应率的不同，也导致本发明中制备的zal单克隆抗体与zen及zal交叉反应率的不同。以往在对zal苯环上的羟基时改造制备人工抗原时，由于破坏了或至少是部分破坏了抗原决定簇，因此导致制备的抗体灵敏性不高，甚至制备的抗体不是真正的zal抗体，因此用zal阻断zal-o-ova与zal-o-bsa免疫动物产生的抗体反应时，并没有见到阻断作用或阻断效果不好。而用zan肟化改造c7位的酮基时，改造后其结构与zal结构比较相似，抗原决定簇比较吻合，因此zan-o-bsa免疫动物产生的抗体，可以与zal反应，而且反应灵敏度比较高。本发明利用制备的人工抗原zan-o-bsa免疫动物产生抗血清，zal作为检测靶标物，通过阻断elisa筛选，筛选出分泌抗zal单克隆抗体的杂交瘤细胞，并制备出zal单克隆抗体，该抗体灵敏度高ic50为577pg/ml，亲和力强。基于本发明所制备的单克隆抗体，可以建立玉米赤霉醇酶联免疫、化学发光、时间分辨、荧光偏振等免疫学检测方法，并可制备玉米赤霉醇胶体金试纸条及拉曼增强胶体金试纸条等快速检测产品。本发明制备的zal抗体与其结构类似物(β-zal、α-zel、β-zel、zan、zen)有或多或少的交叉反应性，用此抗体建立zal免疫学检测方法进行样品检测时，可以进行zal及结构类似物的多残留检测。附图说明图1为6号免疫小鼠血清抑制曲线图。图2为zal单克隆抗体腹水的抑制曲线图。图3为zal单克隆抗体腹水亲和力测定图。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实施步骤。本发明所用实验材料主要为：1、试剂α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,zal)、β-玉米赤霉醇(β-zal)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-zel)、β-玉米赤霉烯醇(β-zel)、玉米赤霉酮(zearalanone,zan)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)及黄曲霉毒素b1(afb1)等毒素标准品、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)购自于sigma-aldrich公司。赭曲霉毒素a(ota)、伏马菌素b1(fb1)、t-2毒素及呕吐毒素(don)等毒素标准品、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)由thermoscientific公司生产；弗氏完全佐剂(fca)及弗氏不完全佐剂(fia)购自于pierce公司；羧甲基羟胺半盐酸盐(cmo)购自日本东京化成工业株式会社；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)等其他试剂均购自于市售，均为国产分析纯或更高级别试剂。2、溶液0.01m，ph7.4磷酸盐缓冲液(pbs)，室温保存(注：用于动物免疫时必须经高压灭菌处理)。0.05m，ph9.6碳酸盐缓冲液(cbs)，室温保存。elisa实验洗液pbst，pbs+5％tween-20，室温保存。显色液a，含有浓度5.315mm的过氧化脲及浓度0.446mm的非那西丁的ph5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液(0.1m乙酸钠溶液：0.1m柠檬酸溶液＝3:17，v/v)，冷藏避光保存；显色液b，含有浓度6.639mm的tmb的甲醇与甘油等量混合溶液；使用时显色液a和显色液b等量混合均匀。终止液：2m硫酸溶液。3、实验动物及细胞系spf级6周龄雌性balb/c小鼠，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室实验动物中心繁殖饲养。细胞融合所用ns0细胞系，英国动物健康研究院惠赠，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室实传代培养。实施例1、zan人工抗原1、zan人工抗原的制备(1)称取2mgzan溶解于2ml无水吡啶中，然后加入4mg的cmo，在旋转蒸发仪上115℃控温回流2h，再旋转蒸发干燥；用甲醇洗涤制备的干燥物2次，每次1ml，旋转蒸发干燥；再用1ml双蒸水重新溶解所得干燥物(甲醇洗涤后的旋干物)，2m的naoh调节溶液ph值到8.0；用等体积甲苯抽提3次，弃甲苯层，留水相层；最后把所得水相用等体积乙酸乙酯萃取3次，弃水相，留乙酸乙酯相，旋转蒸发干燥，得到zan-o；(2)用1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解zan-o，磁力搅拌，搅拌的同时加入2mgedc和1.2mgnhs，继续搅拌2h，记为a液；(3)称取5mgbsa加入500μl质量分数0.3％nahco3溶液中，记为b液；(4)将b液进行磁力搅拌，边搅拌边缓慢滴加入a液，滴加结束后继续搅拌2h；(5)取出步骤(4)的a和b混合液，装入制备好的透析袋内，对pbs透析3天，第一天换透析液8次，第二天换透析液6次，第三天换透析液4次，得到zan-o-bsa。采用同样的方法，用ova(提前一天把ova溶解于质量分数0.3％nahco3溶液)替代bsa，制得zan-o-ova。2、zan人工抗原的质量鉴定采用zen单克隆抗体对所制备的人工抗原进行了鉴定，通过紫外扫描测定出制备的人工抗原zan-o-bsa及zan-o-ova的浓度分别为5.78mg/ml和8.9mg/ml。把制备的人工抗原zan-o-bsa及zan-o-ova分别用cbs稀释到4μg/ml，然后分别包被酶标板，50μl/孔，4℃孵育过夜，或37℃孵育2h，pbst洗涤酶标板4-6次，拍干后每孔加入230mlpbst+5％猪血清封闭酶标板，37℃孵育1h，pbst洗涤酶标板4-6次，拍干，制备出zan-o-bsa及zan-o-ova包被的酶标板。用间接elisa测定zen单克隆抗体效价，根据效价的有无确定抗原制备是否成功。间接elisa测定zen单克隆抗体效价步骤：(1)取包被好的酶标板，酶标板所有孔先用pbs50μl/孔铺板，然后第一孔加入用pbs1:5000(v/v)稀释的zen单克隆抗体50μl，移液枪吹打混匀后，取出50μl加入到第二孔，吹打混匀，取出50μl加入到第三孔，同样的方法，一直倍比稀释到第七孔，混匀后，取出50μl弃掉，第八孔作空白对照孔，37℃恒温箱孵育15min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；(2)加入pbs稀释的1:1000(v/v)的酶标二抗50μl/孔，37℃恒温箱孵育30min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；(3)取等量的显色液a、b，混合均匀，每孔加入50μl，室温显色5-10min，此时孔中溶液显色深浅不一的蓝色，空白孔无色；(4)每孔直接加入终止液50μl；(5)酶标仪450nm处，读取od450值。测定zen单克隆抗体的效价结果见表1。从表1的结果可以看出，使用制备的人工抗原包板后，测定zen单克隆抗体的效价时，显示zan-o-bsa及zan-o-ova包被的酶标板均能测定出zen单克隆抗体的效价，说明制备的人工抗原是成功的。表1、制备的zan-o-bsa及zan-o-ova包板测定zen单克隆抗体效价的结果zen单抗稀释倍数1×1042×1044×1048×10416×10432×10464×104空白zan-o-bsa＞3.53.0441.8471.0280.5790.3430.2430.064zan-o-ova1.1820.8690.6530.3870.2890.1960.1630.042实施例2、单克隆抗体1、动物免疫及免疫效果测定1.1、动物免疫选取健康的spf级6周龄雌性balb/c小鼠6只，利用zan-o-bsa进行免疫，免疫剂量每次50μg蛋白(zan-o-bsa)/只；采用背部皮下的免疫方式，4-6个点注射，共免疫四次，免疫间隔3-4周。第一次免疫时把zan-o-bsa用pbs稀释成100μg蛋白/200μl，然后加入等量的fca，充分乳化后(取乳化好的乳液一滴，置于水面上，乳滴浮在水面上，且不发生扩散，证明乳化完全)，注入balb/c小鼠皮下200μl。后续三次强化免疫时，用fia替换fca进行乳化即可，其他试剂及程序不变。1.2、免疫效果测定四免10天后，将免疫balb/c小鼠断尾采血10μl，加入到990μlpbs中，5000rpm离心10min，弃沉淀留上清用于血清抗体效价和血清抗体抑制效价(灵敏性ic50)的测定。2μg/mlzan-o-ova包被酶标板，50μl/孔，4℃孵育过夜，或37℃孵育2h，pbst洗涤酶标板4-6次，拍干后加入230μl/孔pbst+5％猪血清封闭酶标板。间接elisa测定血清抗体效价(测定步骤同zen单克隆抗体效价测定，只是把zen单克隆抗体换成小鼠血清)，p/n≥2.1(待测孔od450/ncod450≥2.1)且待测孔od450≥0.2，则判定为阳性孔(表2)。表2说明zan-o-bsa免疫小鼠后能产生抗体。表2、zan-o-bsa免疫小鼠后血清抗体效价间接竞争(阻断)elisa测定血清抗体抑制效价测定时，用zal替代zan作为竞争物与酶标板上包被的zan-o-ova竞争结合血清抗体(表3)。间接竞争(阻断)elisa测定血清抗体抑制效价步骤为：取包被好的酶标板，第一孔至第六孔分别加入500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.62ng/ml的zal标准液50μl，第七孔和第八孔分别加入50μlpbs，然后第一至第七孔分别加入50μl测定的血清(血清最终稀释倍数是抗体效价测定时，od值最为接近于1.0时对应的稀释值)，37℃恒温箱孵育15min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；后面的步骤与抗体效价测定完全一致。从表3可以看出，500ng/ml以下浓度的zal可以或强或弱地抑制zan-o-ova与血清抗体的结合。其中6号小鼠抑制效果最好，通过拟合标准曲线(图1)，可以计算得出ic50为40.04ng/ml，因此选择6号小鼠作为融合小鼠。表3、zan-o-bsa免疫小鼠后血清抗体抑制效价2、zal单克隆抗体制备及免疫学性能鉴定2.1、阳性杂交瘤筛选选取6号小鼠作为细胞融合用小鼠。用高压无菌处理的pbs稀释50μgzan-o-bsa至200μl，不加佐剂，直接注射到融合用小鼠腹腔进行超强免疫。3天后，摘取眼球放血，完毕后抻颈处死小鼠，小鼠尸体置于75％酒精中浸泡5min。超净台上无菌取小鼠脾脏与ns0细胞进行融合。小鼠脾脏细胞与ns0细胞融合后，均匀的融合细胞悬液按100μl/孔分别加入到96孔酶标板上，共铺板10块酶标板，960个孔，放于37℃、5％co2培养箱中；再进行阳性杂交瘤细胞筛选。结果发现，融合细胞铺板3天后，960孔中898孔有细胞生长，而其余62个孔没有看见细胞生长，即93.54％细胞孔有细胞生长，说明细胞融合率比较高。待融合细胞生长至覆盖培养孔1/3孔底面积时，将培养细胞板各孔的细胞上清取出25μl，加入到每孔含有25μlpbs的由2μg/mlzan-o-ova包被的酶标板孔中，间接elisa测定细胞上清od450值(步骤同zen单克隆抗体效价测定，但第一步中只加入细胞上清，不用倍比稀释)，od450值在1.0以上的认为是阳性孔，共有44孔，阳性孔率为4.58％，以5ng/ml、2ng/ml两个浓度zal测定44阳性孔的抑制效价，其中2孔细胞上清ic50在2ng/ml以下。将这2孔细胞转至24孔酶标板扩大培养亚克隆，用1ng/mlzal测定抑制效价，选择ic50在1ng/ml以下阳性孔，最终得到一株能分泌抗zal单克隆抗体的杂交瘤细胞株12b10a7。2.2、腹水制备体内诱生腹水法批量制备抗体。向balb/c小鼠体内注入石蜡400μl/只以诱发炎症，7-10天后注入制备好的能分泌抗zal单克隆抗体的杂交瘤细胞株12b10a7，观察小鼠腹部变化，一般小鼠在注射10天左右，小鼠腹腔变大，小鼠腹腔皮肤紧绷时，用消毒的大号针头刺破腹腔，收集腹腔液体即为腹水。将腹水3000r/min离心5min，去细胞及杂质留上清，得到玉米赤霉醇单克隆抗体。2.3、免疫学性能鉴定2.3.1、浓度测定采用onedroptm光谱仪测定单克隆抗体蛋白浓度。通过光谱仪测定，所制备的单克隆抗体蛋白浓度约为20.29mg/ml。2.3.2、单克隆抗体腹水效价测定间接elisa测定单克隆抗体腹水效价，步骤同实施例2中1.2免疫效果测定的血清抗体效价测定(表4)。表4结果表明，间接elisa测定单克隆抗体腹水效价为2.56×105。表4、zal单克隆抗体腹水效价2.3.3、单克隆抗体腹水抑制效价测定间接竞争elisa测定单克隆抗体腹水抑制效价，步骤同实施例2中1.2免疫效果测定的血清抗体抑制效价测定，其抑制曲线见图2。线性方程为y＝-0.5483x+0.3691，相关系数r2＝0.9666，通过公式计算ic50为0.577ng/ml。2.3.4、单克隆抗体特异性鉴定同样采用间接竞争elisa测定单克隆抗体特异性，把竞争物从zal替换为其他zal结构类似物、其他毒素以及人工抗原制备时所用的载体蛋白bsa和ova，单克隆抗体特异性鉴定结果见表5。表5结果可以看出，所制备的单克隆抗体除了与α-zal反应外，与zan有77.65％的交叉反应率，与β-zal有43.06％的交叉反应率，与α-zel和β-zel分别有15％左右的交叉反应率，与zen有近10％的交叉反应率，与其他霉菌毒素如afb1、ota、fb1、t-2毒素、don以及载体蛋白bsa、ova交叉反应率均小于0.1％。表5、zal单克隆抗体特异性2.3.5、单克隆抗体亲和力测定pbs稀释zan-o-ova成0.5μg/ml和1μg/ml两个浓度进行包板。pbs把单克隆抗体稀释至8μg/ml。在两个zan-o-ova浓度包被的酶标板上，分别加入倍比稀释上述已知质量浓度的单克隆抗体，测定od450值。根据亲和力常数计算公式，计算亲和力常数ka值。亲和力测定曲线如图3。zal单克隆抗体与抗原结合达半饱和时对应zal单克隆抗体的浓度分别是0.8095μg/ml和0.4898μg/ml，将所得的值换算成摩尔浓度值带进公式得ka为4.7×1011l/mol。而一般认为，亲和常数为107-1012l/mol时表明抗体具有高亲和力，由此可知本发明获得了高亲和力的zal单克隆抗体。以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12