一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法与流程

本发明涉及一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，属于动物外周血白细胞分离和培养领域。

背景技术：

团头鲂 (Megalobrama amblycephala)，隶属于硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属。具有肉质嫩滑，味道鲜美，营养丰富，容易饲养，成活率高等特点，深受养殖者和消费者喜爱。2015年总产量达70多万吨，且呈逐年增长的趋势，是中国主要的淡水养殖品种之一。它目前养殖面积已遍布我国20余省，受到当地养殖者的喜爱和欢迎，并取得了较好的社会效益和经济效益。

细胞是动物的结构和功能的基本组成单位，利用培养的细胞作为试验材料已经广泛应用到环境毒理学、鱼类肿瘤学、生理学、内分泌学、遗传学和资源保护等方面。除此之外，由于近年来水产养殖业中病害频发，鱼类细胞培养技术越来越多地应用于水产动物病害防治领域，主要为：1、鱼类病毒学：鱼类细胞培养技术广泛应用于鱼类病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备；2、营养免疫学：分离鱼类免疫细胞，离体条件下使营养素对免疫细胞直接作用，这种方法可以快速、准确地发现营养素对细胞的免疫调控作用。此外，在研究过程中，使用原代培养细胞较使用细胞系进行试验的技术难度低、试验成本降低，同时也更接近鱼体自身生理条件，使试验结果更具说服力。

外周血白细胞是机体体液免疫和细胞免疫的重要组成部分，对研究机体免疫调节机制具有指导性作用。在白细胞分离与培养研究中，哺乳动物类白细胞需要外源刺激物（如白细胞介素）周期性的不断刺激才能达到体外长期培养目的，但是鱼类白细胞只需要一次或者不需要刺激，就可以保持体外长期增殖状态。目前有一些关于鱼类外周血白细胞分离与培养的论文，但是未见团头鲂外周血白细胞分离及原代培养方法的文献。因此本专利主要介绍团头鲂外周血白细胞分离与原代培养方法，为团头鲂原代白细胞分离培养提高参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法。

按照本发明提供的技术方案，一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，步骤如下：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中，每天3次投喂常规优质饲料15-20天；

（2）血液采集：随机抽取经过强化训练健康的团头魴进行麻醉，并用酒精棉球擦拭鱼体，进行尾静脉抽血；全血与含2000-3000U 肝素钠Heparin的RPMI-1640培养基稀释后备用；

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清FBS润湿，依次用注射器小心加入3-5 mL 质量浓度45%-60%的硅胶颗粒混悬液Percoll和3-4 mL质量浓度10%-40%的Percoll溶液，保持界面清晰；

（4）分离纯化：取步骤（1）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（2）所得分离液上，在4-10℃，400-450g离心20-30min，然后小心从离心机中取出；用1mL注射器或移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞，将收集的白细胞放入新的离心管中，重悬细胞；然后在4-10℃，400-600g离心 5-15min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞，重复洗涤2-3次；

（5）原代培养：用RPMI-1640完全培养基重悬步骤（3）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3-4mL RPMI-1640完全培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO2环境进行培养2-4 h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞。

步骤（1）所述健康团头魴要进行强化培养，具体培养方法如下：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2-7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规优质饲料，饲养15-20天。

步骤（2）具体如下：随机抽取健康团头魴用MS-222进行麻醉，后用质量浓度为75%的酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血；按照全血与RPMI-1640培养基质量比为1-2：1-3的比例稀释，备用。

所述RPMI-1640培养基中添加质量浓度5%-10 %的磷酸缓冲盐溶液FBS、100-150 U /mL青霉素、100-150 U/mL链霉素和Heparin: 1500-2000U。

步骤（4）重悬细胞时，采用RPMI-1640完全培养基或含质量浓度5%-15%的新生牛血清、pH 7.4、0.01mol /L的PBS无菌磷酸盐缓冲液。

所述质量浓度为10%-60%的Percoll溶液的配置方法为：取2.0-6.0mL的Percoll，加入1.5mol/L的NaCl溶液1-2mL，Heparin:1500-2000U，再加入蒸馏水3-16mL，充分混合。

所述分离液配置过程中，高浓度Percoll溶液在低浓度Percoll溶液下方，且高浓度Percoll溶液体积大于或等于低浓度Percoll溶液，同时需保持界面清晰。

步骤（5）中，细胞培养2-4 h后细胞贴壁，后应及时给细胞换液，再培养24h可获得纯化后的白细胞。

本发明的有益效果：本发明对团头魴外周血白细胞的分离、纯化和培养等过程，和培养液的、分离液的成分进行了详细的描述。根据本发明团头魴外周白细胞的分离培养方法，能够分离出纯度高、活性强的白细胞，并且大大缩短了细胞分离培养的时间。所建立的团头魴外周白细胞模型可用于外源物质的药物筛选、细胞毒性、离子交换规律等相关研究，并为这些研究提供了便利。

附图说明

图1是实施例3分离效果示意图。

具体实施方式

以下实施例中常规饲料购自通威股份有限公司；RPMI-1640购自GIBCO，美国；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Percoll购自北京索莱宝科技有限公司，链霉素购自碧云天生物技术研究所。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例 1本发明一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养的方法，包括以下步骤：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2-7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规优质饲料，饲养15天。

（2）血液采集：随机抽取经过强化培养后的150g无病无害的团头鲂，MS-222麻醉后用75%酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血。全血与RPMI-1640培养基（添加 5% FBS、100 U /mL青霉素和100U/mL链霉素）按1：2比例稀释。

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清润湿后，依次用注射器小心加入4mL 49%的Percoll溶液（Percoll: 9.8mL、1.5mol/L NaCl :2.0mL、蒸馏水: 8.2mL、Heparin: 2000U）和3mL 10%的Percoll溶液 （Percoll: 2.16mL、 1.5mol/L NaCl :2mL、蒸馏水: 15.83mL、Heparin: 2000U），然后将2mL的稀释液缓慢加到分离液上，注意保持界面清晰。

（4）分离纯化：取步骤（1）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（2）所得分离液上，4℃，500g离心30min，然后小心从离心机中取出，用1mL移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞。将收集的白细胞放入新的离心管中，用0.01mol /L无菌磷酸盐缓冲液（PBS，含5%的新生牛血清，pH 7.4）进行细胞洗涤。4℃，500g离心 10 min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞。重复洗涤2次。

（5）原代培养：用RPMI-1640完全培养基重悬步骤（3）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3-4mL RPMI-1640完全培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO2环境进行培养2-4 h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞。

实施例 2

本发明一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养的方法，包括以下步骤：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2-7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规优质饲料，饲养20天。

（2）血液采集：随机抽取健康团头魴用MS-222进行麻醉，后再用质量浓度为75%的酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血；按照全血与RPMI-1640培养基质量比为1-2：1-3的比例稀释，备用。全血与RPMI-1640培养基（添加 10% FBS、150 U /mL青霉素和150U/mL链霉素）按1：2比例稀释。

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清润湿后，依次用注射器小心加入4mL 59%的Percoll溶液（Percoll: 5.9mL、1.5mol/L NaCl :1.0mL、蒸馏水: 3.06mL、Heparin: 2000U）和3mL 40%的Percoll溶液（Percoll: 4.01mL、1.5mol/L NaCl :1mL、蒸馏水: 4.96mL、Heparin: 2000U），然后将2mL的稀释液缓慢加到分离液上，注意保持界面清晰。

（4）分离纯化：取步骤（1）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（2）所得分离液上，4℃，500g离心30min，然后小心从离心机中取出，用1mL移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞。将收集的白细胞放入新的离心管中，用0.01mol /L无菌磷酸盐缓冲液（PBS，含5%的新生牛血清，pH 7.4）进行细胞洗涤。4℃，500g离心 10 min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞。重复洗涤2次。

（5）原代培养：用RPMI-1640完全培养基重悬步骤（3）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3-4mL RPMI-1640完全培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO2环境进行培养2-4 h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞。

实施例3 本发明一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养的方法，包括以下步骤：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2-7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规饲料，饲养18天。

（2）血液采集：随机抽取健康团头魴用MS-222进行麻醉，后用质量浓度为75%的酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血；按照全血与RPMI-1640培养基（添加 5% FBS、120 U /mL青霉素和120U/mL链霉素）按1：3比例稀释。

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清润湿后，依次用注射器小心加入4mL 51%的Percoll溶液（Percoll: 5.1mL、 1.5mol/L NaCl :1mL、蒸馏水: 3.86mL、Heparin: 2000U）和3mL 34%的Percoll溶液（Percoll: 3.4mL、1.5mol/L NaCl :1mL、蒸馏水: 5.56mL、Heparin: 2000U），然后将2mL的稀释液缓慢加到分离液上，注意保持界面清晰。

（4）分离纯化：取步骤（1）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（2）所得分离液上，4℃，400g离心25min，然后小心从离心机中取出，用1mL移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞。将收集的白细胞放入新的离心管中，用RPMI-1640细胞液重悬细胞。4℃，500g离心 10 min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞。重复洗涤2次。

（5）原代培养：用RPMI-1640完全培养基重悬步骤（3）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3mL RPMI-1640完全培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO2环境进行培养2h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞。

其中根据实施例3，可以得到以下分离效果，具体如图1所示。

最后，还需要注意的是，以上例举的仅是本发明的若干个具体实施例中的几种。显然，本发明不局限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。