一种增强型荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明属于荧光检测材料技术领域，具体涉及一种增强型荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

偶氮还原酶是一种氧化还原酶，能够将偶氮复合物还原为芳香胺类产物；它广泛存在于细菌菌群中，用于分解有机物提供生存养料。目前，偶氮染料广泛应用于印染、食品和化妆品等行业中。排放在废水中残存的偶氮染料组分会严重影响光对水的通过性和水生生物的生长，破坏水体生态平衡。因此，通过使用恰当含量的细菌偶氮还原酶来处理废水中残存的偶氮染料等物质引起的人们的广泛兴趣。不仅如此，细胞在缺氧状态下(如肿瘤组织)会表达偶氮还原酶、硝基还原酶等氧化还原酶；另外有研究表明，生物结肠内存在着调控生理代谢的菌群；然而当结肠发生炎性病变时，肠道内菌群会激增并分泌出大量的偶氮还原酶。因此，灵敏、可靠的偶氮还原酶的检测具有重要意义。

迄今为止，国内外研究人员对偶氮还原酶检测的研究相对较少，其检测方法主要是荧光的方法。荧光法在分析检测上具有识别响应快、专一性好、选择性高、使用方便等特点；荧光探针在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要；非常适合偶氮还原酶的分析检测。现存的荧光法(例如发表论文Chem.Commun.,2012,48,6393–6395)，利用环己烷接枝了两分子丹磺酰胺，并用偶氮键固定防止其构象的变化，由此制备了偶氮还原酶的检测体系，由于偶氮还原酶不易保存没有商业化渠道提供，他们利用了连二亚硫酸钠模拟偶氮还原酶的作用，与偶氮基团发生反应，使得偶氮键发生断裂，环己烷发生船式和椅式构象的变换，丹磺酰胺原来在552nm处的激基缔合物荧光减弱，在448nm处单体的荧光增强，从而实现了对偶氮还原酶的比率型荧光检测；但该体系不能同时追踪肠炎药物的释放，并且水溶性不好，测试需加大量有机溶剂。又如，荧光增强型检测偶氮还原酶的方法(例如发表论文Chem.Commun.,2013,49,8815--8817)，合成了一种将罗丹明110氨基偶氮化的荧光探针，该探针分子在520nm处基本没有荧光发射，当偶氮还原酶模拟物连二亚硫酸钠与之反应后，即原本的偶氮键还原变为氨基变成罗丹明110结构，从而在450nm的激发光照射下，在520nm处荧光强度明显增加，实现了对偶氮还原酶的荧光增强型检测；但该体系不能同时追踪肠炎药物的释放，并且水溶性不好。由上可见，本领域急需发展水溶性好、准确度高的简便的偶氮还原酶检测方法，并能够同时追踪炎症药物如5-氨基水杨酸的释放，为结肠炎的诊治提供辅助手段。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种增强型荧光探针。

本发明的另一目的在于提供上述增强型荧光探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述增强型荧光探针在偶氮还原酶检测或追踪肠炎药物释放中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种增强型荧光探针，所述荧光探针为5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸，其具有式(1)所示的分子结构式：

上述增强型荧光探针的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)将4-甲基-苯磺酰氯溶于二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护的条件下滴加到乙二胺中，室温下搅拌反应过夜，反应产物经分离纯化，得到固体N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺，然后将N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺与4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于乙醇中，升温至85℃-90℃搅拌反应18-21h，反应完成后冷却至室温过滤，得到N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺；

(2)取上述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺与五水硫酸铜用1,4－二氧六环溶解，再加入乙二胺，加热至100℃-110℃反应5-7h，反应产物经分离纯化，得到N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺固体粉末；

(3)取5-氨基水杨酸与盐酸混合加热溶解，待冷却至室温后，在冰浴条件下加入亚硝酸钠反应，得到产物水杨酸氯化重氮盐；在冰浴条件下将苯酚溶于水，调节pH为7～9，再滴加上述水杨酸氯化重氮盐反应3.5-4h，得到产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸；然后将2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸与二溴丙烷混合搅拌溶解后加入碳酸钾，升温至40℃-45℃反应过夜，反应产物经分离纯化，得到5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸；

(4)取步骤(2)所得产物N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺固体粉末与步骤(3)所得产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸在N,N-二甲基甲酰胺中搅拌溶解，再加入碳酸钾，充分溶解后加热至45℃-50℃搅拌反应过夜，反应产物经分离纯化，得到5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸。

上述制备方法的合成路线图如图1所示。

优选地，步骤(1)中所述4-甲基-苯磺酰氯与乙二胺的摩尔比为1:(10～10.2)；所述N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺与4-溴-1,8-萘二甲酸酐的摩尔比为1:1。

优选地，步骤(2)中所述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺与五水硫酸铜的摩尔比为18:(1～1.2)；所述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺与乙二胺摩尔比为1:(30～30.2)。

优选地，步骤(3)中所述5-氨基水杨酸与盐酸中HCl的摩尔比1:(3～3.1)；所述5-氨基水杨酸与亚硝酸钠的摩尔比为1:(1.2～1.5)；所述水杨酸氯化重氮盐与苯酚的摩尔比为(1～1.2):1；所述2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸与二溴丙烷的摩尔比为1:(2.5～2.7)；所述2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸与碳酸钾的摩尔比为1:1。

优选地，步骤(4)中所述N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺与5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸的摩尔比为1:(1～1.1)；所述碳酸钾与5-[4-3-溴-丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸的摩尔比为(1.2～1.5):1。

优选地，步骤(1)中所述分离纯化的步骤为：将反应液用二氯甲烷和碳酸钾水溶液萃取三次，收集有机相，加硫酸镁干燥，过滤，将所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(2)中所述分离纯化的步骤为：反应液冷却至室温后旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(3)中所述分离纯化的步骤为：反应液用二氯甲烷和水萃取，取有机层旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(4)中所述分离纯化的步骤为：反应液旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。

上述增强型荧光探针在偶氮还原酶检测或追踪肠炎药物释放中的应用。

本发明所得产物探针化合物5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸(NAP-azo-ASA)，分子式为C₃₉H₃₈N₆O₈S，相对分子质量为749.83。NAP-azo-ASA为浅黄色无味固体粉末，溶于水，易溶于乙醇、四氢呋喃等溶剂。该化合物光稳定性好，无毒，也具有良好的生物相容性。由于萘酰亚胺具有可见光激发的特性，其在465nm的激发光照射下，在545nm左右发射黄绿色荧光。而连接上5-氨基水杨酸偶氮苯衍生物后，由于偶氮苯分子在紫外-可见光区的强烈吸收，淬灭了萘酰亚胺的荧光，使得探针分子NAP-azo-ASA基本没有萘酰亚胺的荧光发射。当具有识别作用的偶氮基团在与偶氮还原酶或其模拟物连二亚硫酸钠反应后，偶氮键断裂转变为氨基，由此在545nm左右发射黄绿色荧光得以恢复增强。本发明荧光探针可用于生物样品、环境样品、化学样品中偶氮还原酶的定性分析及结肠炎药物释放的追踪。

相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的探针化合物由可见光激发和发射的荧光发色团萘酰亚胺和偶氮还原酶识别基团5-氨基水杨酸偶氮苯衍生物构成。该探针化合物不仅水溶性较好，而且在水中时，偶氮苯基团在紫外-可见光范围内具有强烈的吸收，萘酰亚胺在545nm处的荧光能量被转移到偶氮苯基团并用于顺反异构的变化所需的能量耗散，使得探针分子本身几乎没有荧光，极大地降低了背景的干扰。

(2)当本发明的探针分子具有识别作用的偶氮基团与偶氮还原酶或其模拟物连二亚硫酸钠反应后，其偶氮键转变为氨基，由此在465nm的激发光的照射下，545nm左右的黄绿色荧光不断增强。以545nm的荧光强度为检测信号，因此可实现对偶氮还原酶的增强型荧光检测。

(3)由于结肠炎症致使肠内菌群数量激增(10¹¹-10¹²CFU/mL)，其表达的偶氮还原酶也大量升高。利用这种特性，所制备荧光探针可以利用偶氮还原酶含量的升高刺激结肠炎药物5-氨基水杨酸(5-ASA)的释放，并利用恢复的萘酰亚胺的荧光追踪5-ASA的释放。因此，运用该方法构建了一种新的灵敏度高、准确性高的检测偶氮还原酶的方法并能够同时追踪5-ASA的释放。

(4)本发明的探针化合物在应用时的检测体系使用方便，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明所述荧光探针化合物的合成路线图。

图2为实施例1中N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺的核磁共振氢谱图。

图3为实施例1中N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺的质谱图。

图4为实施例1中N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺的核磁共振氢谱图。

图5为实施例1中2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸的核磁共振氢谱图。

图6为实施例1中2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸的质谱图。

图7为实施例1中5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸的核磁共振氢谱图。

图8为实施例1中5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸的核磁共振氢谱图。

图9为实施例1中5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸的质谱图。

图10为使用连二亚硫酸钠模拟偶氮还原酶作用时，荧光探针溶液的荧光光谱随时间的变化图。

图11为使用连二亚硫酸钠模拟偶氮还原酶作用时，荧光探针溶液的荧光光谱随连二亚硫酸钠浓度的变化图。

图12为使用连二亚硫酸钠模拟偶氮还原酶作用时，荧光探针溶液中对其响应的5-氨基水杨酸的荧光光谱随时间变化图。

图13为荧光探针溶液对大鼠盲肠内偶氮还原酶响应的荧光强度随时间变化图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)取3g的4-甲基-苯磺酰氯(15.8mmol)溶于8mL二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护的条件下滴加到9.48g乙二胺(158mmol)中，所得混合溶液室温下搅拌过夜。反应完成后将反应混合液用二氯甲烷和碳酸钾水溶液萃取三次，收集有机相，加硫酸镁干燥，过滤；将所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝8:1)，旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺。利用核磁共振氢谱来对其进行表征：¹H NMR(400MHz,CD₃OD-d₄,δppm):7.65-7.69ppm(d,2H)、7.37-7.42ppm(d,2H)、2.66-2.71ppm(t,2H)、2.47-2.52ppm(m,4H)、2.35-2.41ppm(s,3H)。其中2.36ppm为甲基上质子的特征峰，2.47-2.52ppm的四重峰和2.66-2.7ppm处的三重峰为亚甲基质子的特征峰，低场7.65-7.69ppm、7.37-7.42ppm处为苯环质子的特征峰。其核磁共振氢谱和质谱图分别如图2和图3所示。将上述得到的N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺固体(430mg,2mmol)与4-溴-1,8-萘二甲酸酐(554mg,2mmol)溶于20mL乙醇中，搅拌使其完全溶解；所得溶液在85℃加热搅拌的条件下反应为18h；冷却至室温后，过滤，得到N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺。

(2)取上述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(974mg,2mmol)与28mg五水硫酸铜(0.11mmol)加入封管中，用20mL 1，4－二氧六环溶解，再加入4mL乙二胺(60mmol)；加热至100℃，反应5h；反应液冷却至室温后旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，v/v＝20:1,含1％醋酸)，旋转蒸发出去有机溶剂，得到N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺固体粉末。通过核磁图谱对该产物进行表征，¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δppm):8.68-8.72(d,1H),8.37-8.40(d,1H),8.20-8.22(d,1H),7.60-7.68(t,1H),7.57-7.61(d,1H),6.77-6.82(d,1H),4.05-4.07(t,2H),3.39-3.41(t,2H),3.01-3.06(t,2H),2.86-2.90(t,2H),2.25-2.29(s,3H)。其中8.69ppm、8.38ppm、8.21ppm、7.64ppm、7.58ppm、6.77ppm分别是苯环上质子的特征峰，2.26ppm是甲基上的特征峰，4.07ppm、2.50ppm是N上质子的特征峰，3.39ppm、3.01ppm、2.88ppm是亚甲基上质子的特征峰。其核磁共振氢谱图如图4所示。另外通过质谱进行了辅助说明：MS(ESI):m/z 453.16[M-H]^-。

(3)取765mg 5-氨基水杨酸(5mmol)与1.25mL盐酸(15mmol)于封管中，加热至70℃，搅拌使其完全溶解；待冷却至室温后，在冰浴条件下向上述混合液中加入414mg亚硝酸钠(6mmol)，随后开始反应。反应至用淀粉碘化钾试纸进行测试，试纸变蓝时则反应完全，得到产物水杨酸氯化重氮盐。在冰浴条件下将470mg苯酚(5mmol)溶于水，滴加氢氧化钠将pH控制在8左右，再缓慢滴加上述水杨酸氯化重氮盐(约5mmol)，反应3.5h。得到产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δppm):10.2-10.3ppm(s,1H),8.24-8.26ppm(d,1H),7.99-8.03ppm(m,1H),7.76-7.80ppm(m,2H),7.12-7.14ppm(d,1H),6.92-6.95ppm(m,2H),2.48-2.53ppm(m,2H)。其中10.25ppm对应的是羧基质子的特征峰，6.92、6.94ppm是羟基质子的特征峰，8.24ppm、7.99ppm、7.76ppm、7.12ppm、6.92ppm分别是苯环上质子的特征峰。进一步又用质谱来验证其结构，MS(ESI):m/z 256[M-H]^-。其核磁共振氢谱图和质谱图分别如图5和图6所示。取50mg上述产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸(0.194mmol)与二溴丙烷(49.7μL,0.485mmol)于反应瓶中，搅拌溶解后加入碳酸钾(43mg,0.194mmol)，将反应温度升至40℃，反应过夜。反应结束后将反应液用二氯甲烷和水萃取，取有机层，旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δppm):11.04-11.06ppm(s,1H)、8.36-8.38ppm(d,1H)、8.03-8.08ppm(m,1H)、7.81-7.86ppm(d,1H)、7.07-7.01ppm(d,1H)、6.92-6.96ppm(d,1H)、4.53-4.58ppm(t,2H)、3.55-3.61ppm(t,2H)、2.35-2.40ppm(m,2H)。其中11.06ppm是羧基质子的特征峰，4.56ppm、3.59ppm、2.39ppm是亚甲基上质子的特征峰，8.37ppm、8.05ppm、7.82ppm、7.26ppm、7.10ppm、6.94ppm对应的是苯环上质子的特征峰。其核磁共振氢谱图如图7所示。

(4)取步骤(2)所得产物N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(381mg,0.79mmol)与步骤(3)所得产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸(300mg,0.79mmol)于反应瓶，加入31.6mL N,N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解，再加入129.8mg碳酸钾(0.95mmol)，充分溶解后，加热至45℃搅拌反应过夜。反应结束后旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)得到产物5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸。所得产物的核磁共振氢谱图和质谱图分别如图8和图9所示。

实施例2

(1)取3.6g的4-甲基-苯磺酰氯(18.94mmol)溶于18.94mL二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护的条件下滴加到11.5g乙二胺(191.3mmol)中，所得混合溶液室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合液用二氯甲烷和碳酸钾水溶液萃取三次，收集有机相，加硫酸镁干燥，过滤；将所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝8:1)，旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺。取上述得到的N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺固体(516mg,2.4mmol)与4-溴-1,8-萘二甲酸酐(664mg,2.4mmol)溶于30mL乙醇中，搅拌使其完全溶解；所得溶液在88℃加热搅拌的条件下反应20h；冷却至室温后，过滤，得到N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺。

(2)取上述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(1.1g，2.05mmol)与31.3mg五水硫酸铜(0.125mmol)加入封管中，用24mL1，4－二氧六环溶解，再加入4.1mL乙二胺(61.7mmol)；加热至105℃，反应6h；反应液冷却至室温后旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，v/v＝20:1,含1％醋酸)，旋转蒸发出去有机溶剂，得到N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺固体粉末。

(3)取918mg 5-氨基水杨酸(6mmol)与1.5mL盐酸(18.3mmol)于封管中，加热至73℃，搅拌使其完全溶解；待冷却至室温后，在冰浴条件下向上述混合液中加入538.2mg亚硝酸钠(7.8mmol)，随后开始反应。反应至用淀粉碘化钾试纸进行测试，试纸变蓝时则反应完全，得到产物水杨酸氯化重氮盐。在冰浴条件下将512mg苯酚(5.4mmol)溶于水，滴加氢氧化钠将pH控制在7左右，再缓慢滴加上述水杨酸氯化重氮盐(约6mmol)，反应3.8h。得到产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征。取60mg上述产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸(0.23mmol)与二溴丙烷(61.4μl,0.6mmol)于反应瓶中，搅拌溶解后加入碳酸钾(32mg,0.23mmol)，将反应温度升43℃，反应过夜。反应结束后将反应液用二氯甲烷和水萃取，取有有机层旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸。通过核磁共振氢谱对该产物进行表征。

(4)取步骤(2)所得产物N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(480mg,1mmol)与步骤(3)所得产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸(397mg,1.05mmol)于反应瓶，加入42mL N,N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解，再加入188mg碳酸钾(1.4mmol)，充分溶解后，加热至47℃搅拌反应过夜。反应结束后旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)得到产物5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸(NAP-azo-ASA)。

本实施例所得荧光化合物NAP-azo-ASA的中间体以及最终的化合物表征与实施例1中的结果是相同的。

实施例3

(1)取4.7g的4-甲基-苯磺酰氯(24.5mmol)溶于49mL二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护的条件下滴加到14.96g乙二胺(249.9mmol)中，所得混合溶液室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合液用二氯甲烷和碳酸钾水溶液萃取三次，收集有机相，加硫酸镁干燥，过滤；将所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝8:1)，旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺。取上述得到的N-(2-氨基-乙基)-4-甲基-苯磺酰胺(671mg,3.12mmol)与4-溴-1,8-萘二甲酸酐(863mg,3.12mmol)溶于46.8mL乙醇中，搅拌使其完全溶解；所得溶液在90℃加热搅拌的条件下反应21h；冷却至室温后，过滤，得到N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺。

(2)取上述N-[2-(6-溴-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(1.43g,2.9mmol)与48.7mg五水硫酸铜(0.193mmol)加入封管中，用43.5mL 1，4－二氧六环溶解，再加入5.8mL乙二胺(87.58mmol)；加热至110℃，反应7h；反应液冷却至室温后旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1,含1％醋酸)，旋转蒸发出去有机溶剂，得到N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺固体粉末。

(3)取1.2g 5-氨基水杨酸(7.8mmol)与2mL盐酸(24.18mmol)于封管中，加热至75℃，搅拌使其完全溶解；待冷却至室温后，在冰浴条件下向上述混合液中加入808.8mg亚硝酸钠(11.7mmol)，随后开始反应。反应至用淀粉碘化钾试纸进行测试，试纸变蓝时则反应完全，得到产物水杨酸氯化重氮盐。在冰浴条件下将611mg苯酚(6.5mmol)溶于水，滴加氢氧化钠将pH控制在9左右，再缓慢滴加上述水杨酸氯化重氮盐(7.8mmol)，反应4h。得到产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸。取78mg上述产物2-羟基-5-(4-羟基-苯基偶氮)-苯甲酸(0.3mmol)与二溴丙烷(83μl,0.81mmol)于反应瓶中，搅拌溶解后加入碳酸钾(42mg,0.3mmol)，将反应温度升45℃，反应过夜。反应结束后将反应液用二氯甲烷和水萃取，取有机层，旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝40:1)，得到产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸。

(4)取步骤(2)所得产物N-[2-(6-乙二胺基-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮)-乙基]-4-甲基-苯磺酰胺(624mg,1.3mmol)与步骤(3)所得产物5-[4-(3-溴丙氧基)-苯偶氮基]-2-羟基-苯甲酸(551mg,1.43mmol)于反应瓶，加入58.5mL N,N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解，再加入296.9mg碳酸钾(2.15mmol)，充分溶解后，加热至50℃搅拌反应过夜。反应结束后旋干溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)得到产物5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸(NAP-azo-ASA)。

本实施例所得荧光化合物NAP-azo-ASA的中间体以及最终的化合物表征与实施例1中的结果是相同的。

本发明所得荧光探针化合物在偶氮还原酶检测或追踪肠炎药物释放中的应用效果测试：

将3.7mg固体荧光化合物5-{4-[3-(2-{2-[2-(甲苯-4-磺酰胺基)-乙基]-1H-苯并(de)异喹啉-1,3(2H)-二酮-6-氨基}-乙胺基)-丙氧基]-苯偶氮基}-2-羟基苯甲酸(NAP-azo-ASA，实施例1制备)溶于5mL二甲基亚砜中，配置成浓度为1mM的荧光化合物母液。测试时，荧光化合物稀释用磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝6.8)至浓度为10μM，测试体系总量为3mL(含10％二甲基亚砜)。得到NAP-azo-ASA荧光探针溶液。

(1)NAP-azo-ASA荧光探针溶液对缓冲液中偶氮还原酶模拟物连二亚硫酸钠的荧光检测：

测试时，连二亚硫酸钠硫酸钠浓度稀释至0-100mM，测试温度为37℃，以465nm为激发波长，测得荧光光谱随时间的变化和随连二亚硫酸钠浓度变化分别如图10和图11所示。从图10和图11可以看出，在不存在连二亚硫酸钠的情况下，在465nm的激发光照射下，在545nm左右几乎没有发射黄绿色荧光；而在连二亚硫酸钠的存在下，由于NAP-azo-ASA与连二亚硫酸钠反应，偶氮键发生断裂还原为氨基，偶氮键淬灭荧光效应消失，在545nm处产生强烈的荧光，大约在20分钟荧光强度不再增长。以545nm处的荧光强度为检测信号，可实现对偶氮还原酶的增强型荧光检测。另外，通过315nm作为激发波长，观察5-氨基水杨酸在380-450nm的荧光信号，结果如图12所示，可以看到5-氨基水杨酸确实有被释放出来。

(2)NAP-azo-ASA荧光探针溶液对实际样品(S-D大鼠盲肠)中偶氮还原酶的荧光检测：

在对生物样品中的偶氮还原酶进行检测分析时，选取了雄性Sprague-Dawley大鼠(200g-250g)盲肠内容物悬浮于pH＝6.8的10mM磷酸盐缓冲液中，1.0g内容物约溶于25mL，剧烈振荡，过滤，滤液分装于1.0mL离心管中，放于冰箱-20℃保存。测试时，取出1.0mL冷冻的母液用磷酸盐稀释，加入10uM荧光探针分散液，总体积为3mL(含10％二甲基亚砜)，以465nm作为激发波长，该体系的在545nm处荧光强度的变化，结果如图13所示。从图13中数据可以看出，本发明所得荧光探针化合物对大鼠盲肠内偶氮还原酶有较好的检测效果，可以说明NAP-azo-ASA可适用于生物样品中偶氮还原酶的测试。该方法具有制备简便、准确度高等优点，在样品分析中显示了极大的潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。