包含编码甲基丙二酰‑CoA还原酶的基因的突变微生物及其用途的制作方法

本发明涉及含有具有使甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛活性的甲基丙二酰-CoA还原酶-编码基因的突变微生物以及该突变微生物的用途，更具体而言，涉及引入编码古生菌界衍生的甲基丙二酰-CoA还原酶的基因的突变微生物以及该突变微生物的用途。
背景技术：
：甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸甲基酯(methylmethacrylicacid)(或甲基丙烯酸甲酯)是可用于制备聚合物例如涂层、透明塑料或粘合剂的化合物。正在研发生物合成甲基丙烯酸方法及其应用。例如，Evonik研发了从例如氨、甲烷、丙酮或甲醇通过2-HIBA(2-羟基丁酸)合成甲基丙烯酸甲基酯的方法(2-HIBA脱水后酯化)。已知，可以转化为这样的甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸甲基酯(或甲基丙烯酸甲酯)的生物中间体不仅为2-HIBA，还可以为衣康酸、异丁酸、异丁烯、3-HIBA等。关于甲基丙烯酸甲基酯的生物合成，美国专利第8865439号公开了通过3-HIBA从碳源生物合成甲基丙烯酸甲基酯的途径，以及含有编码参与该途径的酶的基因的重组微生物。如图1所示，为了有效地从葡萄糖生物合成可展示出最高理论产量的3-HIBA，已知在甲基丙烯酸甲基酯的生物合成途径中必然需要甲基丙二酰-CoA还原酶。然而，甲基丙二酰-CoA还原酶并不是天然存在的酶。因此，为了构建如图1所示的3-HIBA的生物合成代谢途径，最迫切需要进行甲基丙二酰-CoA还原酶的筛选，该酶是使甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛的酶。在这样的技术背景下，本发明人从使甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛的酶(MCR)中筛选出了展示出甲基丙二酰-CoA还原酶活性的酶以及编码该酶的基因，从而完成了本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供引入MMCR(甲基丙二酰-CoA还原酶)-编码基因的突变微生物，其具有生产3-HIBA(3-羟基异丁酸)的能力，以及提供该突变微生物的用途。技术方案为了实现上述目的，本发明提供源自具有从碳源生产丁二酰-CoA能力的微生物的突变微生物，其中所述突变微生物含有编码以下酶的基因，并具有生产3-HIBA(3-羟基异丁酸)的能力：(i)甲基丙二酰-CoA变位酶；(ii)甲基丙二酰-CoA差向异构酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(MMCR)；以及(iv)3-羟基异丁酸脱氢酶，其中(iii)的所述酶为展示出甲基丙二酰-CoA还原酶(MMCR)活性的酶，选自具有丙二酰-CoA还原酶(MCR)活性的酶。本发明还提供生产3-HIBA的方法，其包括以下步骤：培养权利要求1-7中任一项所述的突变微生物以生产3-HIBA；以及回收所生产的3-HIBA。有益效果由于MMCR不是天然存在的，因此在从碳源(包括葡萄糖)生产3-HIBA的常规方法中不可避免地要绕过MMCR的代谢途径。然而，根据本发明，可使用一种酶，通过短的代谢途径生产3-HIBA，该酶展示出MMCR活性并选自具有MCR活性的酶。根据本发明生产的3-HIBA可用于生产MAA(甲基丙烯酸)和/或MMA(甲基丙烯酸甲基酯)，其在环境友好和成本效益方面是有利的，因为其不涉及有毒物质，例如HCN、CAN或甲酰胺，这不同于常规化学过程生产的MAA(甲基丙烯酸)或MMA(甲基丙烯酸甲基酯)。附图的简要说明图1显示从葡萄糖生产3-HIBA的代谢途径。图2显示通过PCR克隆MMCR候选基因的结果。图3显示通过连接反应将MMCR候选基因插入至载体中的结果。图4显示培养用MMCR候选基因转染的菌株并分析培养的菌株中每种酶的表达水平的结果。图5显示测量使用甲基丙二酰-CoA作为反应底物的MMCR候选基因的滴度的结果。图6显示使用甲基丙二酰-CoA作为反应底物获得的反应产物的MS分析结果。图7显示通过HPLC分析3-HIBA-生产菌株的培养物以确定3-HIBA生产的结果。具体实施方式除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，以下将描述的本文使用的命名法和试验方法是本领域已知的且通常采用的。一个方面，本发明涉及源自具有从碳源生产丁二酰-CoA能力的微生物的突变微生物，其中该突变微生物含有编码以下酶的基因，并具有生产3-HIBA(3-羟基异丁酸)的能力：(i)甲基丙二酰-CoA变位酶；(ii)甲基丙二酰-CoA差向异构酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(MMCR)；以及(iv)3-羟基异丁酸脱氢酶，其中(iii)的酶为展示出甲基丙二酰-CoA还原酶(MMCR)活性的酶，选自具有丙二酰-CoA还原酶(MCR)活性的酶。本发明中，不特别限制(iii)的酶，只要其展示出甲基丙二酰-CoA还原酶活性即可。例如，(iii)的酶可为使甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛的单功能酶，或为使甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛并且参与使甲基丙二酸半醛转化为3-HIBA过程的双功能酶。优选地，(iii)的酶可为单功能酶。这些酶中，甲基丙二酰-CoA变位酶(i)参与从碳源生产的丁二酰-CoA向(R)-甲基丙二酰-CoA的转化，甲基丙二酰-CoA差向异构酶(ii)参与(R)-甲基丙二酰-CoA向(S)-甲基丙二酰-CoA的转化。此外，甲基丙二酰-CoA还原酶(iii)参与(S)-甲基丙二酰-CoA向甲基丙二酸半醛的转化，3-羟基异丁酸脱氢酶(iv)参与甲基丙二酸半醛向3-HIBA的转化。合成3-HIBA的特定途径如图1所示。术语“3-HIBA(3-羟基异丁酸)”意为C4-羧酸，可包含酸形式(3-羟基异丁酸)、碱形式(3-羟基异丁酸盐)，或其混合形式。术语3-HIBA可包含(R)立体结构和(S)立体结构。3-HIBA可用作生产MAA(甲基丙烯酸)和/或MMA(甲基丙烯酸甲基酯)的中间体，但不限于此。因为天然不存在甲基丙二酰-CoA还原酶，其是将甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛的酶，所以在从碳源(包括葡萄糖)生产3-HIBA的常规方法中不可避免地要绕过甲基丙二酰-CoA还原酶的代谢过程。也就是说，在常规方法中，通过中间体例如异丁酸或2-甲基-1,3-丙二醇来生物合成3-HIBA(KarstenLang,KatjaBuehlerandAndreasSchmid,MultistepSynthesisof(S)-3-HydroxyisobutyricacidfromglucoseusingPseudomonastaiwanensisVLB120B83T7catalyticbiofilms,AdvancedSynthesis&Catalysis,357(8),1919-1927(2015))。然而，本发明人已经从MCR酶中确定了使甲基丙二酰-CoA直接转化为甲基丙二酸半醛的酶，即具有甲基丙二酰-CoA还原酶(MMCR)活性的酶。使用该确定的酶能够通过短的代谢途径生产3-HIBA。这里，所鉴定出的酶可以为源自古生菌界的甲基丙二酰-CoA还原酶。本发明人已经从丙二酰-CoA还原酶(MCR)酶类中筛选了各种酶，所述丙二酰-CoA还原酶(MCR)使用与MMCR的底物不同的底物，但功能上与MMCR相似。从这些筛选出的酶中，选择出还可以用甲基丙二酰-CoA作为底物的酶。此外，通过吸光度测量与甲基丙二酰-CoA反应之后的用作辅酶因子的NADH和NADPH的量的变化，并选择出与甲基丙二酰-CoA反应的酶。结果是，在实施方案中，与用作反应底物的甲基丙二酰-CoA反应的酶可以是例如甲基丙二酰-CoA还原酶，其源自选自CandidatusCaldiarchaeumsubterraneum、SulfolobalesarchaeonAcd1和嗜酸热硫化叶菌Ron12/I(SulfolobusacidocaldariusRon12/I)中的一种或多种古生菌物种。本发明中，对与用作反应底物的甲基丙二酰-CoA反应的酶进行测序。结果发现该酶包含与SEQIDNO:23的序列至少60％同源或至少80％相似的序列。基于该结果，在一个实施方案中，该酶可包含与SEQIDNO:23表示的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性的序列。在另一个实施方案中，该酶可包含与SEQIDNO:23表示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列相似性的序列。如本文所用，术语“同源性”是指用于比较的两个氨基酸或多核苷酸部分(moiety)之间的同一性百分比(percentidentity)。术语“相似性”是指如通过比较窗口(comparisonwindow)确定的，两条氨基酸序列或多核苷酸序列在功能上或结构上彼此相同的程度。可通过使用标准软件，例如，用基于BLAST研发的称为BLASTN或BLASTX的程序来比较序列，从而确定序列同源性或相似性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873-5877,1993)。甲基丙二酰-CoA还原酶可包含与选自SEQIDNO:3-SEQIDNO:5中任一个表示的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％，优选地，至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性的序列。在一些情况中，为了增加生产3-HIBA的效率，还可使用本领域已知的技术来突变本发明的甲基丙二酰-CoA还原酶。在另一方面，本发明涉及具有生产甲基丙烯酸甲基酯能力的突变微生物，除了上述基因(i)-(iv)之外，其还含有(v)编码3-羟基异丁酸脱氢酶的基因。该3-羟基异丁酸脱氢酶为参与将3-HIBA转化为甲基丙烯酸甲基酯的酶。除了本发明使用的酶甲基丙二酰-CoA还原酶之外，编码甲基丙二酰-CoA变位酶、甲基丙烯酸-CoA差向异构酶和3-羟基异丁酸脱氢酶的基因的来源和序列示于下表1中。表1：参与向3-HIBA转化的酶候选者如本文所用，术语“微生物”可包含古生菌域、细菌域或真核生物域中包含的任何有机体，并可包含任意种类的原核生物或真核生物，例如，古生菌、细菌、酵母菌或真菌。例如，本发明使用的微生物可以为大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、C.blankii或皱褶念珠菌(C.rugosa)。编码该酶的基因是外源的。术语“外源的”意为将编码源自古生菌的MMCR(甲基丙二酰-CoA还原酶)的基因引入宿主微生物中。可通过将编码MMCR的基因插入到材料例如质粒中而将其引入至宿主微生物的遗传物质即染色体或非染色体遗传物质中来实现该引入。可用于本发明的碳源的实例包括碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，脂肪例如大豆油、普通葵花油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类例如丙三醇和乙醇，以及有机酸例如乙酸。可单独或组合使用这些碳源。在另一个方面，本发明涉及生产3-HIBA的方法，其包括培养上述突变微生物的步骤。此外，本发明涉及生产甲基丙烯酸甲基酯的方法，其包括培养上述突变微生物的步骤。可根据已知方法，在20-45℃的温度和碳源的存在下培养该突变微生物。作为在培养中使用的碳源，可单独或组合使用以下碳源：(i)碳水化合物，包括单糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉或纤维素；(ii)油类或脂肪类，例如大豆油、普通葵花油、花生油或椰子油；(iii)脂肪酸，例如，棕榈酸、硬脂酸或亚油酸；(iv)醇类，例如丙三醇或甲醇；(v)氨基酸，例如，L-谷氨酸或L-缬氨酸；以及(vi)有机酸，例如乙酸。在一些情况中，培养基可包括已知的氮源、磷源、生长所需要的金属盐、前体或pH调节剂。可分离并回收通过培养突变微生物而表达的3-HIBA或甲基丙烯酸甲基酯。例如，可通过使培养基通过过滤器或使用离心机或沉降装置从培养基中分离表达的3-HIBA或甲基丙烯酸甲基酯。此外，可另外使用渗透法或提纯法回收纯的3-HIBA或甲基丙烯酸甲基酯。实施例以下，将参考实施例更详细地描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅是说明的目的，不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等效物来限定。实施例1：筛选MMCR使用Uniprot，从使用的底物与MMCR的底物不同但功能上与MMCR相似的MCR(丙二酰-CoA还原酶)酶类中筛选各种酶，因为它们可以使丙二酰-CoA转化为丙二酸半醛。在筛选的酶中，选择还可使用甲基丙二酰-CoA作为底物的酶，检测酶的产物从而筛选MMCR(甲基丙二酰-CoA还原酶)。作为MMCR候选者，通过BLAST搜索具有已知结构的源自超嗜热古菌(Sulfolobustokodaii)的MCR酶来选择具有相似蛋白质序列的酶。根据上述程序，使用Uniprot进行酶的选择，结果是，得到具有MMCR活性的两种MCR酶和四种天冬氨酸-半醛脱氢酶(表2)。表2：MMCR候选者通过PCR，使用下表3所示的合成的引物在以下条件下克隆上表2所示的MMCR候选基因：30个循环，每个循环为98℃下10秒，55℃下5秒和72℃下1分钟。PCR的结果如图2所示。接着，使用T4DNA连接酶将每个PCR产物插入pET21b载体中(图3)。如图3所示，得到了所期望的构建体。将该构建体转染至表达菌株大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，从而构建菌株。表3：引物序列基因引物序列SEQIDNO:MCRstFATGAGCTCATGAGAAGAACTTTGAAA11MCRstRTTCTCGAGTTACTTTTCGATGTAACC12MCRmsFATGAGCTCATGAGAAGAACTTTGAAA13MCRmsRTTCTCGAGTTATCTCTTATCAATGTA14ASDccFATGAGCTCATGAAAACTTACTCCGTC15ASDccRTTCTCGAGTCATTCGCCTAACAACCA16ASDsarFATGAGCTCATGAGAAGAACTTTGAAG17ASDsarRTTCTCGAGTTACTTAGGGATGTAACC18ASDsac1FATGACGTCATGATAAGAGTCTTGAAA19ASDsac1RTTCTCGAGTCAATCCATGTAACCCTT20ASDsac2FATGAGTCATGAGAAGAGTTTACAAA21ASDsac2RTTCTCGAGTCAGATGTACTTTCTGTT22在37℃和200rpm下，在LBA培养基中培养每种构建的菌株(转化株)。当600nm处的OD值达到0.5-0.8时，向培养基中添加1mM的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，然后在16℃下将每种菌株培养过夜，从而表达如上表2所示的每一种MMCR酶。表达的结果示于图4中。将每个培养的菌株离心以除去上清液，然后收集细胞并通过超音波样品震碎机进行细胞破裂，然后离心收集上清液，从而制备酶溶液。使用皮尔斯(Pierce)BCA试剂盒，通过在37℃下进行彩色显影30分钟，然后使用微孔板分光光度计测量562nm处的吸光度来定量分析每种酶溶液中酶的浓度。分析的结果示于下表4中。表4：培养的转染细胞中蛋白质浓度的定量分析结果样品A562浓度(μg/ml)稀释因子(×5)Pet21b0.659573.6742868.37ASDcc0.636548.6962743.48MCRms0.682598.6522993.26ASDsar0.742663.8123319.06ASDsac10.741662.7263313.63ASDsac20.699617.1143085.57MCRst0.718637.7483188.74使每一个获得的酶溶液与作为底物的甲基丙二酰-CoA在含有如下表5所示的组分的培养基中反应，然后使用微孔板分光光度计通过测量365nm处的吸光度来分析作为辅酶因子的NADH和NADPH的量的变化，从而确定酶是否会与甲基丙二酰-CoA反应。表5试剂储备液浓度工作浓度体积(μl)Tris-HCL(Ph7)100mM50mM100NAD(P)H4mM0.4mM20MgCl210mM2mM40细胞提取物2×稀释20甲基丙二酰-CoA3.0mM*0.3mM20计算NADH和NADPH的消耗量与使用的蛋白质的量的比率作为活性。结果是，可以看出，当使用NADH作为辅酶因子时，ASDcc、ASDsar和ASDsac1显示出与甲基丙二酰-CoA的反应性(图5)。实施例2：生产甲基丙二酸半醛为了检测在最初选择的酶中显示出最好性能的ASDsac1的甲基丙二酸半醛的生产力，使ASDsac1与0.5g/L甲基丙二酰-CoA反应，通过MS分析反应产物。结果如图6所示，ASDsac1的反应产物显示产生了甲基丙二酸半醛。实施例3：生产3-HIBA的大肠杆菌菌株的构建使用密码子优化工具优化经证实能生产甲基丙二酸半醛的ASDsac1(http://sg.idtdna.com/CodonOpt)，以便优化其在大肠杆菌中的表达，并将其用于构建如图1所示的生产3-HIBA的大肠杆菌菌株(见表6)。通过PCR使用如下表7所示的引物在以下条件下克隆如下表6所示的大肠杆菌3-HIBA-生产途径(3-HIBA-producingpathway)基因：30个循环，每个循环为98℃下10秒，55℃下5秒和72℃下1分钟。使用T4DNA连接酶将每个PCR产物插入至pET21b和pET26b载体中。确认构建成所需的构建之后，将每个构建体转染至表达菌株大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，从而构建菌株。表6：设计含有ASDsac1基因、生产3-HIBA的大肠杆菌菌株表7：用于克隆大肠杆菌的3-HIBA生产途径基因的引物实施例4：大肠杆菌中3-HIBA的生产和发酵对于实施例3中构建的重组大肠杆菌菌株的培养，将30ml2×M9(Na2HPO4-2H2O、KH2PO4、NaCl、NH4Cl)基本培养基放入250ml烧瓶中，向其中加入600μl的100×痕量金属溶液(5g/lEDTA、0.83g/lFeCl3-6H2O、84mg/lZnCl2,、13mg/lCuCl2-2H2O、10mg/lCoCl2-2H2O、10mg/lH3BO3、1.6mg/lMnCl2-4H2O)、60μg/l的维生素12、1mg/ml的生物素、1mg/ml的硫胺、0.25g/L的MgSO4、50μg/ml的卡那霉素和100μg/ml的氨苄青霉素。接着，在细菌培养器中在37℃下在培养基中培养每种菌株，当光密度(OD)达到0.8时，通过0.1mMIPTG诱导3-HIBA-生产基因的表达。加入IPTG后，将培养温度调节至30℃，向培养基中进一步加入5g/L的丁二酸钠作为生产3-HIBA的底物，然后在200rpm下再培养72小时。培养72小时之后，收集一部分培养产物以测量光密度(OD)和3-HIBA的生产。实施例5：分析3-HIBA将实施例4中培养72小时获得的培养产物离心(4℃和13,000rpm下10分钟)以除去细胞。使用冷冻干燥机(ilShinBioBase，韩国)通过冷冻干燥法干燥40ml的无细胞上清液样品124小时，然后溶解于2ml的蒸馏水中，从而制备3ml的约13倍浓缩的HPLC样品。使用具有10升进样量的Agilent1200HPLC系统(Agilent，美国)分析样品。HPLC中，将Hypercarb色谱柱(150mm×4.6mm)(Thermo，美国)保持在30℃，DIW(0.1％硫酸)和CAN(0.1％硫酸)用作流动相，流速为1ml/min。此外，使用DAD检测器(Agilent美国)分析。如图7所示，分析结果表明，当实施例3中构建的菌株2和菌株3培养72小时并浓缩13倍时，3-HIBA的生产量为69ppm和21ppm。虽然参考具体特征详细地描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，该描述仅是优选的实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求书及其等效物进行限定。当前第1页1 2 3