本发明涉及微生物应用
技术领域：
，具体而言，涉及一种防控金桔，沙甜桔，柑橘黄龙病的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术：
：柑橘（包含金桔，沙甜桔，普通柑橘）是世界产量最多的水果，在我国已经有4000多年的栽培历史。2009年我国柑橘栽培面积和产量均超过巴西、美国，位居世界首位，但在柑橘产业迅速发展的同时，黄龙病已成为柑橘生产上危害最为严重的毁灭性病害。早在18世纪中叶，印度就有相关报道。Reinking于19世纪20年代对我国华南地区进行首次报道，半个多世纪以来，柑橘黄龙病严重制约了广东、广西、福建3省区柑橘产业的发展。20世纪70年代末，四川省西昌地区和渡口市、江西赣州地区以及云南省得部分地区也先后发现柑橘黄龙病，到20世纪80年代中期，柑橘黄龙病已在我国广东、广西、福建、海南和台湾的柑橘产区广泛蔓延，并在浙江、贵州、湖南相继发生，我国柑橘栽培的19个省、区已有11个遭受危害，受害面积占柑橘总栽培面积的80%以上，产量占总产量的85%左右。2004年巴西圣保罗州和2005年美国佛罗里达州黄龙病相继发生，造成柑橘从业者的恐慌。迄今，黄龙病已广泛分布于亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多个国家。黄龙病又名黄梢病、黄枯病、青果病，是柑橘的重要病害，为国际、国内检疫对象。我国的17个柑橘产区中有11个产区收到黄龙病的胁迫，且作为柑橘主要产区的广东、广西、福建、云南、海南等地尤为严重。发病柑橘植株的典型症状是“黄梢”、叶片斑驳黄化、果实变小、形成无价值的“青果”或“红鼻子果”，发病后期根系坏死，树势衰退，导致落叶、落果、植株死亡等。当病害严重流行时，往往使大片橘园在几年内全部毁灭，对柑橘生产威胁极大。黄龙病的病原是寄生于韧皮部的革兰氏阴性细菌，能够在树皮组织、叶、花、根和果实中检测到。革兰氏阴性细菌传播途径广，非常难以被杀死。果树一旦感染这一病菌，为了避免其他果树被感染，控制黄龙病的传播和蔓延，人们只能挖除或砍除病树，损失巨大。因此，在果树的日常管理中，做好柑橘黄龙病的防控工作成为重中之重。目前，针对柑橘黄龙病的防控手段主要是有两方面：一是从根源上切断病菌的输入，主要是在苗木上把关，加强苗木繁育管理，及时排除病苗，选用无病苗木种植和接穗。二从切断病菌的传播媒介，主要采用化学、物理的方法防治木虱。可见，现有技术中对于柑橘黄龙病的传播媒介关注的比较少，主要还是在防治木虱上，而未见对其它传播媒介的防控手段。侯期任等在专利号2015104457788中公开了一种防控柑橘黄龙病的微生物肥料及其制备方法。所提供的微生物肥料包括以下组分：淡紫拟青霉、地衣芽胞杆菌、木霉菌和有机质;所述微生物肥料中，所述淡紫拟青霉的活菌含量不低于0.2亿/克，所述地衣芽抱杆菌的活菌含量不低于0.1亿/克，所述木霉菌的活菌含量不低于0.05亿/克。本发明中，淡紫拟青霉、地衣芽抱杆菌、木霉菌三种菌种共同作用，抑制或破坏线虫卵的发育过程，从而减少线虫成虫率，减少果园线虫基础发生量，切断黄龙病的传播媒介，达到防控柑橘黄龙病的作用。主要还是一种生物有机菌肥，菌体含量低，用量大，使用不方便。梁小文等在专利2016100006863中公开了一种微生物复合菌及其制备方法和其在防治柑橘黄龙病方面的应用。所述的微生物复合菌，包括克里本类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，所述克里本类芽孢杆菌的生物保藏编号为CGMCCN0.7996，微生物复合菌具体的可为微生物复合菌液或微生物复合菌剂，可以抑制病原菌，但没有杀虫的功能，无法切断黄龙病的传播媒介，达到防控柑橘黄龙病的作用。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种既能能杀虫又能抑菌，还具有根迹促生作用的防治金桔黄龙病的微生物菌剂。该微生物菌剂的原料配比为：古腊科链霉菌发酵液10-30份，卡伍尔链霉菌发酵液20-40份，冷解糖芽孢杆菌发酵液10-30份，尼氏芽孢杆菌发酵液10-30份，毛簇木霉发酵液10-30份。在所述微生物菌剂中，古腊科链霉菌，卡伍尔链霉菌，冷解糖芽孢杆菌，尼氏芽孢杆菌和毛簇木霉五种菌是从500多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能产生多种抑制木虱和其它传病昆虫（如橘蚜）虫卵的发育过程的抗生素如卡伍尔链霉菌产生黄质霉素，一种杀虫的抗生素，从而减少其成虫率，减少果园害虫基础发生量，切断黄龙病的传播媒介，达到防控柑橘黄龙病的作用；另一方面，能产生多种拮抗革兰氏阴性细菌的抗菌素如古腊科链霉菌产生古腊霉素，一种抗革兰氏阴性细菌的抗菌素，能较好的抑制住黄龙病的病原菌。本发明的第二目的在于提供一种所述的微生物防治金桔黄龙病的微生物菌剂的制备方法，该方法步骤简单，确保微生物菌剂的药效突出。另外，所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种防治金桔黄龙病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：古腊科链霉菌发酵液的制备取出古腊科链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为古腊科链霉菌种子液；发酵：将上述制备的古腊科链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的古腊科链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到古腊科链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的古腊科链霉菌发酵培养基：豆粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜2%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二：卡伍尔链霉菌发酵液的制备取出卡伍尔链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为卡伍尔链霉菌种子液；发酵：将上述制备的卡伍尔链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的卡伍尔链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到卡伍尔链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的卡伍尔链霉菌发酵培养基：豆粕3%，棉粕1%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，冷解糖芽孢杆菌发酵液的制备取出冷解糖芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L冷解糖芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为冷解糖芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述冷解糖芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米淀粉30g/L，豆粕粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，尼氏芽孢杆菌发酵液的制备取出尼氏芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L尼氏芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min，24小时后通气量为300L/min，30℃培养32-48小时，待总芽孢含量不低于30亿cfu/ml，即可作为尼氏芽孢杆菌发酵液；其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；其中，所述尼氏芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，棉粕粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，碳酸钙10g/L，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五，毛簇木霉发酵液的制备取出毛簇木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为毛簇木霉种子液；发酵：将上述制备的毛簇木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L毛簇木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到100g/L，即可停罐，即可作为毛簇木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的毛簇木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六，混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按古腊科链霉菌发酵液10-30份，卡伍尔链霉菌发酵液20-40份，冷解糖芽孢杆菌发酵液10-30份，尼氏芽孢杆菌发酵液10-30份，毛簇木霉发酵液10-30份混匀，即得到防治金桔黄龙病的微生物菌剂。其中，该微生物菌剂在防治金桔黄龙病的方法为叶面喷施1-2L/亩，叶面喷施的稀释的倍数为100-200倍，同时灌根，用量为50-200ml/棵果树；灌根的稀释倍数为100-500倍；本发明中含有冷解糖芽孢杆菌与尼氏芽孢杆菌，芽孢杆菌是一种较理想的生物肥料添加菌株，具有抗逆性强、营养简单、繁殖速度快，有效活菌数量高、性能稳定，储存期长等优势而成为近年来的研究热点。此外，多数菌种具有防病、促生、解磷、解钾、固氮作用，对于发展生态农业，具有重要的现实意义。本发明中含有的冷解糖芽孢杆菌，冷解糖芽孢杆菌可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时必定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长和抑制病菌等综合功能。冷解糖芽孢杆菌能够防治植物病害源于其能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长。冷解糖芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质。脂肽类抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin)，其中伊枯草菌素和泛革素具有很强的抗真菌活性，而表面活性素对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性；长期以来，根瘤菌和自生固氮菌等虽具有较强的固氮能力，但抗逆性低，不耐贮存，不利于我国生物固氮菌肥的商品化和推广使用。自1958年Hin首次在日本分离得到一株具有高固氮活性的芽抱杆菌后，土壤中新发现的具有固氮作用的芽抱杆菌越来越多。具有固氮作用的芽孢杆菌添加到生物肥料中，可使生物肥料耐酸、耐盐、耐高温和耐高压，为生物固氮肥料的研发、推广和应用将起着重要作用。目前国际上认为需氧芽抱杆菌的固氮能力较高为固氮芽抱杆菌，本发明中的尼氏芽孢杆菌具有较强的固氮作用，并且具有明显的根迹促生作用。本发明中含有毛簇木霉，毛簇木霉在重寄生过程中产生了一系列病原菌菌丝细胞壁的水解酶。木霉菌在侵入或穿透寄主菌丝细胞时，产生了几丁质酶(chitinases)、葡聚糖酶、纤维素酶(cellulases)、木聚糖酶(xylanaes)以及蛋白酶((proteinases)、脂酶等一系列水解酶类，来消解病原菌的细胞壁。它们大都由多糖和真菌细胞壁诱导，并受代谢降解物，如高浓度葡萄糖的阻遏。在这些细胞壁降解酶中，几丁质酶和葡聚糖酶被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子，并具有协同作用。几丁质酶包括内切酶和外切酶两类，其中外切酶为N一乙酰氨基葡萄糖普酶(N-acetylglucosaminidase)和几丁二糖酶(chitobiosidase)。这两类酶对植物病原真菌的细胞壁有强烈的水解作用，从而抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝以及抱子的消解，而且这两类酶之间具有协同作用，同时也具有与杀菌剂及细菌等生防因子协同作用的功效。许多木霉菌株产生挥发性或非挥发性的抗菌素类物质，如木霉素(trichoderlnin)、胶霉素(gliotoxin)、绿木霉素(viridin)、抗菌肽((peptideantibiotic)等。毛簇木霉可产生的多种抗生物质，这些物质包括抗生素和一些酶类。这些抗生物质的化学性质各不相同，包括了戊酮、辛酮、类菇、多肽和氨基酸衍生物等几大类。这些代谢物可以破坏菌丝细胞壁，使细胞内物质外渗，引起立枯丝核菌菌丝的原生质凝聚，菌丝断裂解体，对病原菌菌落有不同程度的抑制作用，由于抗生物质的种类，化学性质以及作用方式的差异，病原菌往往难以发展抗药性。链霉菌是产生抗生素的主要微生物来源。链霉菌的抗生作用体现在次级代谢产物即抗生素对病原菌直接的抑制和致死作用。抗生素对病原菌细胞和大分子物质合成的影响表现在抑制蛋白质、核酸和质膜的合成，或者干扰病原菌的代谢系统，从而抑制其生长。对于抗生素作用于蛋白质合成系统的研究较多，本发明中的古腊科链霉菌，能产生古腊霉素，一种抗革兰氏阴性细菌和抗病毒的抗菌素；能有超强抑制黄龙病病原菌的功效；本发明中的卡伍尔链霉菌，显示轻度抗细菌的活性，产生黄质霉素，一种抗革兰氏阴性细菌和杀虫的抗生素；能抑制或破坏木虱和其它传病昆虫（如橘蚜）虫卵的发育过程，有效杀灭木虱等害虫。本发明具有的优点和有益效果：本发明中防治金桔黄龙病的微生物菌剂中含有古腊科链霉菌，卡伍尔链霉菌，冷解糖芽孢杆菌，尼氏芽孢杆菌和毛簇木霉，五种菌种可通过竞争作用、重寄生作用、抗生作用、溶菌作用、毒性蛋白和诱导抗性等对植物病原菌进行拮抗，从而杀灭或减少病原菌，起到防病的效果；另外，其生防机制中可能还包括:(1)在逆境中，如干早、养分的胁迫下，通过加强根系和植株的发育提高耐性。(2)可诱导植物对病菌的抗性。(3)增加土壤中营养成分的溶解性，并促进其吸收。(4)使病原菌的酶钝化。因此，多菌种混合生防机制的复合性更增加了其生防应用效果；如古腊科链霉菌能产生古腊霉素，一种抗革兰氏阴性细菌和抗病毒的抗菌素；卡伍尔链霉菌，显示轻度抗细菌的活性，产生黄质霉素，一种抗革兰氏阴性细菌和杀虫的抗生素；一方面产生抑制或破坏木虱和其它传病昆虫（如橘蚜）虫卵的发育过程，从而减少其成虫率，减少果园害虫基础发生量，切断黄龙病的传播媒介，达到防控柑橘黄龙病的作用。另一方面，所筛选的古腊科链霉菌，卡伍尔链霉菌，冷解糖芽孢杆菌，尼氏芽孢杆菌和毛簇木霉五种菌种都能产生抑制革兰氏阴性细菌的抗菌素，能较好的抑制住黄龙病的病原菌，从而直接作用于黄龙病病原菌，达至防治黄龙病的效果；并且，本发明的古腊科链霉菌，卡伍尔链霉菌，冷解糖芽孢杆菌，尼氏芽孢杆菌和毛簇木霉五种菌种组合，是从500多种有益菌中，经过仔细筛选得到的，他们能共生共存，混合在一起可互相增强防病促生效果的菌种组合。具体实施方式实施例1一种防治金桔黄龙病的微生物菌剂，该微生物菌剂的原料配比为：古腊科链霉菌发酵液20份，卡伍尔链霉菌发酵液30份，冷解糖芽孢杆菌发酵液20份，尼氏芽孢杆菌发酵液20份，毛簇木霉发酵液20份；为了达到上述目的，一种防治金桔黄龙病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：古腊科链霉菌发酵液的制备取出古腊科链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为古腊科链霉菌种子液；发酵：将上述制备的古腊科链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的古腊科链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养42小时，检测菌体含量达到65g/L，停罐，即得到古腊科链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5，硫酸镁：0﹒5，氯化钠：0﹒5，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的古腊科链霉菌发酵培养基：豆粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜2%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二：卡伍尔链霉菌发酵液的制备取出卡伍尔链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为卡伍尔链霉菌种子液；发酵：将上述制备的卡伍尔链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的卡伍尔链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养44小时，检测菌体含量为82g/L，停罐，即得到卡伍尔链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的卡伍尔链霉菌发酵培养基：豆粕3%，棉粕1%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，冷解糖芽孢杆菌发酵液的制备取出冷解糖芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L冷解糖芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养30小时，检测总芽孢含量为65亿cfu/ml，即作为冷解糖芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述冷解糖芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米淀粉30g/L，豆粕粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，尼氏芽孢杆菌发酵液的制备取出尼氏芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L尼氏芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min，24小时后通气量为300L/min，30℃培养38小时，检测总芽孢含量为31亿cfu/ml，即作为尼氏芽孢杆菌发酵液；其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；其中，所述尼氏芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，棉粕粉40g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，碳酸钙10g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五，毛簇木霉发酵液的制备取出毛簇木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为毛簇木霉种子液；发酵：将上述制备的毛簇木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L毛簇木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养39小时，检测菌体含量为110g/L，停罐，即可作为毛簇木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的毛簇木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六，混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按古腊科链霉菌发酵液20份，卡伍尔链霉菌发酵液30份，冷解糖芽孢杆菌发酵液20份，尼氏芽孢杆菌发酵液20份，毛簇木霉发酵液20份混匀，即得到防治金桔黄龙病的微生物菌剂。实施例2本发明所述的微生物复合菌对金桔黄龙病的防治效果检测，试验于2015年3月1日至2016年3月1日在广东省江门市新会区某果业基地进行，试验区域黄龙病发病较重，发病率基本上达到了65%；采用灌根和叶面喷雾的方式进行。分为两组处理，试验组：100棵树，灌根l00ml/株，叶面喷施2L/亩，都稀释100倍处理；对照组：100棵树，20%好年冬乳油（丁硫克百威）1500-2000倍，高效氯氰菊脂800-1000倍；采果后选药用99%矿物油（绿颖）150-200倍+48%毒死蜱1500倍；每个月至少使用一次；试验结果：防治效果见表1，试验组的黄龙病发病率明显低于常规处理，由常规处理52.9%的发病率降低至15.2%，与常规处理相比发病率最高降低了71.3%，具有显著的防治黄龙病的效果。如表1所述增产效果也比较明显，产量由常规处理的1782公斤增加到2510公斤，试验组的产量较常规处理最高增加728公斤，增产率高达40.85%，具有显著的增产效果。表1微生物菌剂对黄龙病的防治与增产效果组别发病率(%)防效（%）产量（kg）增产率（%）试验组15.271.3251040.85对照组52.91782以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3