本发明涉及特异腐质霉(Humicolainsolens)的遗传转化方法，进一步涉及根瘤农杆菌介导的特异腐质霉遗传转化方法，属于特异腐质霉的遗传转化领域。
背景技术：
：：腐质霉属是真菌门、半知菌亚门、丛梗孢目、丛梗孢科的一个属。是常见的土壤习居菌，腐生性较强，能在土壤中长期存活。形态特征：分生孢子梗短，常单生，极少数分生孢子梗具有短的分枝，分生孢子梗呈暗色。分生孢子(粉孢子)，单生，顶生，球形或亚球形，棕色，单细胞。腐质霉属主要包括以下几个种，灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、棕黑腐质霉属(Humicolafuscoatra)和黑腐质霉(Humicolanigrescens)。其中研究的最多的是特异腐质霉。特异腐质霉所产纤维素酶，在一些生物化学性质上，不同于木霉、曲霉和青霉等菌所产的纤维素酶和半纤维素酶，具有偏中性的pH特性，最适pH在6.0左右，且具有较好的热稳定性，这一点对于应用领域尤为重要，使其具有非常广的应用范围和好的应用潜力(SchuleinM(1997)EnzymaticpropertiesofcellulasesfromHumicolainsolens.Journalofbiotechnology57(1-3):71-81；ShiP,DuY,YangH,HuangH,ZhangX,WangY,YaoB(2015)Molecularcharacterizationofanewalkaline-tolerantxylanasefromHumicolainsolensY1.BiomedResInt2015:149504doi:10.1155/2015/149504；XiaW,ShiP,XuX,QianL,CuiY,XiaM,YaoB(2015)Highlevelexpressionofanovelfamily3neutralbeta-xylosidasefromHumicolainsolensY1withhightolerancetoD-xylose.PloSone10(2):e0117578doi:10.1371/journal.pone.0117578；XuX,LiJ,ZhangW,HuangH,ShiP,LuoH,LiuB,ZhangY,ZhangZ,FanY,YaoB(2015)ANeutralThermostablebeta-1,4-GlucanasefromHumicolainsolensY1withPotentialforApplicationsinVariousIndustries.PloSone10(4):e0124925doi:10.1371/journal.pone.0124925)。在国际上，特异腐质霉因其在生物质能源开发、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域的良好应用前景而受到广泛关注(KogaJ,BabaY,ShimonakaA,NishimuraT,HanamuraS,KonoT(2008)Purificationandcharacterizationofanewfamily45endoglucanase,STCE1,fromStaphylotrichumcoccosporumanditsoverproductioninHumicolainsolens.Appliedandenvironmentalmicrobiology74(13):4210-7doi:10.1128/aem.02747-07；MatsumotoH,KoganeiK,NishidaN,KoyamaY,SaitoS,KataokaH,OgiharaJ,KasumiT(2013)CelldispersionculturefortheeffectivegrowthofHumicolainsolensandefficientenzymeproduction.Journalofbioscienceandbioengineeringdoi:10.1016/j.jbiosc.2013.08.014；MuhammadmohsinJavedI-U-H,IrfanaMariyam(2011)Multistepmutagenesisfortheover-expressionofcellulaseinHumicolainsolens.PakJBot43(1):669-677)。根瘤农杆菌介导转化(ATMT)是应用最为广泛的丝状真菌转化方法之一，目前利用该方法已成功实现对100多种真菌的遗传转化。与传统的遗传转化方法(如原生质体转化、醋酸锂转化、电击转化法及限制酶介导转化)相比，农杆菌介导遗传转化具有不可比拟的优势：第一，受体材料范围广。ATMT的初始材料除原生质体外，还可以是孢子、菌丝体和子实体组织等，避免了传统遗传转化方法制备原生质体繁琐复杂的过程，使得操作过程简单易行(CovertSF,KapoorP,LeeMH,BrileyA,NairnCJ(2001)Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofFusariumcircinatum.MycologicalResearch105:259-264doi:10.1017/s0953756201003872；GoukaRJ,GerkC,HooykaasPJJ,BundockP,MustersW,VerripsCT,deGrootMJA(1999)TransformationofAspergillusawamoribyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedhomologousrecombination.NatureBiotechnology17(6):598-601doi:10.1038/9915；MikoschTSP,LavrijssenB,SonnenbergASM,VanGriensvenL(2000)AgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationofAgaricusbisporus)；第二，转化效率高。研究表明农杆菌介导丝状真菌的转化效率一般为300～7200个转化子每107个孢子，是其他遗传转化方法的100～1000倍(deGrootMJA,BundockP,HooykaasPJJ,BeijersbergenAGM(1998)Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi.NatureBiotechnology16(9):839-842doi:10.1038/nbt0998-839)；第三，转化子能够稳定遗传。ATMT法可以选择多种受体作为初始材料，因此选择单核的分生孢子作为初始材料可以获得后代不分离的转化子，表现出良好的稳定遗传性，解决了真菌菌丝多核造成的转化子不稳定的难题(彭振兴,马文慧,柯丽霞安,中国农业大学观赏园艺与园林系(2010)农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用.科技信息(16):479％@1001-9960％L37-1021/N％U)；第四，T-DNA多为单拷贝插入。对于缺少有性生殖阶段的真菌，单拷贝插入有利于目的基因的分离和克隆(KemppainenM,DuplessisS,MartinF,PardoAG(2008)T-DNAinsertion,plasmidrescueandintegrationanalysisinthemodelmycorrhizalfungusLaccariabicolor.Microbialbiotechnology1(3):258-69doi:10.1111/j.1751-7915.2008.00029.x；MullinsED,ChenX,RomaineP,RainaR,GeiserDM,KangS(2001)Agrobacterium-mediatedtransformationofFusariumoxysporum:Anefficienttoolforinsertionalmutagenesisandgenetransfer.Phytopathology91(2):173-180doi:10.1094/phyto.2001.91.2.173)。因此，利用根瘤农杆菌介导的转化方法，实现特异腐质霉的高效遗传转化，使得在特异腐质霉中进行同源和异源基因表达成为可能，为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，优化纤维素降解酶系，提高其应用价值及产酶水平提供必要前提；还可为建立特异腐质霉的高效表达体系，最终实现异源基因的高效表达，提供了必要的技术保障；另外，还可以构建特异腐质霉的T-DNA随机插入突变体库，筛选得到酶活显著提高的高产菌株，为合理改造工业菌株提供了新的途径。技术实现要素：本发明的目的之一是提供根瘤农杆菌介导的特异腐质霉遗传转化方法。本发明的目的之二是提供一株纤维素酶高产突变株；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明首先提供了根瘤农杆菌介导的特异腐质霉遗传转化方法，包括以下步骤：(1)构建目的基因的表达质粒；(2)将表达质粒转化根瘤农杆菌感受态细胞，得到转入目的质粒的根瘤农杆菌并进行扩大培养得到根瘤农杆菌菌液；(3)将特异腐质霉涂布在平板上进行预萌发；(5)将根瘤农杆菌菌液与已萌发有菌丝的特异腐质霉进行共培养，再通过选择性培养，获得转化子。本发明为了选择转化子的筛选标记，开展了特异腐质霉的抗生素敏感性实验。结果表明，≥10μg/mL的潮霉素B，≥50μg/mL的G418以及≥10μg/mL的博来霉素可以完全抑制特异腐质霉的生长。因此，潮霉素B抗性基因(hph)，G418抗性基因(nptⅡ)和博来霉素抗性基因(bleR)均可作为特异腐质霉外源基因转化的筛选标记。所述根瘤农杆菌感受态细胞的制备包括：在LB液体培养基中培养根瘤农杆菌至OD600＝0.5，收集菌体，用含20％甘油的20mMCaCl2悬浮菌体，即得。所述根瘤农杆菌菌液的制备是将所述根瘤农杆菌菌液的制备是将已转入目的质粒的根瘤农杆菌接种到含抗生素的LB液体培养基中进行培养，转接至MM培养基中进行培养，用IM液体重悬菌体至OD600＝0.2，再在IM培养基中进行诱导培养，即得根瘤农杆菌菌液；优选的，所述的抗生素为卡那霉素和利福平。其中，所述根瘤农杆菌菌液OD600＝0.4-1.0，优选的OD600＝0.6。所述预萌发是在42℃条件下，预萌发0-30h；优选的在42℃条件下，预萌发24h。所述共培养的培养条件为：22℃-28℃温度下，暗培养2-5d；优选的，25℃暗培养2-3天；更优选的，25℃暗培养3天。所述选择性培养是将共培养物用无菌水清洗后，涂布于含有抗生素的PDA平板上，筛选疑似转化子。共培养的培养基或IM培养基中的诱导剂为乙酰丁香酮，优选的浓度为400μM。本发明以pAg1-neo作为出发质粒，在多种不同的转化条件下尝试进行了H.insolensY1的遗传转化。结果表明，在共培养时间为2-3d，诱导剂乙酰丁香酮的浓度为400μM，预萌发时间为24h，共培养温度为25℃，农杆菌浓度为OD600＝0.6时，可以获得最高的转化效率。本发明对上述方法获得的转化子进行验证，结果表明利用根瘤农杆菌介导的转化方法，成功地实现了外源DNA片段对H.insolensY1的遗传转化。本发明还成功的将绿色荧光蛋白编码基因egfp通过ATMT的方法转入到H.insolensY1中，通过用荧光显微镜观察绿色荧光的有无来直观说明ATMT在腐质霉转化中的可行性。结果显示，在蓝光激发下，转化子菌丝内呈现出较强的绿色荧光信号，这表明，绿色荧光蛋白基因确实转入H.insolensY1中，并能够正确表达。上述实验结果说明ATMT在腐质霉遗传转化体系中是可行的，且绿色荧光蛋白可以作为其报告基因使用。同时表明载体pAg1-hyg-P-T具有表达异源基因的潜力。本发明还提供了一种用于特异腐质霉的转化载体，包含筛选标记基因，还包含一个依次由3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列、新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子序列组成的完整表达框。本发明进一步提供了一种用于特异腐质霉转化的表达载体，包含筛选标记基因，还包含依次连接的两个表达框，其中，第一个表达框为完整表达框，依次由3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子序列、新霉素磷酸转移酶编码基因nptⅡ和3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的终止子序列组成；第二个表达框为不完整表达框，由3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子序列和3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的终止子序列组成，在3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子序列和3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的终止子序列之间有一个单酶切位点SmaI。本发明进一步提供了一种用于特异腐质霉转化的携带有报告基因的表达载体，包含筛选标记基因，还包含依次连接的两个表达框，其中，第一个表达框依次由3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子序列、新霉素磷酸转移酶编码基因nptⅡ和3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的终止子序列组成；第二个表达框依次由3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子序列、荧光蛋白编码基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的终止子序列组成。本发明所提供的上述表达载体可以应用于在特异腐质霉中表达同源或异源基因，或者是构建特异腐质霉插入突变体库中。其中，所述的筛选标记基因包括潮霉素B抗性基因(hph)，G418抗性基因(nptⅡ)或博来霉素抗性基因(bleR)。本发明利用所建立的农杆菌介导的特异腐质霉遗传转化方法并应用所构建的表达载体，成功的构建了一个小型的特异腐质霉的T-DNA随机插入突变体库，将这些突变株逐个编号(T1-T1000)，并对应点接于发酵培养基固体平板上培养，观察记录突变株的生长或形态分化特征。将具有显著表型变化的突变株(T4，T43，T49，T53,T82，T83)进行液体发酵实验，将发酵上清进行纤维素酶活的测定。最终发现一株突变株T4在发酵液体培养基中与野生型在生物量一致的情况下，其液体发酵上清的滤纸酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，纤维二糖水解、木聚糖酶活和葡萄糖苷酶的活性最高分别为野生型的1.6、4.4、3.2、1.8、1.4倍。T4纤维素酶活的提高可能是由于其在发酵条件下分泌更多的蛋白导致的。另外，从内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活结果可以看出，突变株T4明显高于突变株T43，T49，T53,T82，T83。因此最终得到了酶活显著提升的突变株T4，将其命名为Y1-T4，并提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12454；分类命名为：特异腐质霉Humicolainsolens。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年05月18日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明还提供了上述特异腐质霉突变株Y1-T4在降解纤维素和生产纤维素酶中的用途。本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：本研究利用根瘤农杆菌介导的转化方法，操作简单，转化率高且稳定，成功实现了特异腐质霉的高效遗传转化，使得在特异腐质霉中进行同源和异源基因表达成为可能，为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，优化纤维素降解酶系，提高其应用价值及产酶水平提供必要前提；另一方面还可为建立特异腐质霉的高效表达体系，最终实现异源基因的高效表达，提供了必要的技术保障。在此基础上，构建了特异腐质霉的T-DNA随机插入突变体库，从中筛选得到一株酶活显著提高的高产菌株，为合理改造工业菌株提供了新的途径。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语"遗传转化"意指通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的基因组中，并使之在受体细胞中得以表达。术语"转化子"意指导入外源DNA从而获得新的遗传性状的受体菌单菌落。附图说明图1为特异腐质霉转化载体pAg1-neo(A)，pAg1-hyg-P-T和pAg-egfp(B)构建示意图；图2为预萌发时间(A)、共培养时间(B)、As浓度(C)、农杆菌浓度(D)和共培养温度(E)对H.insolensY1转化效率的影响；图3为H.insolensY1转化子的验证；图4为转化有pAg-egfp的H.insolensY1转化子(gfp)的荧光观察图5为腐质霉野生型和突变株T4发酵过程中产滤纸酶活(A)、内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活(B)、纤维二糖水解酶酶活(C)、木聚糖酶酶活(D)、葡萄糖苷酶酶活(E)及蛋白分泌能力(F)的比较；图6为突变株与野生型特异腐质霉菌株的表型(A)与CMCase酶活(B)比较。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。1、试验材料1.1菌株及载体特异腐质霉从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心分发，其保藏号为：CGMCCNo.4573；根瘤农杆菌菌株AGL-1由中国农业科学院生物技术研究所王磊研究员惠赠；质粒pAg1-H3(ZhangA,LuP,Dahl-RoshakA,ParessP,KennedyS,TkaczJ,AnZ(2003)Efficientdisruptionofapolyketidesynthasegene(pks1)requiredformelaninsynthesisthroughAgrobacterium-mediatedtransformationofGlarealozoyensis.MolecularGeneticsandGenomics268(5):645-655)由中国科学院微生物研究所刘钢研究员惠赠；克隆载体pEASY-Blunt购自全式金生物技术有限公司。1.2酶类及其它生化试剂TaqDNA聚合酶购自Promega公司；限制性内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自NEB公司。对硝基苯纤维二糖苷(pNPC)、对硝基苯葡萄糖苷(pNPG)、桦木木聚糖(Birchwoodxylan)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购自Sigma公司；其他试剂均为进口或国产分析纯；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，本研究中所用到的引物见表1。表1所用的引物序列aTheunderlinednucleotidesequencesindicaterestrictionenzymesites.2.3培养基(1)H.insolens产孢培养基为马铃薯培养基：1000mL，200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。(2)H.insolens纤维素酶诱导培养基：2％微晶纤维素，2％酵母提取物，0.1％蛋白胨，0.06％MgSO4·7H2O，pH6.8。(3)大肠杆菌LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0。(4)根瘤农杆菌生长培养基见表2。表2根瘤农杆菌生长所用培养基注：Glucose、FeSO4、MES和Kanamycin储存液分别进行过滤除菌，并于-20℃储存备用。除Acetosyringone溶于95％乙醇外，其余贮存液均用灭菌水溶解。Acetosyringone母液浓度为200mM。实验例11实验方法1.1根瘤农杆菌化学感受态细胞的制备(1)从LB(含25μg/mL利福平)平板上挑取菌株AGL-1的单菌落到3mLLB液体培养基中(含25μg/mL利福平)，220rpm、28℃摇床培养24h；(2)取2mL上述菌液到100mLLB(含25μg/mL利福平)中，220rpm、28℃摇床培养至OD600＝0.5左右，约8h；(3)菌液冰浴30min后，4,100rpm、4℃离心10min收集菌体；(4)用30mL20mMCaCl2洗一次；(5)4,100rpm，4℃离心10min再次收集菌体；(6)弃上清液，用5mL含20％甘油的20mMCaCl2悬浮菌体。每份100μL分装，液氮速冻后于-70℃保存。1.2质粒构建分别用引物Pgpd-F/Pgpd-R和Tgpd-F/Tgpd-R以腐质霉基因组为模板扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的启动子Pgpd和终止子Tgpd并连入克隆载体pEASY-Blunt(Transgen,China)。Tgpd用EcoRV和XhoI切下并连入pBluescriptIKS(+)的相应位点得到质粒pTgpd。Pgpd用NotIandBamHI切下并连入pTgpd的相应位点，得到pPgpd-T。用引物npt-F/npt-R以质粒pEGFP-N1(Clontech)为模板扩增G418抗性基因(neo)，连入pEASY-Blunt，并用BamHI和EcoRV切下后连入pPgpd-T的相应位点，得到质粒pP-neo-T。然后用引物Pgpd-F-2/Tgpd-R扩增出pP-neo-T表达框，连入pEASY-Blunt后用SpeI和XhoI切下并连入pAg1-H3的相应位点处得到质粒pAg1-neo。pAg1-H3用BglII酶切后自连产生质粒pAg1。潮霉素B抗性基因(hph)用hph-F/hph-R以pAg1-H3为模板扩增，连入pEASY-Blunt后用BamHI和EcoRV切下并连入pPgpd-T-2载体，得到pP-hph-T。pPgpd-T-2载体的构建过程除了扩增Pgpd所用引物为Pgpd-F-3/Pgpd-R外，其余过程相同。然后用PvuII将Pgpd-hph-Tgpd表达框切下，连入pAg1的相应位点，生成pAg1-hyg。用PvuII将Pgpd-Tgpd片段切下连入pAg1-hyg的SmaI位点，生成质粒pAg1-hyg-P-T。该质粒再Pgpd和Tgpd间有一单酶切位点SmaI，外源基因可通过平端连入该位点。用引物gfp-F/gfp-R以pEGFP-N1为模板扩增egfp基因，连入pEASY-Blunt后用EcoRV切下并连入pAg1-hyg-P-T的SmaI位点，挑取正确的连入方向，得到荧光蛋白的表达质粒pAg-egfp。1.3质粒转化根瘤农杆菌感受态细胞(1)将农杆菌感受态置于冰上融化；(2)将1μg的质粒添加到感受态细胞中，柔和混匀，冰上放置30min；(3)液氮中速冻5min；(4)37℃温育20min，冰上放置2min；(5)添加1mLLB液体并于28℃，220rpm摇床培养3h；(6)5,000rpm离心3min，去掉大约800μL上清后重悬，之后涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB抗性平板上培养2d；菌落PCR验证转化子，同时保存菌种(含20％甘油)于-70℃冰箱。1.4根瘤农杆菌介导的特异腐质霉转化(1)将已转入目的质粒的农杆菌接种于3mLLB液体(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)于28℃摇床中220rpm培养24h；(2)转接20μL菌液至2mLMM培养基中，于28℃摇床中220rpm培养24h；(3)将培养液5,000rpm离心5min，并用2mLIM液体重悬菌体至OD600＝0.2；(4)于28℃摇床220rpm诱导培养6h左右，至OD600值在0.6-0.8之间；(5)制备真菌孢子悬液，浓度107个孢子/mL；取100μL涂布至铺有玻璃纸的CM平板，42℃预萌发不同时间(0h，6h，12h，18h，24h，30h)；(6)将上述农杆菌菌液100μL涂布于已预萌发有真菌菌丝的CM平板，不同温度下(22℃，25℃，28℃)暗培养2-5d；(7)2-5d后将共培养物用2-3mL无菌水洗下，涂布于含有50μg/mLG418和500μg/mL噻孢霉素的PDA平板上(每个共培养板的培养物转至5个筛选板)，42℃培养，待生长5-6d后挑选生长比较迅速即比较大的菌落转移到含有50μg/mLG418和500μg/mL噻孢霉素的PDA平板上，可正常生长的菌落视为疑似转化子，抽提基因组DNA并通过PCR验证转化子。1.5特异腐质霉基因组DNA的提取(1)收集真菌菌体，用滤纸压干，液氮速冻；(2)研钵中研磨至粉末状；(3)加入700μLTPS缓冲液，旋涡震荡混匀，75℃水浴作用20min；(4)12,000rpm，离心10min，取上清；(5)加入200μL的中酚/氯仿，充分混匀，12,000rpm，离心5min，取上清；(6)重复步骤5至无中间层；(7)加氯仿，混匀，12,000rpm，离心5min后取上清；(8)重复步骤7；(9)加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉降20min；(10)12,000rpm，离心10min，弃上清；(11)加700μL70％乙醇洗两次；(12)待乙醇挥发后加入30-50μLddH2O溶解沉淀。1.6转化子的荧光观察将腐质霉野生型和转化子gfp的孢子均匀涂于PDA平板，42℃生长2d后，刮取菌丝体，用OlympusBX51荧光显微镜下观察菌丝形态。1.7随机突变体的构建与筛选通过农杆菌介导的转化技术将pAg1-neo转入H.insolensY1中(方法参见1.4)，构建其T-DNA随机插入突变体库，并用PDA抗性平板(含50μg/mLG418)筛选转化子。将获得的转化子逐一编号，并接入48孔板(含PDA培养基)中培养、常温保存。通过比较转化子在发酵培养基固体平板上的菌落生长或形态差异，以及液体发酵上清纤维素酶活的差异筛选目标转化子。1.8摇瓶发酵实验及纤维素酶酶活的测定以PDA平板培养并收集特异腐质霉孢子，取约107个孢子分别接入盛有50mL发酵培养基的250-mL三角瓶中，42℃、220rpm培养6d。每天收集样品，并离心取上清进行发酵产物的纤维素酶酶活。纤维素酶滤纸酶活：纤维素酶的滤纸酶活采用Whatman1号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。取酶液40μL，加入到1.96mL柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(0.1M、pH6.0)中，得到稀释50倍的酶液。将Whatman1号滤纸制成6cm长、1cm宽的形状(50mg左右)，折成4折，成M型。将滤纸条置于试管底部，加入稀释好的酶液2mL(空白先不加)，混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。60℃水浴保温30min，迅速冷却。向各试管中加入3mLDNS试剂，再向空白中加酶液2mL，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。在60℃、pH6.0的条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活测定：取500mg羧甲基纤维素钠，用柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(0.1M、pH6.0)定容至50mL，得到1％的羧甲基纤维素钠溶液。羧甲基纤维素钠溶液应立即使用，使用前适当摇匀。在4℃下避光保存，有效期为3天。在各试管中加入1％的羧甲基纤维素钠溶液0.9mL，60℃水浴平衡后，加入适当稀释的酶液0.1mL(空白先不加)，振荡混合均匀。60℃水浴保温30min，迅速冷却。向各试管中加入1.5mLDNS试剂，再向空白中加酶液0.1mL，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。在60℃、pH6.0的条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。葡萄糖苷酶酶活的测定：将对硝基苯-葡萄糖苷(pNPG)溶于0.1M、pH6.0柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液制成4mMpNPG的底物溶液。反应体系中加入250μL适当稀释的酶液和250μL4mMpNPG，空白先不加酶液。60℃水浴保温10min，迅速冷却。向各试管中加入1.5mL1.0MNa2CO3溶液，再向空白中加酶液250μL，混合均匀。测定405nm的吸光度。在60℃、pH6.0的条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。纤维二糖水解酶酶活的测定：以对硝基苯-纤维二糖苷(pNPC)作为底物，以对硝基苯的生成量表示酶活力。测定方法同上。木聚糖酶酶活的测定：称取1g桦木木聚糖于90mL0.1MpH6.0柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液中，在沸水中加热5min，12,000rpm离心5min，取上清。再加缓冲液定容至100mL，置于4℃环境中备用。木聚糖酶酶活性的测定采用DNS法(Miller1959)。测定酶活时，设置为两组，一为实验组，二为对照组，两者均含有900μL桦木木聚糖底物，置于60℃恒温水域锅内进行预热，测定时，实验组加入用0.1M、pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液适当稀释的酶液，对照组则不加，反应10min后加入1.5mLDNS终止液，在对照组中添加相等体积的稀释酶液。沸水煮5min后，将其置于冰水混合物中冷却至室温，在540nm波长处测定其OD值，根据木糖的标准曲线来计算酶活。在60℃、pH6.0的条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。2实验结果2.1转化质粒的构建为了选择转化子的筛选标记，我们首先开展了特异腐质霉的抗生素敏感性实验。我们检测了潮霉素B，G418和博莱霉素对特异腐质霉在PDA培养基中生长情况的影响。实验结果表明，≥10μg/mL的潮霉素B，≥50μg/mL的G418以及≥10μg/mL的博来霉素可以完全抑制特异腐质霉的生长。因此，潮霉素B抗性基因(hph)，G418抗性基因(nptⅡ)和博来霉素抗性基因(bleR)均可作为特异腐质霉外源基因转化的筛选标记。为了实现抗性基因在特异腐质霉中的功能性表达，我们以特异腐质霉的基因组DNA为模板，利用引物对PgpdF/PgpdR，TgpdF/TgpdR扩增其3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gpd)的启动子和终止子区域，以质粒pEGFP-N(Clontech)为模板，以引物对nptF/nptR进行PCR扩增得到新霉素磷酸转移酶编码基因nptⅡ，经测序验证后连入质粒pBluescriptKS(+)的多克隆位点，组成由gpd启动子启动，gpd终止子终止的nptⅡ完整表达框。将此表达框构建至农杆菌转化质粒pAg1-H3中，得到特异腐质霉的转化载体pAg1-neo(图1A)。以质粒pEGFP-N为模板，以引物对egfpF/egfpR进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白编码基因egfp，经测序验证后连入质粒pEASY-Blunt的多克隆位点，切下后连入pAg1-hyg-P-T中组成egfp的完整表达框，得到H.insolensY1的转化载体pAg-egfp(图1B)。2.2转化参数的优化以pAg1-neo作为出发质粒，在多种不同的转化条件下尝试进行了H.insolensY1的遗传转化。实验结果表明，在共培养时间为2-3d，诱导剂乙酰丁香酮的浓度为400μM，预萌发时间为24h，共培养温度为25℃，农杆菌浓度为OD600＝0.6时，可以获得最高的转化效率(图2)。2.3转化子验证挑取可在添加了50μg/mL的G418的PDA培养基上正常生长的疑似转化子，提取基因组DNA，利用新霉素磷酸转移酶编码基因(nptⅡ)内部引物neo-F/neo-R进行PCR验证，结果显示，在疑似转化子的基因组中，可以扩增出明显的目的条带(图3)。这表明，利用根瘤农杆菌介导的转化方法，成功地实现了外源DNA片段对H.insolensY1的遗传转化。本发明将绿色荧光蛋白编码基因egfp通过ATMT的方法转入到H.insolensY1中，通过用荧光显微镜观察绿色荧光的有无来直观说明ATMT在腐质霉转化中的可行性。本发明选用最适的ATMT转化条件将质粒pAg-egfp转入H.insolensY1中，随机挑选转化子(命名为gfp)并进行了荧光观察。结果显示，在蓝光激发下，转化子菌丝内呈现出较强的绿色荧光信号(图4)，这表明，绿色荧光蛋白基因确实转入H.insolensY1中，并能够正确表达。上述实验结果说明ATMT在腐质霉遗传转化体系中是可行的，且绿色荧光蛋白可以作为其报告基因使用。同时表明载体pAg1-hyg-P-T具有表达异源基因的潜力。2.4转化子遗传稳定性的验证将随机挑选的转化子接种到不含G418的PDA培养基上培养，连续转接5代，然后再接种到含有100μg/mL的G418的PDA培养基上培养。结果表明，转化子无论在非选择培养基还是在选择培养基上都能正常生长，从而表明腐质霉转化子能稳定遗传。2.5突变体库的构建及纤维素酶高产株的筛选通过农杆菌介导的转化技术，构建了一个小型的特异腐质霉的T-DNA随机插入突变体库，将这些突变株逐个编号(T1-T10000)，并对应点接于发酵培养基固体平板上培养，观察记录突变株的生长或形态分化特征。将具有显著表型变化的突变株进行液体发酵实验，将发酵上清进行纤维素酶活的测定。最终发现一株突变株T4在发酵液体培养基中与野生型在生物量一致的情况下，其液体发酵上清的滤纸酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，纤维二糖水解、木聚糖酶活和葡萄糖苷酶的活性最高分别为野生型的1.6、4.4、3.2、1.8、1.4倍(图5A-E)。T4纤维素酶活的提高可能是由于其在发酵条件下分泌更多的蛋白导致的(图5F)。另外对突变株T4，T43，T49，T53,T82，T83的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活进行比较，结果见表3和图6，可以看出，T4内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活明显高于T43，T49，T53,T82，T83，因此最终筛选得到了纤维素酶高产株突变株T4，将其命名为Y1-T4，并提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12454；分类命名为：特异腐质霉Humicolainsolens。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年05月18日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。表3突变株CMCase酶活。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3