降低烟叶中烟碱的菌株及筛选方法、培养方法和应用与流程

本发明涉及一种微生物菌株，具体涉及一种可降低烟叶中烟碱的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，及其筛选方法、培养方法和该菌株在烟叶中的应用。

背景技术：

烟叶是卷烟生产的原料，烟叶质量的好坏直接关系到卷烟品质的高低。烟叶的化学常规成分主要是：总植物碱、水溶性总糖、还原糖、总氮、氯和钾，还含有蛋白质、淀粉、纤维素、果胶等大分子化合物，这些成分在烟叶中的含量以及某些成分之间的比例关系，对烟叶品质有着重要的影响。烟碱又名尼古丁(Nicotine)，是烟草生物碱中的主要成分。烤烟中烟碱的含量一般在1.5％～3.5％之间，以2.5％左右为宜。烟碱含量过低，劲头太小，缺乏满足感，烟碱含量过高，劲头太大，会引起刺呛辛辣感。我国部分库存烟叶(特别是上部烟叶)存在烟碱含量过高，糖碱比严重失调，烟叶的质量和可用性差的问题。

目前，降低烟叶中烟碱含量的方法主要有三种途径：①从遗传、生态、种植等农业种植方面进行烟碱含量调控；②采用热水漂洗、有机溶剂萃取、气体抽提、蒸汽蒸馏等处理烟叶，从化学角度脱除烟叶中烟碱；③采用微生物或酶生物技术处理烟叶，降低烟叶中烟碱含量，提高烟叶的可用性。对于已经成熟采收了的烟叶，只能采用后面两种途径。其中，采用化学方法虽可以去除烟碱，但同时会导致烟叶中一些香味物质的损失，而通过微生物或酶处理烟叶，由于酶具有高度专一性，因而可以较好的避免烟叶香味成分损失的难题。

技术实现要素：

针对某些库存烟叶中烟碱含量过高，糖碱比严重失调，烟叶的质量和可用性差的问题，本发明提供一种可降低烟叶中烟碱的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；

本发明的另一个目的是提供了所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的筛选方法；

本发明的又一个目的是提供了蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的培养方法；

本发明的又一个目的是提供了蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)在烟叶中的应用。

为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：

一种降低烟叶中烟碱的菌株，所述的菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC 10338。

本发明提供了所述的蜡状芽孢杆菌的培养和显微形态特征如下：

肉汁琼脂平板上菌落大，粗糙，不规则，边缘有鞭状的枝条，微白色，表面具特征性斑纹；

肉汁琼脂斜面上生长旺盛，粗糙，不透明，淡白色，扩展，边缘不规则，有鞭状枝条；细胞杆状，3.0-4.8×1.0-1.1um，末端方，成短链。

本发明还挺提供了所述的降低烟叶中烟碱的菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤A：取土壤样品9～10g于90mL富集培养基中，然后于温度28～32℃下培养40～50h得到富集培养液；

步骤B：取富集培养液1～1.2mL，放入装有熔化后冷却至48～52℃的分离培养基的培养皿，凝固后置于温度28～32℃的恒温培养箱中培养6～8天；然后挑选生长的菌落接入驯化培养基中，于温度28～32℃、转速100～150rpm的条件下培养90～110h；接着将培养物梯度稀释涂布于分离培养基平板，得到单菌落，通过划线分离纯化得到所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

在上述的筛选方法中，所述的富集培养基包括下述重量的组分：蛋白胨，5.0g；NaCl，1.0g；K₂HPO₄，1.0g；琼脂，1.5g；富集培养基的pH为7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2.0g。

在上述的筛选方法中，所述的分离培养基包括下述重量或体积的组分：K₂HPO₄，1.0g；MgSO₄，0.5g；质量分数为0.1％的MnSO₄，1mL；质量分数为0.1％的FeSO₄，3mL；琼脂，1.5g；分离培养基的pH 6.0～7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱4.0g。

在上述的筛选方法中，所述的驯化培养基包括下述重量或体积的组分：K₂HPO₄，1.0g；MgSO₄，0.5g；质量分数为0.1％的MnSO₄，1mL；质量分数为0.1％的FeSO₄，3mL；驯化培养基的pH 6.0～7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg。

本发明还提供了所述的降低烟叶中烟碱的菌株的培养方法，包括以下步骤：

步骤a：斜面培养：将冷冻保存的蜡状芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于温度28～32℃下静置培养1～2天；

步骤b：摇瓶液体培养：将步骤a培养所得的菌种接种到液体培养基上，于温度28～32℃、转速140～160r/min的条件下摇瓶培养18～24h，培养至菌数达达10¹⁰以上，得到种子液。

在上述的培养方法中，所述的斜面培养基或液体培养基包括下述重量或体积的组分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。

本发明还提供了所述的降低烟叶中烟碱的菌株在降低烟叶中烟碱的应用，将种子液按照烟叶重量的5～30％，加入到烟叶中，然后于温度20～45℃下发酵1～6天。

在上述的应用中，优选的是，将种子液按照烟叶重量的20～30％，加入到烟叶中，然后于温度20～45℃下发酵1～6天。

本发明提供了一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株生长繁殖力强、菌丝生长旺盛。使用该菌株发酵处理烟碱含量高、糖碱比严重失调的烟叶，能降低烟碱含量20～40％，具有较好的稳定性和重现性，发酵后烟叶劲头适中，呛刺辣感降低，协调性提高，感官质量明显改善。

附图说明

图1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的菌落形态图；

图2为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的细胞形态图；

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的保藏说明：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏编号：CGMCC No.10338；

保藏时间：2015年1月12日。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。

实施例1：蜡状芽孢杆菌的分离、鉴定

取土壤样品(四川凉山姜州烟田土壤)10g于90mL富集培养基中，30℃静置培养48h。取富集培养液1mL，放入装有熔化后冷却至50℃分离培养基的培养皿中混合均匀，凝固后放于30℃恒温培养箱培养7天。挑取生长的菌落接入驯化培养基中，30℃，120rpm培养96h，将培养物能梯度稀释涂布于分离培养基平板，得到单菌落，通过划线分离纯化得蜡状芽孢杆菌株(Bacillus cereus)。

所述富集培养基为：蛋白胨，5.0g；NaCl，1.0g；K₂HPO₄，1.0g；琼脂，1.5g；富集培养基的pH为7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2.0g。

所述分离培养基为：K₂HPO₄，1.0g；MgSO₄，0.5g；质量分数为0.1％的MnSO₄，1mL；质量分数为0.1％的FeSO₄，3mL；琼脂，1.5g；分离培养基的pH 6.0～7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱4.0g。

所述驯化培养基为：K₂HPO₄，1.0g；MgSO₄，0.5g；质量分数为0.1％的MnSO₄，1mL；质量分数为0.1％的FeSO₄，3mL；驯化培养基的pH 6.0～7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg。

所述蜡状芽孢杆菌培养和显微形态特征描述如下：

肉汁琼脂平板上菌落大，粗糙，不规则，边缘有鞭状的枝条，微白色，表面具特征性斑纹。

肉汁琼脂斜面上生长旺盛，粗糙，不透明，淡白色，扩展，边缘不规则，有鞭状枝条，细胞杆状，3.0-4.8×1.0-1.1um，末端方，成短链。

经鉴定，蜡状芽孢杆菌具有的16S rRNA基因序列和danj基因序列。

实施例2：蜡状芽孢杆菌种子液的制备

将实施例1得到的蜡状芽孢杆菌菌落进行扩大培养及生产，获得蜡状芽孢杆菌种子液。

A、斜面培养：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2，将冷冻保存的蜡状芽孢杆菌株(Bacillus cereus)接种到斜面培养基上，30℃恒温静止培养1-2天。

B、摇瓶液体培养：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2，高压蒸汽灭菌，将步骤A所的菌体接种到培养基液体中，培养温度：30℃，摇床转速140-160r/min，摇瓶培养18-24h，培养至菌数达10¹⁰以上，得到种子液。

实施例3：

将实施例2得到的蜡状芽孢杆菌种子液按照烟叶重量的30％，加入到含水量15％的烟叶中，25℃条件下发酵6天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中烟碱含量降低24.9％，感官评价结果表明：发酵烟叶劲头明显降低，刺激性明显减少、烟气更醇和。

实施例4：

将实施例2得到的蜡状芽孢杆菌种子液按照烟叶重量的5％，加入到含水量50％的烟叶中，发酵3天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中烟碱含量降低29.7％，感官评价结果表明：发酵烟叶劲头明显降低，刺激性明显减少、烟气更醇和。

实施例5：

将实施例2得到的蜡状芽孢杆菌种子液按照烟叶重量的20％，加入到含水量35％的烟叶中，发酵4天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中烟碱含量降低38.1％，感官评价结果表明：发酵烟叶劲头明显降低，刺激性明显减少、烟气更醇和。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。