本发明涉及微生物筛选
技术领域：
，具体提供了一种新型嗜酸乳杆菌及其应用。
背景技术：
：益生菌是有益于宿主健康的一类微生物，1965年在Science上首次被提出。肠道菌系平衡是对人体营养和健康至关重要的因素，益生菌对人体肠道菌系有很好的调节作用，这使得益生菌的研究成为食品研究的一大热点。近年来，随着对益生菌的深入研究，益生微生物的种类也越来越多，其主要分为三大类:第一类为乳酸菌，主要包括嗜酸乳杆菌、粪链球菌和乳双歧杆菌等；第二类为芽胞杆菌；第三类为酵母菌。乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生乳酸的非病原性、革兰氏阳性细菌的通称,包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属。在选育乳酸菌菌株时应考虑一下几点:(1)菌体分离的对象应是健康的人或动物,人类使用的菌株最好来源于人。(2)能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境。(3)具有适宜的免疫调节作用,不会引起炎症等不良反应。乳酸菌作为微生态制剂的重要菌种，在维护人和动物肠道健康、促进体内微生态平衡方面起着重要的作用，大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。此外,乳酸菌作为重要的益生菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中,被公认为是安全的食品级微生物。对于健康成年人来说，其肠道内微生物按一定的种群比例定植在肠壁上，处于一种稳定的菌群平衡中。但由于某些因素如抗生素的使用、放疗、化疗、饮食习惯不良、精神压力等原因可能会导致肠道正常菌群种类和数量的改变，肠道微生物生态系统被破坏，所引起的病理状态称为肠道菌群失调。乳酸菌进入肠道后，可以迅速进行生长繁殖，代谢产生的乳酸、二氧化碳使肠内pH值迅速降低，抑制了病原菌和有害人体健康的细菌的繁殖，从而起到预防感染、维持肠内菌群平衡的作用。乳酸菌对人体有特殊的生理作用，是机体内必不可少的正常生理菌群，拓展菌种来源，选育既有优良发酵特性，又有特殊保健功能的活菌数高、优良、安全的乳酸菌菌种；应用分子生物技术开发食品级乳酸菌菌株和工程菌菌株，将为人类带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。技术实现要素：本发明未解决现有技术问题，从自然发酵的酸菜汁中筛选出一种新型嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，该菌株耐胃酸和胆汁盐，具有很强的抗氧化性，并且对大肠杆菌的抑制作用显著，应用前景广阔。本发明一方面提供了一种嗜酸乳杆菌KDB-03(LactobacillusacidophilusKDB-03)，已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016429。一种乳酸菌口服液，是通过将上述嗜酸乳杆菌对原料发酵后加工制备的。所述的原料为奶粉、白砂糖和葡萄糖的水溶液，其中各原料的质量体积比浓度g/ml分别为奶粉3％-10％、白砂糖0.5％-8％、葡萄糖0.5％-6％。所述的乳酸菌口服液还添加有水溶性膳食纤维、功能性寡糖、甜味剂和增稠剂，在乳酸菌口服液中的终浓度质量体积比g/ml分别为0.5％-10％、0.1％-2％、0.01％-0.5％、0.05％-0.5％。一种乳酸菌口服液的制备方法，包括如下步骤：1)配制发酵培养基，各组分及其质量体积比分别为：奶粉10％、白砂糖0.5％、葡萄糖0.5％；2)将培养基预热至50-55℃，在20-25MPa压力条件下进行均质，瞬时高温杀菌；3)按发酵量的5％接种嗜酸乳杆菌KDB-03，接种完后继续搅拌15min；4)控制发酵温度37-40℃，发酵10小时；5)冷水迅速降温至10℃以下，加入灭菌的聚葡萄糖、低聚果糖、甜蜜素和果，混合均匀，至终质量体积比(g/ml)分别为；聚葡萄糖0.5％、低聚果糖2％、甜蜜素0.5％、果胶0.5％；6)无菌灌装、包装、入库，2-10℃冷藏，即得乳酸菌口服液。所述乳酸菌口服液中嗜酸乳杆菌的活菌数10-30亿/mL。有益效果本发明筛选到的嗜酸乳杆菌抑菌能力很强，其对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达24mm。所述嗜酸乳杆菌能在胃酸中进行有效繁殖，并对胆汁盐具有强耐受性。所述嗜酸乳杆菌KDB-03能强力去除胆固醇，去除率高达91.4％；该菌株还具有很强的抗氧化能力，其发酵上清液对DPPH·和羟基自由基的清除率分别高达92.6％和94.1％。所述嗜酸乳杆菌可广泛应用于乳酸菌口服液的制备，能明显增加肠道有益菌的数量，改善胃肠道健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。具体实施例实施例1嗜酸乳杆菌KDB-03分离筛选及鉴定：1、筛选样品从沈阳苏家屯农村收集自然发酵的酸菜汁作为分离样品，所述酸菜汁外观无污染、味道纯正，发酵时间超过1年，过滤后备用。2、乳酸菌初筛取过滤后的酸菜汁5mL加入45mL无菌水，混匀，涂布于加0.5％碳酸钙的MRS平板上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得42株乳酸菌。3、抑菌型乳酸菌筛选1)乳酸菌液制备：将初筛得到的32株乳酸菌分别接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养48h；2)致病菌菌液制备：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌(四种致病菌均由山东大学赠送)，将菌种接种于营养肉汤，37℃摇床培养过夜；3)抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基(50℃左右)加100μL致病菌菌液(菌量106数量级)，混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。结果显示，初筛获得的乳酸菌中对大肠杆菌、沙8门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径均超过15mm的菌株共株。进一步对其进行抗生素耐受筛选。经过两次删选，最终申请人从上述8株菌中筛选得到对大肠杆菌的生长抑制作用最强的乳酸菌，命名为KDB-03。表1乳酸菌KDB-03对致病菌的抑制作用致病菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌幽门螺旋杆菌抑菌圈直径24mm20mm21mm21mm由上表可以看出，本发明筛选出的乳酸菌KDB-03对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到24mm。3、菌株鉴定利用试剂盒提取上述乳酸菌KDB-03的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrRNA序列。将测序结果在GenBank核酸数据库中进行blast比对发现，乳酸菌KDB-03的16SrRNA序列与嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的序列相似度高于99％。因此，确认其为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，命名为嗜酸乳杆菌KDB-03(LactobacillusacidophilusKDB-03)，并于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016429。实施例2嗜酸乳杆菌KDB-03耐酸、耐胆盐实验1、耐胃酸性能检测方法：取活化后的嗜酸乳杆菌KDB-03菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液(取稀盐酸16.4ml加水摇匀稀释至1000ml，用浓盐酸或10％的NaOH调整pH为2.0，于121℃灭菌30min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶)，37℃水浴培养3h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h和3h样品菌体的存活率，存活率＝(2h或3h时的活菌数/0h时的活菌数)×100％。2、耐胆汁盐性能检测方法：取活化后的嗜酸乳杆菌KDB-03菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液(配制方法：取KH2PO46.8g，加蒸馏水500ml溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000ml，每100ml溶液中加0.3g禽胆盐，充分溶解后，于115℃灭菌15min。)，37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h和3h样品菌体的存活率，存活率＝(2h或3h时的活菌数/0h时的活菌数)×100％。同时，以嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC1.1854作为对照，进行上述耐胃酸和耐胆汁盐性能检测。具体结果见表2。表2嗜酸乳杆菌KDB-03耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果从表2中的数据可以看出，与嗜酸乳杆菌CGMCC：1.1854相比，本发明筛选到的嗜酸乳杆菌KDB-03具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，尤其是其在胃酸中3h时的存活率高达237.52％，不仅远远高于对照菌株，而且明显高于嗜酸乳杆菌KDB-03在2h时的存活率，这说明所述嗜酸乳杆菌KDB-03在胃酸中不但能够有效存活，而且还实现了明显的增殖，取得了意料不到的效果。实施例3嗜酸乳杆菌KDB-03对胆固醇的去除效果本实验参照Brashears等(1998)的方法，并略有改进。将嗜酸乳杆菌KDB-03菌株活化后接种于MRS培养基，37℃培养过夜，作为种子液。配制含5％(v/v)蛋黄液的MRS培养基，取其中2ml培养基，5000r/min离心7min，取1ml上清液置于离心管中，加入9ml无水乙醇，振荡处理5min，10000r/min离心10min，取2ml上清液加入2mlP-Fe-S试剂，冰浴混匀反应30min，测OD550，计算培养基中胆固醇的初始含量。然后，将嗜酸乳杆菌KDB-03的种子液接种至上述MRS培养基中，在37℃条件下培养24h后，再次测定培养基中胆固醇的最终含量，计算嗜酸乳杆菌KDB-03对胆固醇的去除率。同时以嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC：1.1854作为对照菌株，采用上述同样的操作，计算该菌对胆固醇的去除率。胆固醇去除率＝(初始含量－最终含量)/初始含量×100％结果显示：本发明筛选到的嗜酸乳杆菌KDB-03对MRS培养基中胆固醇的去除率高达91.4％；而同样是嗜酸乳杆菌的对照菌株对胆固醇的去除率仅为19.8％。从而说明本发明筛选到嗜酸乳杆菌KDB-03能强力去除胆固醇，取得了意料不到的技术效果。实施例3嗜酸乳杆菌KDB-03体外抗氧化实验将嗜酸乳杆菌KDB-03进行传代活化后，以5％(质量比)接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18h，3000r/min，离心15min，分别收集发酵上清和菌体。制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109cfu/ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。3.1DPPH·清除实验DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物抗氧化效果显著。DPPH·溶液；各取1ml发酵上清液和无细胞提取物，分别加入1ml浓度为0.2mmol/L的DPPH·，混匀，室温下静置30min后，在517nm处测吸光度变化。DPPH·的清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100式中:A1表示未加样品的DPPH·溶液的原始吸光度；A2表示样品在测定波长时的本身吸光度；A3表示加样后DPPH溶液的吸光度。结果显示：嗜酸乳杆菌KDB-03的发酵上清液和无细胞提取物均能强力去除DPPH·，其清除率分别高达92.6％和81.2％，从而说明本发明提供的嗜酸乳杆菌KDB-03的发酵液上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，而且该菌株发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物，这说明嗜酸乳杆菌KDB-03生长期间的代谢产物对自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。3.2羟基自由基清除实验ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。ESR法测定清除羟基自由基的能力：分别将50μL嗜酸乳杆菌KDB-03的发酵上清液和无细胞提取物各加入到50μL浓度为0.3mol/L的DMPO后，把反应的体系转入到密封的石英毛细管中，然后加50μL浓度为10mol/L的H2O2启动反应。反应2.5min后，通过ER200DSRCESR光谱仪分析。对照为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)。样品对·OH的清除作用以清除率表示。清除率＝(H0—H)/H0×100％式中：H和H0分别表示样品与对照波谱信号强度，信号的相对强度用波谱信号的第二个峰值来表示。结果显示：嗜酸乳杆菌KDB-03的发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达94.1％和88.3％，从而进一步证明嗜酸乳杆菌KDB-03具有很强的抗氧化能力，并且该菌株发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物。实施例4体内抗氧化动物实验4.1实验设计体内抗氧化功能实验采用高脂氧化应激模型。实验动物使用健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重23士2g，由江苏无锡惠山江南实验动物场提供。小鼠在室温下饲养，自由采食饮水，经3d的适应性饲养后，随机分成4组，每组10只，饲喂基础饲料(配方：89.5％普通饲料、10％猪油、0.5％胆固醇)，对照组每日灌胃0.2mL生理盐水，其余三组分低中高三剂量灌胃不同浓度嗜酸乳杆菌KDB-03，如表3所示，每日0.2mL/只，连续4周。末次给样后禁食24h，迅速采集血液，分离红细胞和血清，检测红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、血浆过氧化氢酶(CAT)活性、血浆丙二醛(MDA)含量，所有数据均用统计软件SPSS进行统计学处理。试剂盒购于南京建成生物工程公司。表3抗氧化功能评价的动物实验4.2结果分析4.2.1超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶(SOD)，是具有专一清除生物体内的超氧离子，能平衡机体的氧自由基。它可以清除过度超氧阴离子自由基，减少由超氧阴离子自由基产生的疾病。本发明中灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响见表4。表4嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞SOD活力影响组别SOD活性(U/mgHb)对照组214.93±1.56低剂量245.33±1.91中剂量268.79±2.16*高剂量298.38±1.36**P＜0.05从表4可以看出，相对于对照组，中剂量和高剂量小鼠的红细胞SOD酶活力分别提高了25.1％和38.8％，从而说明本发明的嗜酸乳杆菌KDB-03能显著提高SOD酶活力，具有较强的抗氧化能力。4.2.2谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能的作用。灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响见表5。表5嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力影响组别GSH-Px(酶活力单位)对照组131.45±0.67低剂量151.34±2.21中剂量174.03±3.82*高剂量189.77±2.51**P＜0.05从表5可以看出，中、高剂量组小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力分别高达174.03和189.77，比对照组提高了32.4％和44.4％，从而证实了本发明提供的嗜酸乳杆菌KDB-03可以显著提高小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力。4.2.3过氧化氢酶过氧化氢酶在机体内普遍存在，催化过氧化氢分解为水和氧气。过氧化氢是机体代谢的有毒副产物，经过过氧化氢酶催化转化成其它低毒的化学物，防止机体受到损伤。灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠过氧化氢酶活性影响见表6。表6灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠过氧化氢酶活性影响组别CAT活性(U/ml)对照组1.65±0.82低剂量1.88±2.43中剂量2.74±2.89*高剂量2.94±3.15**P＜0.05从表6可以看出，与对照组相比，中、高剂量的处理组小鼠的过氧化氢酶活分别提高了63.9％和75.3％，效果显著，从而说明嗜酸乳杆菌KDB-03可以有效改善小鼠的抗氧化能力。4.2.4丙二醛丙二醛水平反应了机体内脂质过氧化，间接地反映出细胞损伤的程度。灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞丙二醛水平的影响见表7。表7灌胃嗜酸乳杆菌KDB-03对小鼠红细胞丙二醛水平影响组别丙二醛含量(nmol/ml)对照组3.44±1.87低剂量3.03±1.89中剂量2.67±1.33高剂量1.59±1.37**P＜0.05从表7可以看出，与对照组相比，三个剂量的处理组丙二醛含量均明显降低，说明本发明提供的嗜酸乳杆菌KDB-03可以减轻小鼠体内自由基对细胞的损伤，其中高剂量嗜酸乳杆菌KDB-03使小鼠红细胞内丙二醛的含量降低了53.8％，效果非常显著。实施例5利用嗜酸乳杆菌KDB-03制备乳酸菌口服液配制罐中加入适量水，将奶粉、白砂糖、葡萄糖加入到配制罐中，搅拌溶解，最后定容，其中各原料的质量体积比(g/ml)分别为：奶粉10％、白砂糖0.5％、葡萄糖0.5％。将原料预热至50-55℃，在20-25MPa压力条件下进行均质。利用瞬时高温杀菌机130-135℃杀菌4-6s，控制原料出口温度为30-45℃。开启发酵罐搅拌，按发酵量的5％接种嗜酸乳杆菌KDB-03。接种完后继续搅拌15min，充分混匀后关闭搅拌，控制发酵温度37-40℃，发酵10小时，冷水迅速降温至10℃以下。加入灭菌的聚葡萄糖、低聚果糖、甜蜜素和果胶，混合均匀，至终质量体积比(g/ml)分别为聚葡萄糖0.5％、低聚果糖2％、甜蜜素0.5％、果胶0.5％。无菌灌装、包装、入库，2-10℃冷藏，即得乳酸菌口服液，其中乳酸菌活菌数为10-30亿/mL。实施例6乳酸菌口服液的效果评价从健康人群中随机挑选成年男女各20名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.09×108CFU/g和8.04×109CFU/g。40名健康成年人每天食用本发明所述乳酸菌口服液50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数平均为9.55×109CFU/g和8.91×1011CFU/g。从结果看，食用该乳酸菌口服液能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有效改善胃肠道健康，提高机体免疫力，取得了意料不到的技术效果。当前第1页1 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