本发明涉及一种牛支原体液体培养基及其制备方法，确切讲是一种其组分中包括有：蛋白胨、葡萄糖、丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液、L-谷氨酰胺、少量马血清、青霉素、酚红、去离子水用于培养牛支原体液体培养基及其制备方法。
背景技术：
牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）属于柔膜体纲，支原体目微生物，能够引起牛肺炎、关节炎、乳房炎等多种疾病。该病原是牛呼吸疾病综合征的主要病原，是威胁育肥牛和奶牛健康的一种重要病原。该病目前在全世界范围流行，严重威胁养牛业的健康发展并造成了严重经济损失。
疫苗免疫是预防和控制牛支原体病发生的一个重要手段。牛支原体疫苗生产和研制的一个重要基础是优质培养基的制备。目前用于培养牛支原体的液体培养基主要有牛心汤培养基、改良KM2培养基和改良Thiaucourt’s培养基等。现有技术培养基培养牛支原体存在培养时间较长、活菌滴度较低、繁殖能力较差等问题。此外，现有技术培养基中血清含量较高，一般在10%～20%之间，一方面增加了制苗成本，另一方面，过量的血清制备的疫苗增加了异源血清对牛体的过敏应激反应而影响疫苗的免疫效果。降低培养基中的血清含量越来越受到生产企业和研究者的关注。单纯降低现有技术培养基中血清含量会导致培养牛支原体抗原滴度低10～100倍左右，既达不到免疫所需抗原剂量，又需提高浓缩倍数，实际上增加了生产成本。
中国发明专利2011100012310公开一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该专利的基础培养基组成成分为：脑心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉汤、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸钠、Hank’s液、丙酮酸钠、0.1％酚红溶液、青霉素和去离子水，以使用前加入140～200ml的健康马血清，并需要再加入琼脂。根据其公开的内容，用该专利的培养基培养的猪肺炎支原体培养基活菌滴度可达1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml,并且具有支原体生长速度快、分离的敏感性强,制备方法工艺简单，可操作性强，适合工业化大生产的特点。
中国发明专利201210318816X公开的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该专利包括(1)基础培养基（2）辅助培养基，其中主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，该专利的培养基虽然使用的猪血清较少，但仍需要170ml到180ml。
但由于上述专利用于培养猪肺炎支原体，培养牛支原体时活菌滴度均不高于109ccu/ml，此外，上述专利所需血清量（马血清或猪血清）较大，血清含量均在10%以上；因此，现阶段研究一种能高效培养牛支原体且可以使用更少血清的培养基，已成为牛支原体疫苗研究和生产中急需解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明提供一种可克服现有技术中的不足，既高效又低血清含量的牛支原体液体培养基，以及制备这种培养基的方法。
本发明的用于培养牛支原体液体培养基由基础培养基和辅助培养基混合构成，其中每升的培养基内的基础培养基的组成为：
（1）蛋白胨28.0～33.0 g/L，
（2）葡萄糖6.0～8.0 g/L，
（3）丙酮酸钠5.0～6.0 g/L，
（4）质量浓度为25%的新鲜酵母浸出液110～130 ml/L，
（5）质量浓度为1%的酚红 2.0～2.5 ml/L，
（6）750ml去离子水；
每升的培养基内的辅助培养基的组成为：
（7）质量浓度为3% 的L-谷氨酰胺16～17 ml/L，
（8）质量浓度为10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml/L，
（9）质量浓度为15%的水解乳蛋白32.0-35.0 ml/L，
（10）10 mg/ml的转铁蛋白0.8～1.5 ml/L，
（11）10 mg/ml胰岛素0.8～1.5 ml/L，
（12）马血清50 ml/L，
（13）20万IU/ml的青霉素0.25 ml/L，
培养基的pH值调为7.2～7.4。
本发明的培养基制备方法是：
A．基础培养其的配制
按比例称取和量取蛋白胨、葡萄糖、丙酮酸钠、新鲜酵母浸出液，并将酚红溶入750ml去离子水中，在115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用；
B．辅助培养基的制备
按比例称取和量取L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸、水解乳蛋白、转铁蛋白、胰岛素、马血清、青霉素，用0.22 微米滤膜滤过除菌，充分混合，即得辅助培养基，
C. 培养基的制备
无菌条件下，将基础液基和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000 ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，置4℃保存备用。
本发明的液体培养基在培养牛支原体中的应用。
本发明的一种用于培养牛支原体的液体培养基通过补充牛支原体生长所需的各种营养成分，通过氢氧化钠有效控制培养基中的pH值，有利于牛支原体的生长，活菌滴度达1010CCU/ml，明显高于现有技术培养基（改良KM2培养基培养牛支原体活菌滴度为107 CCU/ml，牛心汤培养基为108 CCU/ml，改良Thiaucourt’s培养基108～109 CCU/ml）。此外，本发明培养基中血清含量仅为5%，为现有技术培养基血清含量的1/4～1/2，低血清培养基可减轻异源血清对牛体的过敏应激反应，提高了生物安全，同时降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1：
1、本发明培养基的制备：
（1）基础培养基的配制
取蛋白胨31.0 g、葡萄糖6.5 g、丙酮酸钠5.0 g、25%新鲜酵母浸出液120 ml、1%酚红 2.5 ml溶入750ml去离子水中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用。
（2）辅助培养基的制备：
取经0.22 微米滤膜滤过除菌的3% L-谷氨酰胺17.0 ml、10%L-半胱氨酸5.0 ml、15%水解乳蛋白33.0ml、转铁蛋白（10 mg/ml）0.8 ml、胰岛素（10 mg/ml）1.5 ml、马血清50 ml、青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml，充分混合，即得辅助培养基。
（3）培养基的制备
无菌条件下，将基础液和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.4，充分摇匀，置4℃保存备用。
、25%的新鲜酵母浸出液的制备方法为：
取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：去离子水以=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8-8.0，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补去离子水至2000 ml，-20℃保存备用。
、1%的酚红溶液的配制方法：
称取酚红1.0 g，置玻璃研钵中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去离子水），研磨至完全溶解。将溶解的酚红吸入100 ml量瓶中，用去离子水小心洗下研钵中残留酚红液至量瓶中，最后补加去离子水至100 ml。
实施例2：
本发明培养基的制备：
（1）基础培养基的配制
取蛋白胨30.0 g、葡萄糖6.5 g、丙酮酸钠5.5 g、25%新鲜酵母浸出液120 ml、1%酚红 2.5 ml溶入750 ml去离子水中，115℃高压灭菌20 min后冷却至室温备用。
（2）辅助培养基的制备：
取经0.22 微米滤膜滤过除菌的3% L-谷氨酰胺16.5 ml、10%L-半胱氨酸6.0 ml、15%水解乳蛋白32.0 ml、转铁蛋白（10 mg/ml）1.2 ml、胰岛素（10 mg/ml）1.2 ml、马血清50 ml、青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml，充分混合，即得辅助培养基。
（3）培养基的制备
无菌条件下，将基础液和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.4，充分摇匀，置4℃保存备用。
对比试验
应用本发明培养基、牛心汤培养基、改良KM2培养基、改良Thiaucourt’s培养基对牛支原体PG45株进行比较试验，试验及结果如下。
一、培养基制备
1、本发明培养基的制备
（1）基础培养基的配制
取蛋白胨30.0 g、葡萄糖6.0 g、丙酮酸钠5.0 g、25%新鲜酵母浸出液110 ml、1%酚红 2.5 ml溶入750ml去离子水中，115℃高压灭菌20min后冷却至室温备用。
（2）辅助培养基的制备：
取经0.22 微米滤膜滤过除菌的3% L-谷氨酰胺16.5 ml、10%L-半胱氨酸6.0 ml、15%水解乳蛋白32.0ml、转铁蛋白（10 mg/ml）1.0 ml、胰岛素（10 mg/ml）1.2 ml、马血清50 ml、青霉素 (20万IU/ml) 0.25 ml，充分混合，即得辅助培养基。
（3）培养基的制备
无菌条件下，将基础液和辅助培养基混合，用灭菌水补齐定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.4，充分摇匀，分装后置4℃保存备用。
2、牛心汤培养基的配制（1000ml）：取 1％水解乳蛋白Hank’s液562.5 ml，混入牛心汤337.5ml、25%新鲜酵母浸出液20 ml、青霉素（20万IU/ml）1ml、1%酚红2.5 ml、10%醋酸铊1 ml、无菌马血清100 ml，充分混合后用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装，置4℃保存备用。
3、改良KM2培养基的配制（1000ml）：将MEM 5 g、葡萄糖0.4 g、丙酮酸钠0.2 g、水解乳蛋白5.1 g、1%酚红2.5 ml溶入700ml去离子水中，加入25%新鲜酵母浸出液20 ml、青霉素（20万IU/ml）1ml、10%醋酸铊1 ml、无菌马血清200 ml，充分混合，用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装，置4℃保存备用。
4、改良Thiaucourt’s培养基的配制（1000ml）：（1）基础液配制：取PPLO肉汤21.0 g、丙酮酸钠2.0 g、葡萄糖1.0 g、0.4%酚红4.5 ml溶于去离子水700ml中，115℃高压灭菌20min，冷却至室温备用。（2）取基础液 700ml，与25%新鲜酵母浸出液100 ml、青霉素（20万IU/ml）1ml、10%醋酸铊1 ml、无菌马血清200 ml，充分混合后用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22 微米滤膜滤过除菌后分装，置4℃保存备用。
5、牛支原体的培养 将牛支原体PG45株（购自美国菌种保藏中心ATCC，编号ATCC 25523）分别接种本发明培养基、牛心汤培养基、改良KM2培养基和改良Thiaucourt’s培养基，种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.4 降至6.8～6.9 时，无菌取出培养物。
三、检测
活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的牛支原体培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10-1-10-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。试验重复3次。
四、结果：
牛支原体接种本发明培养基、牛心汤培养基、改良KM2培养基和改良Thiaucourt’s培养基3次生长试验CCU测定结果，见表1。
3次试验结果显示，在同样条件下，本发明培养基和改良Thiaucourt’s培养基培养牛支原体的生长时间为1天，而牛心汤培养基和改良KM2培养基培养牛支原体的生长时间为2天；牛心汤培养基培养牛支原体3次CCU测定结果均为108 CCU/ml，改良KM2培养基培养牛支原体3次CCU测定结果均为107 CCU/ml，改良Thiaucourt’s培养基培养牛支原体3次CCU测定结果为108～109CCU/ml。本发明培养基培养牛支原体，3次CCU测定结果均为1010 CCU/ml，培养牛支原体活菌滴度明显高于牛心汤培养基、改良KM2培养基和改良Thiaucourt’s培养基。此外，本发明培养基血清含量为5%，为牛心汤培养基（血清含量为10%）血清含量的1/2，为改良KM2培养基（血清含量为20%）和改良Thiaucourt’s培养基培养基（血清含量为20%）中的血清含量的1/4。由以上结果可以看出，本发明培养基培养牛支原体具有生长迅速、培养活菌滴度高、血清含量低的特点，适合于牛支原体的生长培养。