一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）TH‑35及其应用的制作方法

本发明属于土壤污染生物处理技术领域，更具体地，涉及一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TH-35及其应用。

背景技术：

随着现代工业的发展，重金属进入环境导致土壤质量恶化的问题日趋严重。据农业部调查，我国遭受重金属污染的土地面积占污水灌区总面积的 64.8%，严重威胁着农业生产和人类健康。

土壤重金属污染的植物修复以其经济、环境友好、修复量大等优点逐渐为人们所重视。然而，利用植物特别是超富集植物治理污染环境仍存在很多局限性。其中，土壤重金属元素的生物有效性、以及修复植物的生长速度和生物量是影响植物修复效率的关键因素。众多研究表明，土壤重金属多数与各种矿物及有机物相结合，不能直接为植物根系吸收，需要溶解成离子态才能被吸收。

现阶段从矿区及重度污染的土壤中筛选抗重金属污染微生物的的报道较多，包括伯克霍尔德氏菌属，假单胞菌属和芽孢杆菌属。而现有技术中，利用从农田土壤中筛选出的具有根际促生作用的蜡样芽孢杆菌，开发其活化土壤重金属镉功能的研究未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TH-35。

本发明的目的是提供一种上述蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35的应用。

本发明从农田土壤中筛选出一株具有高效活化镉功能的土著微生物，利用其在根际活化土壤矿物养分，促进植物生长的同时使土壤重金属从惰性态转化为生物可利用态，有效地提高植物修复土壤重金属污染的效率。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TH-35，所述菌株于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏地址为中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，保藏编号为GDMCC No.60044。

所述蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35的16S rDNA 序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明同时保护由所述菌株通过发酵等生物工程手段制备得到的菌剂。所述菌剂剂型包括由蜡样芽孢杆菌制备成的颗粒剂、粉剂、溶液、悬乳液或棒剂。

本发明从污染农田根际土壤中筛选出一株具有高效溶镉功能的土著微生物，其分类命名为芽孢杆菌属的蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35。其具有下述性质：

菌落形态学特征：菌体细胞杆状，宽 1.0～1.2微米，长3.0～5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，无荚膜，能运动，菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，在普通琼脂平板培养基上，37 ℃，培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的乳白色菌落。

生理生化特性：革兰氏阳性，接触酶阳性，有机化能营养，酶试验阴性，水解淀粉和酪素，明胶液化，能还原硝酸盐，好氧或兼性厌氧，耐受7%的NaC1浓度。不能利用柠檬酸盐，卵凝脂酶试验为阳性，吲哚试验为阴性，脲酶试验为阴性，酪氨酸水解为阴性，最适生长温度20至45℃，10℃以下生长缓慢，50℃时不生长。

本发明的高效溶镉菌-蜡样芽孢杆菌通过溶解土壤中难溶的碳酸镉和磷酸镉等，提高镉的活性，促进超累积植物对土壤中镉的吸收。

本发明从根际土壤中筛选出具有活化镉功能的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，并以Bacillus cereus为菌种发酵培养制备得到溶镉菌剂，该溶镉菌剂能够有效溶解土壤碳酸盐结合态、磷酸盐结合态等主要结合形态镉，在促进植物生长的同时活化土壤重金属镉，有效地提高了超累积植物修复土壤重金属镉的效率。

将本发明提供的供试菌株蜡样芽胞杆菌与不接菌的进行吸收镉含量的对比，植物籽粒上部与根部吸收的镉含量分别比不接菌对照增加 29.11%和36.60%。

本发明提供的溶镉菌剂不存在在生产过程中向环境排放污染物，是真正意义上的环保型土壤改良剂。且本发明提供的溶镉菌剂的制备方法，生产工艺简单，生产效率高，具有良好的经济效益和社会效益。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一株可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35，所述蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35能够显著促进植物生长的同时活化土壤重金属镉，且在活化过程中环保无毒，在制备土壤修复型菌剂中具备极大的应用前景。

附图说明

图1为蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35在难溶磷酸盐固体培养基上生长5天的形态特征图。

图2为蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35的扫描电镜照片图。

图3为蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus TH-35的16SrRNA系统发育树图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 菌株的分离与鉴定

本发明提供的一株高效溶镉蜡样芽孢杆菌，是通过以下方式筛选而成。采集受重金属镉污染的苋菜根际土，按照平板稀释法，称取10克新鲜土壤样品于含有90 mL 无菌水和玻璃珠的250 mL锥形瓶中，制成菌悬液，稀释至10^-4-10^-6倍，涂布于固体培养基上，28℃倒置培养3-5天。待平板上长出单菌落后，挑取具有明显溶磷圈的单菌落多次划线纯化（图 1），分离获得一株细菌，编号TH-35。所述菌株于2016年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.60044。

扫描电镜观察鉴定：

将纯化后的菌株TH-35接入含有10 mL 的营养肉汤培养基培养过夜。吸取800 μL 菌液经8000 rpm 离心3~5 min，去上清液，加入500 μL PBS 溶液洗菌3 次。在收获的菌体沉淀中加入1 mL 的2.5% 戊二醛充分混匀，4℃静置过夜。然后再次经8000 rpm 离心3~5 min，去上清液，加入500μL PBS 溶液洗菌3 次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90% 和100% 的梯度乙醇中脱水2 次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000rpm 离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2 次，每次20 min，方法同上述乙醇脱水过程。经过CO₂干燥后制片观察。图2可见在扫描电镜下TH-35菌体呈短杆状，长约3-4微米，宽约1-1.2微米。

TH-35菌株的16S rRNA 分子鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA 通用引物对该菌基因组进行PCR 扩增。PCR 产物经测序（由广州美格生物完成测序）后，将测序结果与GenBank 中已报道的其他菌株的16S rDNA 序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析（见图3）。结合其形态特征和生理生化指标,与蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）最为相似，因此本发明分离获得的高效溶磷溶镉菌鉴定为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。

实施例2 菌株TH-35对碳酸镉的活化能力测定

筛选得到的菌株TH-35通过下述实验证实有较好的活化碳酸镉的作用。将4℃斜面保存的Bacillus cereus TH-35活化，接种于活化培养基上，培养24h。挑取活化培养基上的溶镉菌接种于富集培养基中，28℃，150r/min，培养14-18h。得到富集液或制成菌剂，通过平板计数菌体数量可达到10¹⁰CFU/ml。活化培养基为肉汤蛋白胨培养基。将富集液按2%接种于溶镉培养基中（不含水溶性镉离子），于28 ℃，150r/min恒温培养箱中培3天，同时设无菌对照。3天后结束培养，培养液经4000r/min离心，10min。原子吸收分光光度计测Cd²⁺，得出水溶性镉的含量20.03mg/L，对应的溶镉率为51%，相比于无菌对照水溶性镉离子含量9.91mg/L，高出2.0倍，证明该菌株具有较强的溶镉的能力。培养基组分为：NaCl 0.3g；MgSO₄·H₂O 0.3g；MnSO₄·4H₂O 0.03g； KCl 0.3g；(NH₄)₂SO₄ 0.5g；FeSO₄·7H₂O 0.03g；Ca(NO₃)₂ 0.15g；Ca₃(PO₄)₂ 0.668g；CdCO₃ 0.060g；葡萄糖1g；去离子水1000ml，pH 7.0-7.5。

实施例3：菌株TH-35活化磷酸镉的能力测定

筛选得到的菌株TH-35通过下述实验证实有较好的活化磷酸镉的能力。将4℃斜面保存的菌Bacillus cereus TH-35活化，接种于活化培养基上，培养24h。挑取活化培养基上的溶镉菌接种于富集培养基中，28℃，150r/min，培养14-18h。得到富集液或制成菌剂，通过平板计数菌体数量可达到10¹⁰CFU/ml。活化培养基为肉汤蛋白胨培养基。将富集液按2%体积比接种于溶镉培养基（无水溶性镉离子）中，于28 ℃，150r/min恒温培养箱中培养3天，同时设无菌对照。3天后结束培养，培养液经4000r/min心，10min。原子吸收分光光度计测Cd²⁺，得出水溶镉离子的含量为29.55mg/L，对应的溶镉率为40.1%，相比于无菌对照水溶性镉离子含量9.91mg/L，高出2.98倍，可知该菌株具有较强的溶解磷酸镉的能力。培养基组分为：NaCl 0.3g; MgSO₄·H₂O 0.3g; MnSO₄·4H₂O 0.03g; KCl 0.3g; (NH₄)₂SO₄ 0.5g; FeSO₄·7H₂O 0.03g; Ca(NO₃)₂ 0.15g；Ca₃(PO₄)₂ 0.6012g；Cd₃(PO₄)₂0.1136g；葡萄糖1g；去离子水1000ml，pH7.0-7.5。

实施例4：高效溶镉菌剂提高超累积植物对镉的吸收

取镉污染土（全镉含量2.28mg/Kg）2.5Kg/每盆钵，加入去离子水使其含水量为田间持水量的60%。保持2天，每盆播种籽粒苋10粒，10天之后生长稳定，约8厘米，4片叶子，间苗，每盆留4株苗，每隔7天投加30ml含菌浓度为1×10¹⁰ CFU/ml的菌剂， 49天后收集植株。植物样品烘干经微波消解后用石墨炉原子吸收分光光度计测镉离子含量。结果表明，供试菌株蜡样芽胞杆菌显著促进植株生长，活化植株根际镉，接蜡样芽胞杆菌菌株处理的籽粒苋地上部（3.06mg/Kg）、根部(6.98mg/Kg)吸收的镉含量分别比不接菌对照(2.37mg/Kg、5.11mg/Kg)增加 29.11%和36.60%。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种可活化土壤中重金属镉的蜡样芽孢杆菌（Bacillus

cereus）TH-35及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1451

<212> DNA

<213> 暨南大学

<400> 1

ggggagtggc ggcagctata catgcagtcg agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga 60

agttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccataagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggataacat tttgaactgc atggttcgaa attgaaaggc 180

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