根瘤菌Scot1305及其在促进植物修复土壤重金属污染中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种根瘤菌（Rhizobium sp.）Scot1305及其在促进植物修复土壤中重金属污染中的应用。

背景技术：

自然界中天然存在的重金属元素，多低于其污染浓度。但由于人类活动如对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成多种重金属如铅、汞、镉、钴（Co）等金属元素在土壤中的过量积累，造成了土壤的重金属污染。在中国，土壤中Co平均含量背景值为11.6mg/kg，大部分土壤中Co含量为5-40mg/kg，而污染土壤中Co含量多超过100mg/kg。目前对重金属Co污染的植物修复技术研究较少，如何有效的进行重金属土壤污染修复成为现今环保工作者关注的焦点,成为了我国各地环保部门需要迫切解决的难题。

目前重金属污染土壤的修复技术，主要包括物理化学技术和植物修复技术，其中植物修复是一种以太阳光为能源，利用植物的生理活性，对土壤中的污染物进行降解、提取或富集，降低土壤污染水平的技术方法。植物修复作为一种原位生物修复方法，近年来在世界范围内发展迅速。相对于传统理化方法，该方法优势明显: 成本低、工程量少、修复作用长期有效、不易带来二次污染。该方法的限制条件在于：重金属污染物本身多具备生物毒性，可对植物的生长造成多种不利影响：抑制植物株高和生物量，提升植物组织内部的氧化胁迫，造成植物的代谢和生长障碍，从而降低植物修复重金属污染的效率，甚至在修复效应呈现之前即使植物死亡。

微生物强化技术对植物修复具有多种强化效果，可缓解重金属对植物的胁迫作用，促进植物的生长状态，增加植物对重金属吸附量，增强修复植物对不同污染类型土壤的适应性。如氧化微杆菌（Microbacterium oxydans AY509223）接种到庭芥（Alyssum murale）根部，可将其叶片富集Ni含量从261.3mg/kg提升至430.7mg/kg。冷酷草芽孢杆菌（Psychrobacter sp. SRS8）接种蓖麻和向日葵后，可促进生长并提高植物在镍污染土壤上的Ni富集含量。如申请号为CN201410828557.4的专利申请中公开了名称为草木犀中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020的应用，该根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020在过量重金属胁迫条件下，对植物的生物量、株高、总N含量、重金属吸收量都有不同程度的提高作用。根瘤菌S.meliloti CCNWSX0020与其宿主植物天蓝苜蓿所建立起来的共生固氮体系在土壤重金属污染的生物修复中具有一定的应用潜力。该菌可以促进宿主植物吸附土壤中的铜、铅、锌、镍、镉、Co或银且其对铜的吸收量增加了120.4%，但该申请中使用的菌株为苜蓿原生共生菌株，其生物学功能实际更偏向于促进植物生长。上述研究证明，微生物强化技术对土壤中重金属修复具重大意义，但是其目前发现的确实有效的微生物菌种少，修复效果差，因此需要发掘更多种类，效果更好的能与植物形成共生体系并能促进宿主植物吸收土壤中重金属元素的微生物菌株。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有技术中植物修复中植物重金属毒害严重，修复效能低的问题，并针对中国重金属Co对土壤的污染现状，提供一种根瘤菌Scot1305，

根瘤菌Scot1305的分类命名为：根瘤菌，拉丁学名为：Rhizobium sp.于2015年12月24日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCCNo.11933，保存单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该根瘤菌能与十字花科植物及豆科植物形成共生体系，保护植株内部的氧化还原稳定性，促进宿主植物持续吸收土壤中的Co，增强土壤修复效果，也为采用微生物强化技术修复土壤提供更多的技术选择。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

建立根瘤菌Scot1305与植物的共生体系，利用该根瘤菌菌株具有的固氮功能、铁载体分泌能力、溶解磷能力、以及对植物生育酚合成关键酶编码基因转录过程的保护作用，实现对土壤Co污染植物修复的强化作用。该菌株可在Co污染土壤中与植物共生，可持续促进植物地上部分对重金属Co的提取和富集，最终实现土壤中的Co含量达到环境安全标准。

发明人在研究中发现，根瘤菌Scot1305与不同的植物建立共生体系来促进植物吸收土壤中的Co污染效果不同，为了建立更好的，更有效的根瘤菌Scot1305与植物的共生体系，经过大量的研究，发现采用十字花科植物，包括苜蓿类(Medicago )、芥菜类（Brassica juncea），以及豆科植物的大豆类植物 (Soybean)与根瘤菌Scot1305建立共生体系效果优良。

根瘤菌Scot1305与植物形成共生体系的方法是使用根瘤菌Scot1305感染植物。根瘤菌Scot1305感染植物是在种子阶段、植物的幼苗阶段和成年植物阶段中的任一阶段进行。：根瘤菌Scot1305感染植物种子的方法是用OD₆₀₀为0.8～1.5的根瘤菌Scot1305菌液浸泡植物种子0.5～1h，其中种子与菌液的质量体积比为=1：（2～3）。 根瘤菌Scot1305感染植物幼苗的方法为将植物幼苗根系浸泡于OD₆₀₀=0.8～1.5的根瘤菌Scot1305菌液中0.5～1 h。

本发明的有益效果如下：

1、本发明在现有的微生物加强技术基础上，开拓了一种的新的能与植物形成共生体系从而加强植物吸收、富集土壤中Co污染的根瘤菌Scot1305， 该菌可抑制植物生育酚合成限速酶编码基因TC （生育酚环化酶）在Co胁迫下发生的转录突变，保护植物生育酚的正常合成以及植物抗氧化非酶系统的活力，提高植物对重金属Co的耐受能力；同时提升植物组织中的Co富集含量，实现了更好的土壤修复效果。

2、本发明所述的根瘤菌Scot1305，可以与十字花科植物及大豆类植物共生诱导形成根瘤组织，为植物提供氮素营养，促进植物的营养代谢，提高植物生物量和土壤修复效果。该菌株属于植物促生土壤菌株，可在根际环境中持续合成铁载体。

3、本发明方法选用了栽种领域广泛、生物量大的十字花科及豆科植物与根瘤菌Scot1305建立共生体系，进行土壤重金属Co的治理，使修复植物的选择面更加宽广，增强了该项技术的可实现性。且每年可收割植株地上部分5-6次， 植物富集Co的地上部分可集中填满或焚烧，无二次污染危险。修复过程中为原位修复，不破坏土壤的理化结构，修复完成后可改善土肥力。

说明书附图

图1为本发明根瘤菌Scot1305细胞形态图；

图2为根瘤菌Scot1305生长曲线图；

图3为根瘤菌Scot1305生长素合成能力图；

图4为根瘤菌Scot1305的16S –IGS序列PCR产物电泳图；

图5为根瘤菌Scot1305菌株的系统进化树。

图6 为根瘤菌Scot1305菌株接种后苜蓿TC基因高分辨率溶解曲线（HRM）

本发明的根瘤菌（Rhizobium sp.）Scot1305于2015年12月24日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为CGMCCNo.11933，保存单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

下面结合具体实施方式说明本发明 。

实施例一

根瘤菌Scot1305的分离培养、理化特征及对植物生育酚合成关键酶的保护作用。

本发明根瘤菌Scot1305筛选于四川攀枝花拉拉铜矿地区的豆科植物山蚂蟥样本。

1、根瘤菌Scot1305的形态特征：

通过分离纯化从山蚂蟥根瘤中筛选得到1株根瘤菌，将其菌编号为Scot1305。Scot1305在YEM培养基（按质量配比为：甘露醇10.0g，酵母粉1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.2g，NaCl0.1g，CaCl₂溶液（0.325g/L）2mL，FeCl₃.6H₂O溶液（0.01g/mL）1mL，微量元素溶液1mL，加超纯水至1L，pH7.0～7.2。微量元素溶液（g/L）：H₃BO₃2.86g，MnSO₄1.81g，ZnSO₄0.22g，CuSO₄0.80g，H₂MoO₂0.02g）平板上培养36h后，可形成直径0.8～1.5 mm的菌落, 菌落为圆形，表面凸起光滑, 半透明, 边缘整齐。经染色镜检，该菌为革兰氏阴性，菌体呈长杆状（0.5～0.7μm×1.5～6.3μm），因生长时期的不同，大小略有差异。

2、菌株Scot1305的生理生化特征：

菌株Scot1305可利用甘露醇作为固体培养基唯一碳源，在0.5%的BTB（溴化麝香草酚蓝指示剂）YEM固体培养基上培养显黄色，通过生长曲线检测该菌株代时为4.82h，见图2。通过铬天青S (CAS Chromeazurol S)检测液分析，菌株Scot1305的嗜铁素相对分泌量为去离子水对照样本的100.52%；通过钼睇抗显色液分析，菌株的溶解磷能力为97.21 mg/L；在400mg/L L-trp底物环境中，菌株Scot1305的IAA（生长素）合成能力较弱，仅为为1.70mg/L，见图3。

3、菌株Scot1305的分子鉴定结果：

以菌株Scot1305基因组DNA为模板，利用细菌16S –IGS序列设计引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序分析。分别将上下游测序结果的5‘端减去50bp，取其后750bp可信区域进行序列拼接，获得1361bp的拼接结果，如SEQ ID No：1 所示，菌株Scot1305的16S –IGS序列PCR产物电泳结果见图4。测序工作委托英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。根据GeneBank序列同源性比较，菌株Scot1305与 Rhizobium sp.（GenBank登录号为KP219136.1）同源性为99%，与草木犀中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti存在明显进化差异，分属于不同属的根瘤菌菌株，该菌株的16S –IGS序列系统进化树见图5。

结合其形态特征和生理生化特性结果及同源性分析，初步将该菌鉴定为根瘤菌（Rhizobium sp.）。

4、菌株Scot1305接种对植物生育酚合成关键酶的保护作用：

以未接种和接种根瘤菌Scot1305的植物作为实验材料，分别提取RNA并合成第一链cDNA模板。以植物生育酚环化酶基因TC为目标，使用引物组合TC248F和TC387R进行高分辨率溶解曲线（HRM）分析，TC248F序列为：5’-CAACTTCGCACCCCTCATAG-3’，TC387R序列为：5’-CGAAACGCAGGATTCTCAAC-3’，HRM分析结果见图6。未胁迫植株中TC基因片段溶解曲线峰值为80℃，Co胁迫条件下TC基因片段峰值降至78℃，代表TC序列已经发生了点位突变。接种Scot1305后，即使在Co胁迫下，TC基因片段的溶解曲线峰值仍可维持在80℃。结果表明接种Scot1305能抑制TC基因受Co胁迫在转录过程中产生的点位突变。

实施例二：使用根瘤菌Scot1305模拟修复土壤中重金属Co污染

（1）种苗准备：供试植物为豆科植物——紫花苜蓿Medicago sativa，分为接菌组和对照组两组，种子无菌化处理方法为：70%乙醇消毒1min，0.1%升汞浸泡5-10min，无菌水冲洗3-5次。接菌组种子使用OD₆₀₀=1.0的根瘤菌Scot1305菌液50mL浸泡30-60min；对照组种子用50mL无菌水浸泡同样时间，转入培养基质。

（2）栽培基质：培养基质为50%椰土+40%营养土+10%珍珠岩，121℃高压蒸汽灭菌2h，灭菌后基质与1/2 MS液体培养基按照1:3(w/v)混合,用于植物的栽培。

（3）生长管理：植物萌发期间，每穴每周施1/2 MS液体培养基20mL。萌发1周后，每穴每周施50mL含100mg/L氯化Co（CoCl₂）的1/2 MS液体培养基溉。培养温度为23℃，湿度40%-50%，照度2000Lux，生长期为60天。

上述接菌组和对照组在常规条件和胁迫条件下分别做重复3个重复组。

收割地上部分，测定重金属Co富集情况并将结果统计在下表1中，表中单位为mg/kg。

表1：

由上表1结果可知，对照组常规条件下植物组织Co含量平均为3mg/kg DW（Dry weight干重），胁迫条件下平均为149mg/kg DW；接菌组常规条件下Co含量平均为5mg/kg DW，胁迫条件下平均为530mg/kg DW。接菌组植株富集Co的效果是对照组的335.7%。

实施例3：使用根瘤菌Scot1305修复土壤中重金属Co污染

（1）种苗准备：供试植物为紫花苜蓿Medicago sativa，分为对照组、污染组和接菌组三组。种子无菌化处理方法为：70%乙醇消毒1min，0.1%升汞浸泡5-10min，无菌水冲洗3-5次。播于温室大棚试验田中，经生长8月后割去地上部，挖出种根，挑选大小均匀的植株，清洗干净后备用。

（2）试验土壤：污染组和接菌组采用成都市鹿溪河流域河岸土壤，施加氯化钴（CoCl₂）混合均匀，土壤自然放置18月完全熟化。污染土壤中Co平均含量为231.1mg/kg，对照组土壤为同批采样土壤，但不添加CoCl₂。

（3）移栽和管理：植物移栽前，接菌组每穴施20mL菌液（OD₆₀₀=1.0），接菌组种苗根系浸泡于菌液中30min，每盆种植15株植株，每个处理设置3盆重复。对照组和污染组使用无菌水替代菌液，其他操作相同。各组植株生长期均为50天，常规管理。

（4）收获后检测植株地上部Co含量并将结果统计在下表2中，检测修复土壤中Co含量，并统计在下表3中，表中单位为mg/kg。

表2：

由上表2数据可得出，植株地上部平均Co含量为：对照组19.21mg/kg DW，污染组22.14mg/kg DW，接菌组32.84mg/kg DW。从结果可知，植物对Co的富集较对照组增加70.9%，较污染组增加48.3%。

表3：

由上表3数据可以得出，污染组土壤修复后Co平均含量为223.1mg/kg；接菌组土壤修复后Co平均含量为216.7mg/kg。接菌组植株单季Co清除率为6.23%，较污染组植株Co清除率平均增加了3.25%。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省原子能研究院

<120> 根瘤菌Scot1305及其在促进植物修复土壤重金属污染中的应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1361

<212> DNA

<213> 根瘤菌（Rhizobium sp.）

<400> 1

cgtggttagc tgcctccttg cggttagcgc actaccttcg ggtaaaacca actcccatgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcagcatgc tgatctgcga 120

ttactagcga ttccaacttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagatggc 180

ttttggagat tagctcgacc tcgcggtctc gctgcccact gtcaccacca ttgtagcacg 240

tgtgtagccc agcccgtaag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctctcggc 300

ttatcaccgg cagtcccctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag ggcgagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc 420

acctgtcacc gatccagcst awctgaagga caatgtstcc acwgtccgcg atcgggatgt 480

caagagctgg taaggttmtg cgcgttgctt cgaattaaac cacaygctcc accgyktgtg 540

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cagtaatgga ccagtgagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccgaatatc tacgaatttc 780

acctstacac tcggaattcc actcacctct tccatactct agatcgacag tatcaaaggc 840

agttccagag ttgagctctg ggatttcacc cctgactgat cgatccgcct acgtgcgctt 900

tacgcccagt aattccgaac aacgctagcc cccttcgtat taccgcggct gctggcacga 960

agttagccgg ggcttcttct ccggataccg tcattatctt ctccggtgaa agagctttac 1020

aaccctaagg ccttcatcac tcacgcggca tggctggatc aggcttgcgc ccattgtcca 1080

atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggctg 1140

atcatcctct cagaccagct atggatcgtc gccttggtag gcctttaccc caccaactag 1200

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cccgtctgcc gctccccttg cggggcgctc gacttgcatg g 1361