一种巨大芽孢杆菌B16及其菌剂和菌剂制备方法与流程

本发明涉及微生物菌剂
技术领域：
，具体涉及一种巨大芽孢杆菌B16及其菌剂和菌剂制备方法。
背景技术：
：农业生产长期依赖化学肥料，不仅浪费大量不可再生资源，还导致土质变差、农产品品质下降和环境污染等环境问题，极大影响了人类的健康生存。巨大芽孢杆菌是一种解磷促钾固氮细菌，能够很好的降解土壤中不能被植物利用的磷、钾，提高土壤肥力，同时固定空气中的氮气，促进作物增产。但现有的巨大芽孢杆菌不具有固氮酶活性和分泌生长素的能力，导致巨大芽孢杆菌在农业生产中的应用受到限制。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌B16，其具有固氮酶活性和分泌生长素吲哚乙酸的功能。本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌B16菌剂，具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌B16菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产。本发明的目的通过以下技术方案实现。一种巨大芽孢杆菌B16，所述巨大芽孢杆菌B16的分类命名：巨大芽孢杆菌B16BacillusmegateriumB16，保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCollection)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年12月15日，保藏编号：CCTCCNO：M2015750。所述巨大芽孢杆菌B16具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为698.367-880.165nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量为400-600mg/L。固氮酶活性测定1、试验方法采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5mL半固体培养基的10mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24h后，注入1/10体积的10%乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小：C=(hx×c×V)/(24.9×hs×t)(2.1)其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(mL·h)]。2、试验结果结合公式(2.1)和固氮酶活性测定图4得知，固氮酶活性为698.367-880.165nmol/(mL·h)。由此可以说明，巨大芽孢杆菌B16在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。生长素定性含量测定（1）挑取菌株分别接种（OD600=1.0，0.5mL菌悬液）到盛有50mLKing液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。（2）接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。（3）将上述在King液体培养基上生长3d的菌悬液50µL置于透明离心管中，同时加50µL比色液。（4）设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50µL浓度为10mg/L的植物生长激素（IAA），同时加50µL比色液。阴性对照中加50µLKing液体培养基，同时加50µL比色液。（5）将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。培养基为King培养基(1L)；试剂配方为蛋白胨20g，K2HPO41.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。生长素定量测定参照Riberio等的方法略加改动。菌株B16接种到含有1g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，振荡培养48h。将培养液10000r/min离心5min，取100mL上清液加到96孔板中，与100mLSalkowski’s试剂（1mL0.5mol/LFeCl3和49mL35%高氯酸）混匀，室温静置30min，在波长530nm下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的IAA标准品制作标准曲线，测定结果见表1。表1菌株B16IAA测定结果菌株B16D2D5D68IAA浓度（mg/L）485.68364.20294.16531.44从表1和图5可以看出，巨大芽孢杆菌B16的生长素浓度为485.68mg/L，因此，可以判断巨大芽孢杆菌B16在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养利用种子/发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物液体发酵液；（4）B16发酵液制备取B16试管斜面1支，用无菌水冲洗后，将单菌落接种于装有300-350ml灭菌的种子培养基中，设置摇床培养温度为30-35℃、转速为180-200rpm，培养36-42小时，即得到种子液。将种子液在无菌条件下接种于装有32-35L发酵培养基的发酵罐中培养42-48小时，得到液体发酵液。检查液体发酵液含B16活菌数为65-72亿/ml，备用。采用50L全自动发酵罐液体培养B16。发酵罐培养条件设置如下：温度pH装液量接种量转速通气量培养时间30℃7.1-7.435L300ml180rpm1.2vvm48h（5.1）巨大芽孢杆菌B16液体菌剂制剂化取适量液体发酵液，分装于无菌盖瓶中，每个盖瓶中称取添加乙酸钠6-10g，在室温环境下，放置，按照国家标准《微生物肥料》（GB20287-2006）规定的方法测定其活菌数为2.0-6.0亿/g，得到巨大芽孢杆菌B16液体菌剂。（5.1.1）试验设置处理一：取液体发酵液500ml，分装于2个500ml无菌蓝盖瓶中；处理二：取液体发酵液500ml，分装于2个500ml无菌蓝盖瓶中，每个蓝盖瓶中称取添加乙酸钠7.5g；处理三：取液体发酵液500ml，分装于2个500ml无菌蓝盖瓶中，每个蓝盖瓶中称取添加蔗糖7.5g。上述三个处理结果均放置在室温环境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照国家标准《微生物肥料》（GB20287-2006）规定的方法测定活菌数。（5.1.2）试验结果由此可以看出，处理二中的巨大芽孢杆菌B16液体菌剂活菌计数结果最佳。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养利用种子/发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）B16发酵液制备取B16试管斜面1支，用无菌水冲洗后，将微生物菌液接种于装有300-350ml灭菌的种子培养基中，设置摇床培养温度为30-32℃、转速为180-200rpm，培养36-42小时，即得到发酵种子液。将种子液在无菌条件下接种于装有30-35L发酵培养基的发酵罐中培养42-48小时。检查发酵液含B16活菌数为65-72亿/ml，备用。（5.2）B16固体菌剂原粉制备采用离心机，离心，获得B16纯菌体，用碳酸钙进行吸附B16纯菌体，置于烘箱干燥，粉碎机打粉即为B16固体菌剂原粉，测定活菌数为180-190亿/g，备用；具体地，采用BACKMAN离心机，8000rpm离心15-20min，获得B16纯菌体。用碳酸钙进行吸附B16纯菌体，置于45-60℃烘箱干燥6-8小时，粉碎机打粉即为B16固体菌剂原粉。具体地，测定活菌数为186.9亿/g，备用；（6.1）巨大芽孢杆菌B16粉状菌剂制剂化将菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾与磷酸一铵按比例混合，在室温环境下放置，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数为0.2-2.0亿/g，得到巨大芽孢杆菌B16粉状菌剂。优选地，菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾与磷酸一铵的混合质量比为1-2：46-90：1-2：1-2：1-2。（6.1.1）试验设置处理一：称取菌体原粉10g，与490g安琪酵母有机质混合；处理二：称取菌体原粉10g，与475g安琪酵母有机质、5g硫酸铵、5g硫酸钾、5g磷酸一铵混合；处理三：称取菌体原粉10g，与460g安琪酵母有机质、10g硫酸铵、10g硫酸钾、10g磷酸一铵混合；处理四：称取菌体原粉10g，与445g安琪酵母有机质、15g硫酸铵、15g硫酸钾、15g磷酸一铵混合。上述四个处理结果均放置在室温环境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数0.3-3.9亿/g。（6.1.2）试验结果：处理三中的巨大芽孢杆菌B16液体菌剂活菌计数结果最佳。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；巨大芽孢杆菌B16单菌落如图1所示。（3）培养基培养利用种子/发酵培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）B16发酵液制备取B16试管斜面1支，用无菌水冲洗后，接种于装有300-350ml灭菌的种子培养基中，设置摇床培养温度为30-32℃、转速为180-210rpm，培养36-42小时，即得到发酵种子液。将种子液在无菌条件下接种于装有30-35L发酵培养基的发酵罐中培养42-48小时。检查发酵液含B16活菌数为65-72亿/ml，备用。（5.2）B16固体菌剂原粉制备采用BACKMAN离心机，8000rpm离心15-20min，获得B16纯菌体。用碳酸钙进行吸附B16纯菌体，置于45-60℃烘箱干燥6-8小时，粉碎机打粉即为B16固体菌剂原粉。测定活菌数为180-190亿/g，备用；（6.2）巨大芽孢杆菌B16颗粒菌剂制剂化将菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾与磷酸一铵、膨润土按比例混合，在室温环境下放置，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数0.2-2.0亿/g。优选地，菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾、磷酸一铵、膨润土的混合质量比为1-2：41-80：1-2：1-2：1-2：5-10。（6.2.1）试验设置处理一：称取菌体原粉10g，与440g安琪酵母有机质、50g膨润土混合造粒；处理二：称取菌体原粉10g，与410g安琪酵母有机质、10g硫酸铵、10g硫酸钾、10g磷酸一铵、50g膨润土混合造粒；上述2个处理结果均放置在室温环境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数。（6.2.2）试验结果：处理二中的巨大芽孢杆菌B16液体菌剂活菌计数结果最佳。所述步骤（1）分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取上述样品液与磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。更具体地，分离、筛选的方法为：从广东省东莞市南城区人民公园花坛500g土样，加入3L含0.01%吐温80的无菌水，震荡10min，静置半个小时，取上清液于20℃下8000rpm离心20min。弃上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01%吐温80的无菌水悬浮，液体于20℃下5000rpm离心5秒钟，去沉淀，将上清液倒入一个干无菌离心管中于20℃下6000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用10mL的pH7.0磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取1mL上述样品液与9mL磷酸缓冲液悬浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释的菌悬液置于75℃水浴加热15min，自然冷却后吸取100μL涂布于无氮培养基，30℃培养36-48小时获得含巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落。所述步骤（1）中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，FeSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，pH7.1-7.4。本发明的分离筛选培养基为改良无氮培养基。所述纯化保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到枯草芽孢杆菌B16单菌落。将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。巨大芽孢杆菌B16保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号码为：CCTCCM2015750。（2）纯化保存培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，纯化保存培养基的pH为7.0-7.4。所述步骤（3）培养基培养中，培养基由以下质量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，FeSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，培养基的pH为7.1-7.4。所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括有以下步骤：（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。芽孢染色及其革兰氏染色革兰氏染色和芽孢染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可以缩小鉴定范围。未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察。革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属于革兰氏阳性（G+）或者革兰氏阴性菌（G-），用以分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在安全隐患，在农业微生物应用过程中直接高温灭菌后舍弃结构特征。芽孢染色将菌体内的芽孢进行染色，可以直观观察芽孢的大小、位置、形状等特点，进一步缩小其鉴定范围。芽孢杆菌具有保质期长，易于存放的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。、革兰氏染色（1）涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。（2）初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。（3）媒染：先用新配的碘液（碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL）冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗。（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒后，立即用流水冲洗。（5）复染：滴加1滴番红染色液，染3－5min，水洗后用吸水纸吸干。（6）镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。、芽孢染色在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1-2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。用蒸馏水冲洗掉染液，风干后，将载玻片置于光学显微镜下观察。如图2和图3所示，通过革兰氏染色和芽孢染色结果可以看出，巨大芽孢杆菌B16为革兰氏阳性菌，杆状，含有芽孢。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂，由上述一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法制备而成。本发明的有益效果：（1）本发明以巨大芽孢杆菌B16为出发菌株，对其固氮酶活性以及分泌生长素能力进行测定，发现菌株B16具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。可以通过自生固氮减少水稻、玉米等禾本科作物的生长过程中所需要的氮素添加量，还能够分泌生长素（吲哚乙酸）促进植物生长。所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为698.367-880.165nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生吲哚乙酸的分泌量为400-600mg/L。在微生物肥料应用领域具有十分可观的经济价值。（2）本发明利用该巨大芽孢杆菌B16将其制备成三种B16菌剂，即液体菌剂、粉状菌剂和颗粒菌剂，为其投入到农业生产应用中提供了便利。（3）本发明利用该巨大芽孢杆菌B16将其制备成三种B16菌剂，具备同类行业产品不具备的多样性，同时保证了该微生物肥料对不同作物的生长环境的强效适应性。附图说明利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。图1为分离得到的巨大芽孢杆菌B16单菌落在显微镜下放大10×100倍的菌落图。图2为巨大芽孢杆菌B16革兰氏染色结果图。图3为巨大芽孢杆菌B16芽孢染色结果图。图4为巨大芽孢杆菌B16固氮酶活性测定结果图。图5为巨大芽孢杆菌B16IAA比色效果图。具体实施方式结合以下实施例对本发明作进一步描述。实施例1本实施例的一种巨大芽孢杆菌B16，所述巨大芽孢杆菌B16保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015750。所述巨大芽孢杆菌B16具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为698.367nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生吲哚乙酸的分泌量为400mg/L。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养利用培养基发酵培养单菌落，为培养菌体发酵液做准备；（4）B16发酵液制备将单菌落接种于种子培养基中，设置摇床培养温度、转速培养，即得到种子液，将种子液在无菌条件下接种于含有发酵培养基的发酵罐中培养，得到液体发酵液；（5.1）巨大芽孢杆菌B16液体菌剂制剂化取适量液体发酵液，分装于无菌盖瓶中，每个盖瓶中称取添加乙酸钠8g，在室温环境下，放置，按照国家标准《微生物肥料》（GB20287-2006）规定的方法测定其活菌数为2.0亿/g，得到巨大芽孢杆菌B16液体菌剂。所述步骤（1）分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取上述样品液与磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。所述步骤（1）中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO31.0g，MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO41.0g，NaCl0.1g，FeSO4·7H2O0.001g，NaMO4·2H2O0.05g，蔗糖5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH7.1。实施例2本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括有以下步骤：（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂，由本实施例所述的一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法制备而成。本实施例的其余内容与实施例1相同，这里不再赘述。实施例3本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为720.138nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生吲哚乙酸的分泌量为420.53mg/L。本实施例的巨大芽孢杆菌B16液体菌剂，其活菌数为4亿/g。本实施例的其余内容与实施例1相同，这里不再赘述。实施例4本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养利用培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）B16发酵液制备将微生物菌液接种于种子培养基中，设置摇床培养温度、转速培养，即得到发酵种子液，将发酵种子液在无菌条件下接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养；（5.2）B16固体菌剂原粉制备发酵罐中培养后的产物采用离心机，离心，获得B16纯菌体，用碳酸钙进行吸附B16纯菌体，置于烘箱干燥，粉碎机打粉即为B16固体菌剂原粉，测定活菌数为183.86亿/g，备用；（6.1）巨大芽孢杆菌B16粉状菌剂制剂化将菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾与磷酸一铵的混合质量比为1：50：1：1：2，在室温环境下放置，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数为0.3亿/g，得到巨大芽孢杆菌B16粉状菌剂。所述步骤（1）中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO31.2g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO41.5g，NaCl0.2g，FeSO4·7H2O0.003g，NaMO4·2H2O0.08g，蔗糖8g，琼脂19g，蒸馏水1000ml，pH7.2。本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。实施例5本实施例与实施例4的不同之处在于：本实施例的所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为750.248nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生吲哚乙酸的分泌量为501.255mg/L。本实施例的巨大芽孢杆菌B16粉状菌剂，其活菌数为1亿/g。本实施例的其余内容与实施例4相同，这里不再赘述。实施例6本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的一种巨大芽孢杆菌B16的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌B16的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌B16单菌落，保存该单菌落备用；（3）培养基培养利用培养基发酵培养单菌落，得到微生物菌液；（4）B16发酵液制备将微生物菌液接种于灭菌的种子培养基中，设置摇床培养温度、转速培养，即得到发酵种子液，将种子液在无菌条件下接种于装有发酵培养基的发酵罐中培养；（5.2）B16固体菌剂原粉制备发酵罐中培养的产物采用离心机，离心，获得B16纯菌体，用碳酸钙进行吸附B16纯菌体，置于烘箱干燥，粉碎机打粉即为B16固体菌剂原粉，测定活菌数为186.93亿/g，备用；（6.2）巨大芽孢杆菌B16颗粒菌剂制剂化将菌体原粉、安琪酵母有机质、硫酸铵、硫酸钾与磷酸一铵、膨润土的混合质量比为2：70：2：2：2：8，在室温环境下放置，按照国家标准《复合微生物肥料》（NY/T798-2004）规定的方法测定活菌数为1.53亿/g，得到巨大芽孢杆菌B16颗粒菌剂。所述步骤（1）中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO31.4g，MgSO4·7H2O1.2g，K2HPO42.0g，NaCl0.4g，FeSO4·7H2O0.005g，NaMO4·2H2O0.1g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.4。本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。实施例7本实施例与实施例6的不同之处在于：本实施例的所述巨大芽孢杆菌B16的固氮酶活性为880.165nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中产生吲哚乙酸的分泌量为600mg/L。本实施例的巨大芽孢杆菌B16颗粒菌剂，其活菌数为0.86亿/g。本实施例的其余内容与实施例6相同，这里不再赘述。本发明的巨大芽孢杆菌B16的16SrDNA基因序列菌种鉴定细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期以来，国际上通用的“正式的”或“官方的”细菌分类方法是以《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难以明确对该菌株进行鉴定。目前，细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结论。其中DNA序列分析的16SrRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段(Kimetal，2004；Prapetal，1997)。核糖体16SrDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用保守区域设计的通用引物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技术的基本原理是从微生物样本中提取16SrDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SrDNA的序列信息，再与16SrDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16SrDNA片段保守区域设计的通用引物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此通过对某菌株16SrDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可的。1、方法：（1）PCR反应体系(25μL)：10×PCRBuffer2.5μLdNTP(2.5mM)m2.0μL引物27F（10μM）0.5μL引物1492R（10μM）0.5μLDNA模板100ngTaq酶(5U/μL)0.5μLddH2O19μL（2）PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环，72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析仪(应用生物系统公司)进行DNA测序。2、测序结果catgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacaagagtaactgcttgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagcta3、同源性分析鉴定本细菌为Bacillusmegaterium，巨大芽孢杆菌。本发明由广东省引进创新创业团队项目资助研发，制得的巨大芽孢杆菌B16及其菌剂具有广阔的市场前景，经济效益高。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。<0001>SEQUENCELISTING<110>东莞市保得生物工程有限公司<120>一种巨大芽孢杆菌B16及其菌剂和菌剂制备方法<130>0<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1416<212>DNA<213>巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)B16的16srDNA基因序列<400>1catgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtga60gtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaatac120cggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttaca180gatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgca240tagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacg300ggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtg360agtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacaagagta420actgcttgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagcc480gcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggc540ggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgg600ggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagaga660tgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcga720aagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgc780taagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctg840gggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgg900agcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgac960aactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtc1020gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta1080gttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtg1140gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat1200ggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcg1260gattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcat1320gccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgt1380aacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagcta1416当前第1页1 2 3