本发明涉及茶叶农药残留检测，具体涉及茶叶中有机磷农药残留的生物安全评估及应用。
背景技术：
茶叶中农药残留是公众非常关注的食品安全问题，我国现行农残检测一般采用仪器分析法，主要采用气相色谱、液相色谱及气质、液质联用的大型仪器进行检测，仪器价格昂贵且操作人员必须具备相当的专业技能，检测周期长，不利于在一线监管部门进行普及。仪器分析法只能对单种农药分别进行检测，不能全面反应食品的生物安全性，而且检测时间长，设备昂贵，操作复杂，不适合大样本快速筛检，也无法对农药进行生物危害性评估。
目前，在茶叶中农残的快速检测方面主要集中在有机磷类农药，应用较广泛的主要是酶抑制法，该法主要利用有机磷类农药对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，采用酶促反应对该类农药进行快速检测，但酶的活性易受pH及其他条件如抑制剂干扰，而产生假阳性，方法的可靠性差。
农药残留筛选方法在确认样品中是否存在农药残留问题是非常有效的；其应用目的是保证待检食品中不含有超过最高残留限量的农药残留，筛选方法缩小检测的范围。
为了解决农药残留检测所存在的问题，建立一种稳定性好、抗干扰性强、操作简便、检测时间短、易学易用、无需专业技术知识的检测方法变得非常重要。人们利用生物测定法方法对农药残留筛查已经进行了许多探索：上世纪60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5h后家蝇死亡率在10％以下即为合格，该方过程简单，无须复杂仪器检测，缺点是检测时间较长，只对部分杀虫剂有反应，准确性较低。微生物法是一个很好的筛查方法，具有如下优点：微生物结构简单，生长速度快，反应灵敏，费用低廉，占用空间相对较小，能较快的作出响应。因此，微生物检测技术具有快速、简便、灵敏的特点，可以满足大样品筛检的要求。
有机磷农药为杀虫剂、杀螨剂，其化学性质不太稳定，多数易氧化、水解、异构化。由于温度、pH值、水分等因素可以加速这些过程的进行。有机磷农药引起中毒的作用机理是抑制了体内的胆碱酯酶，使其失去了分解乙酰胆碱的能力，从而造成体内乙酰胆碱的积累，刺激了中枢神经系统，使各项功能失调，引起生理紊乱，因此对食品中有机磷农药残留的检测是十分必要。农药残留前处理是目前茶产品中农药检测工作的瓶颈和国内外研究的薄弱环节。
目前，测定有机磷农药的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法、酶抑制法、毛细管电泳技术(CE)等。用上述方法检测存在仪器设备复杂、样本前处理和测定操作繁琐的缺陷，不适合大量样本筛检，而且费用高昂，使其推广使用受到限制。微生物法突出优点是简便而经济，不需要复杂的仪器设备，在一般的实验条件下就可以进行，可以对大量样本进行快速初筛。但是，工作菌株对待测物质的敏感性和特异性高低是影响微生物法准确度和精密度的最关键问题。迄今为止，尚无筛选出有机磷农药敏感性高、特异性高的丁酸梭菌工作菌株及其在茶叶中有机磷农药残留筛检应用的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种应用丁酸梭菌WZMC1016作为工作菌株筛检茶叶中有机磷农药残留的微生物方法。
本发明的丁酸梭菌WZMC1016分离于一名浙江省健康人粪便，直或弯的杆菌，0.6-1.2×3.0-7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体，以周生鞭毛运动，孢子卵圆，偏心到次端生，无孢子外壁和附属丝。革兰氏阳性，在老培养物中变成阴性；经常菌淀粉粒阳性。细胞壁含有DH-二氨基庚二酸；葡萄糖是唯一的细胞壁糖。光镜所见符合丁酸梭菌形态。依据《伯杰细菌鉴定手册》，这是梭菌属的典型特征，可判断该菌属于丁酸梭菌。可发酵某些糖，产氢气和丁酸。固体培养基中可见菌落为乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生，多次分离筛选，分离出对有机磷农药敏感的菌株，丁酸梭菌(Clostridium butyticum)WZMC1016，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyticum)，保藏编号为CGMCC No.9831。
本发明筛检茶叶中有机磷农药残留的原理是基于有机磷农药对其敏感的丁酸梭菌WZMC1016具有明显的抑制作用，将茶叶样品点样丁酸梭菌菌层筛检培养基上，厌氧培养18-24小时后，测定其形成的抑菌圈，根据抑菌圈的大小即可判定待测样品中的有机磷农药残留量是否合格。
本发明是建立一种应用丁酸梭菌WZMC1016作为工作菌株筛检茶叶中有机磷农药残留的微生物法，包括步骤：
(1)筛检培养基制备：
蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801mL，琼脂15g，蒸馏水1L，将以上成分加热溶解校正pH 6.5，115℃高压灭菌15-20分钟；
(2)菌悬液制备：
丁酸梭菌WZMC1016接种于营养琼脂的斜面培养基，35±2℃厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，在721分光光度计580nm波长下将光透过率控制为0.7，置2～8℃冰箱中保存；
(3)菌层培养基制备：
取直径约90mm、高16～17mm的平板，注入加热融化的步骤(1)筛检培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；在已凝固的底层培养基上加入步骤(2)菌悬液0.5mL，充分混匀，使在底层上均匀摊布，作为菌层；
(4)样品前处理：
取待检的茶叶样品匀浆组织5g，用无菌1％pH6.0磷酸盐缓冲液20mL稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后于5000r/min离心15min，取上清液作为供试样品液；
(5)样品测定：
在步骤(3)菌层筛检培养基的培养皿中放置直径13±1mm圆滤纸片，用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器在圆滤纸片上滴加步骤(4)供试样品液90μL。每个供试样至少重复2个培养皿，35±2℃厌氧培养18～24小时，抑菌圈直径通过抑菌圈电脑测量分析仪测量；
(6)结果判定：
当抑菌圈≥16mm，判断茶叶样品中有机磷农药残留阳性(+)。
本发明工作菌株为丁酸梭菌WZMC1016，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9831。
本发明的优点及效果：
(1)本发明丁酸梭菌WZMC1016对有机磷农药敏感性高、特异性好，可以作为微生物法筛检有机磷农药残留的工作菌种；
(2)本发明检测方法简便易行，具有灵敏度高，精确度高等特点，在茶叶中最低检测限为0.1mg/kg，低于国家标准的最大残留限量，回收率均大于70％，变异系数在10％以内，符合茶叶有机磷农药残留筛检的准确度和精密度要求，完全适合茶叶有机磷农药残留的筛检。
(3)本发明所筛选出丁酸梭菌WZMC1016对有机磷农药敏感，不仅可以作为微生物法的测试菌，而且还可以反应出农药残留的生物学效应，且具有灵敏、快速、培养时间短、减少来自微生物污染的干扰等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1敏感菌株的筛选
对丁酸梭菌WZMC1016分离鉴定，直或弯的杆菌，0.6-1.2×3.0-7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。以周生鞭毛运动，孢子卵圆，偏心到次端生，无孢子外壁和附属丝。革兰氏阳性，在老培养物中变成阴性；经常菌淀粉粒阳性。细胞壁含有DH-二氨基庚二酸；葡萄糖是唯一的细胞壁糖。光镜所见符合酪酸梭菌形态。依据《伯杰细菌鉴定手册》，这是丁酸梭菌属的典型特征，可判断该菌属于酪酸梭菌。可发酵某些糖，产氢气和丁酸。固体培养基中可见菌落为乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生。筛选出一株丁酸梭菌WZMC1016对有机磷农药具有敏感性，其与同属标准菌株相比，对有机磷农药的敏感性得到提高。菌株对有机磷农药的敏感度≤0.1mg/L，0.1mg/L有机磷农药的抑菌直径大于11mm，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.9831。
实施例2茶叶氧化乐果残留的筛检
(1)筛检培养基制备：
蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801ml，琼脂15g，蒸馏水1L，将以上成分加热溶解校正pH 6.5，115℃高压灭菌15-20分钟；
(2)菌悬液制备：
丁酸梭菌WZMC1016接种于营养琼脂的斜面培养基，35±2℃厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，在721分光光度计580nm波长下将光透过率控制为0.7，置2～8℃冰箱中保存；
(3)菌层培养基制备：
取直径约90mm、高16～17mm的平板，注入加热融化的步骤(1)筛检培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；在已凝固的底层培养基上加入步骤(2)菌悬液0.5mL，充分混匀，使在底层上均匀摊布，作为菌层；
(4)样品前处理：
取待检的茶叶样品匀浆组织5g，用无菌1％pH6.0磷酸盐缓冲液20mL稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后于5000r/min离心15min，取上清液作为供试样品液；
(5)样品测定：
在步骤(3)菌层筛检培养基的培养皿中放置直径13±1mm圆滤纸片，用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器在圆滤纸片上滴加步骤(4)供试样品液90μL。每个供试样至少重复2个培养皿，35±2℃厌氧培养18～24小时，抑菌圈直径通过抑菌圈电脑测量分析仪测量；
(6)结果判定：
当抑菌圈≥16mm，判断茶叶样品中有机磷农药残留阳性(+)。
经过检测，茶叶中氧化乐果农药残留测定方法的线性范围为0.01～2mg/kg，方法添加回收率在77～95％之间，方法的精密度为1～9％。方法快速简单，回收率、精密度灵敏度指标均符合农药残留分析要求，适用于茶叶中多种氧化乐果农药残留的监测。
实施例2茶叶乐果残留的筛检
(1)筛检培养基制备：
蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801ml，琼脂15g，蒸馏水1L，将以上成分加热溶解校正pH 6.5，115℃高压灭菌15-20分钟；
(2)菌悬液制备：
丁酸梭菌WZMC1016接种于营养琼脂的斜面培养基，35±2℃厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，在721分光光度计580nm波长下将光透过率控制为0.7，置2～8℃冰箱中保存；
(3)菌层培养基制备：
取直径约90mm、高16～17mm的平板，注入加热融化的步骤(1)筛检培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；在已凝固的底层培养基上加入步骤(2)菌悬液0.5mL，充分混匀，使在底层上均匀摊布，作为菌层；
(4)样品前处理：
取待检的茶叶样品匀浆组织5g，用无菌1％pH6.0磷酸盐缓冲液20mL稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后于5000r/min离心15min，取上清液作为供试样品液；
(5)样品测定：
在步骤(3)菌层筛检培养基的培养皿中放置直径13±1mm圆滤纸片，用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器在圆滤纸片上滴加步骤(4)供试样品液90μL。每个供试样至少重复2个培养皿，35±2℃厌氧培养18～24小时，抑菌圈直径通过抑菌圈电脑测量分析仪测量；
(6)结果判定：
当抑菌圈≥16mm，判断茶叶样品中有机磷农药残留阳性(+)。
经过检测，茶叶中乐果农药残留测定方法的线性范围为0.01～1mg/kg，方法添加回收率在75～90％之间，方法的精密度为1～8％。方法快速简单，回收率、精密度灵敏度指标均符合农药残留分析要求，适用于茶叶中多种氧化乐果农药残留的监测。
试验1标准品精密度的测定
取浓度为0.1mg/kg，1mg/kg的有机磷农药标准液，分别用移液器移取90μl加入菌层筛检培养基表面，菌层表面放置的四个圆滤纸片(直径13±1mm)上，每个浓度滴加一个圆滤纸片，重复5个培养皿，35±2℃厌氧培养18-24小时。
表2标准品精密度的测定
注：圆滤纸片直径为13±1mm，圆滤纸片下区不长菌
试验结果：0.1mg/kg有机磷农药标准液的变异系数为2.6％，1mg/kg有机磷农药标准液的变异系数为2.5％。变异系数都在10％以内，符合筛检精密度要求。