本发明属于细胞制剂技术领域，特别是涉及一种用于抗衰老细胞制剂的制备方法。
背景技术：
中国正快速步入老龄化社会，目前中国岁以上老年人有约亿。预计2050年中国60岁以上老年人将占三成，老龄化带来的种种困扰和问题更加严重。衰老和死亡是任何物种的个体都难以避免的最终结局,但至今我们对衰老发生机制的理解还相当有限。鉴于其重要性,衰老一直是生物学研究的热点。
骨髓间充质干细胞,是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞,是全身结缔组织的干细胞。大量实验证实在合适的体外分化条件下,不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞等间质细胞,而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞。并且具有移植后不发生排斥反应的特点。随着对的深入研究,目前认为除了具有多向分化潜能,还能在损伤局部反应性分泌多种神经营养因子。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于抗衰老细胞制剂的制备方法，通过将骨髓间充质干细胞分离培养，并将体外培养的骨髓间充质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，该细胞制剂能够改善衰老大鼠各组织细胞形态的损伤，具有一定的逆转衰老损伤的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于抗衰老细胞制剂的制备方法，按照如下步骤进行：
步骤(1)、配制骨髓间充质培养液；
步骤(2)、无菌条件下，将抽取的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入所述步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；
步骤(3)、将所述步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液离心后弃上清液，得到骨髓干细胞群；
步骤(4)、取所述步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入所述步骤(1)中配置的培养液中重悬后过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于培养皿中培养；
步骤(5)、原代培养24-48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12-18h后以1:2比例传代培养；
步骤(6)、取所述步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂。
进一步地，步骤(1)中所述骨髓间充质培养液为L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL，加入链霉素浓度为100U/mL。
进一步地，所述步骤(3)中离心速率为800-1500r/min，离心时间为5-10min。
进一步地，所述步骤(4)中用70μm无菌尼龙过滤器。
进一步地，步骤(4)中将所述培养基置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养。
进一步地，所述步骤(6)中骨髓间充质干细胞浓度为(2-5)×107个/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明方法通过将骨髓间充质干细胞分离培养，并将体外培养的骨髓间充 质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，结果发现该细胞制剂能够改善衰老大鼠各组织细胞形态的损伤，具有一定的逆转衰老损伤的作用，为研究骨髓间充质干细胞抗衰老机制，以及人体抗衰老研究提供线索。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种用于抗衰老的细胞制剂，该方法具体步骤如下：
实施例1
步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；
步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；
步骤(3)、将步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液以800r/min离心5min，弃上清液，得到骨髓干细胞群；
步骤(4)、取步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入步骤(1)中制得的培养液中重悬后用70μm无菌尼龙过滤器过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于5cm×5cm培养皿中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养；
步骤(5)、原代培养24h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12h后以1:2比例传代培养；
步骤(6)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，其中，骨髓间充质干细胞浓度为2×107个/mL；
步骤(7)、将步骤(6)中制备的骨髓间充质干细胞制剂通过尾静脉注射输注进入小鼠体内以达到抗衰老的目的。
实施例2
步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；
步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；
步骤(3)、将步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液以1500r/min离心10min，弃上清液，得到骨髓干细胞群；
步骤(4)、取步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入步骤(1)中制得的培养液中重悬后用70μm无菌尼龙过滤器过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于5cm×5cm培养皿中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养；
步骤(5)、原代培养48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液18h后以1:2比例传代培养；
步骤(6)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞加入到生理盐水 中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，其中，骨髓间充质干细胞浓度为5×107个/mL；
步骤(7)、将步骤(6)中制备的骨髓间充质干细胞制剂通过尾静脉注射输注进入小鼠体内以达到抗衰老的目的。
实施例3
步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；
步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；
步骤(3)、将步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液以1200r/min离心7min，弃上清液，得到骨髓干细胞群；
步骤(4)、取步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入步骤(1)中制得的培养液中重悬后用70μm无菌尼龙过滤器过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于5cm×5cm培养皿中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养；
步骤(5)、原代培养36h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液15h后以1:2比例传代培养；
步骤(6)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，其中，骨髓间充质干细胞浓度为3×107个/mL；
步骤(7)、将步骤(6)中制备的骨髓间充质干细胞制剂通过尾静脉注射输 注进入小鼠体内以达到抗衰老的目的。
本发明方法通过将骨髓间充质干细胞分离培养，并将体外培养的骨髓间充质干细胞加入到生理盐水中重悬，制得骨髓间充质干细胞制剂，结果发现该细胞制剂能够改善衰老大鼠各组织细胞形态的损伤，具有一定的逆转衰老损伤的作用，为研究骨髓间充质干细胞抗衰老机制，以及人体抗衰老研究提供线索。。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。