本发明属于生物技术领域，涉及一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法。
背景技术：
近年来，应用活细胞进行美容成为市场上追捧的热点，特别是干细胞的使用，通过在皱纹、瘢痕和疤痕上直接注射，使得活细胞能在皮肤中分化生长，对皮肤起着填充和修复功能。这些应用活细胞多数来源同源异体的，进入机体内自身免疫系统将对其产生免疫排斥作用，产生的美容效果是较低。脂肪干细胞是近年研究发现的一种新的成体干细胞，该细胞增殖能力强，体外培养能保持稳定的生长增殖活性，且具有多项分化潜能，也已被应用到美容治疗中。但单纯用脂肪干细胞注射液用于美容，脂肪干细胞定向分化为脂肪细胞和成纤维细胞的效率较低，见效较慢。脂肪干细胞在体外扩增后，被注射入真皮层或肌肉层。细胞生长的微环境改变，脂肪干细胞需要一定的时间来适应生长环境，这样脂肪干细胞在体内的增殖和分化为脂肪细胞和成纤维细胞速度较慢，其刺激成纤维细胞产生胶原纤维和胶原蛋白的生成也出现较晚。
现在市场上生物美容面膜对皮肤美容的作用是非常有限，仅限于保湿、美白和控油等作用。而为了对皮肤产生更好地祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑和抗氧化等作用，本发明利用自体来源脂肪干细胞和富含血小板的血浆的生物学作用，并添加了一些营养因子，在生物学有效期内更好储存及时使用，将对皮肤产生最佳的修复、再生、填充、祛斑和抗氧化等美容作用。
脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法，包括下述步骤：
1)获取腹部皮下正常脂肪组织，用PBS冲洗后，再将脂肪组织剪碎，然后用I型胶原酶消化一点时间；
2)消化后，加入PBS混匀过滤，加入含人自体血清的DMEM培养液，放置在培养箱中培养，间隔一定时间用新鲜培养液进行换液一次，细胞从组织块中生长，为原代自体脂肪源干细胞；
3)当原代细胞达到一定融合度时，再用PBS冲洗，然后加入胰酶和EDTA消化液，待细胞悬浮后，加入人自体血清终止消化，再加入生理盐水；
4)将上述细胞悬液移至离心管中离心，收集脂肪干细胞，调整细胞密度，再次加入含人自体血清的DMEM培养液培养，为二代自体脂肪源干细胞；
5)待二代自体脂肪源干细胞达到一定融合度以上时，再次按原代自体脂肪源干细胞步骤消化传代；
6)取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待降至一定温度时，加入从自体外周血中得到的富含血小板的血浆，混匀后加入二代自体脂肪源干细胞，用于美容抗衰。
步骤1)中，所述的脂肪组织为650-850mg，用PBS冲洗5次，去除吸脂 手术中所用药物、油及血细胞，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，PBS充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小，用质量体积比0.1％I型胶原酶37℃消化60分钟。
步骤2)中，所述的消化后1000转离心10分钟；用200目细胞筛过滤；加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，间隔48小时用新鲜培养液进行换液一次。
步骤3)中，所述的原代细胞达到60-65％融合度时，去除培养液，用PBS冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，消化后加入200μl人自体血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清收集脂肪干细胞，调整细胞密度为1-5×105/ml，加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养。
步骤4)中，所述的二代自体脂肪源干细胞达到65-70％以上融合时，再次按原代细胞步骤消化传代。
本发明的有益效果：通过本发明的方法，通过获取的自体脂肪干细胞和自体富含血小板的血浆，在琼脂糖中制备成美容抗衰的含自体脂肪源干细胞；
由本发明提供的方法得到含有自体脂肪干细胞和自体富含血小板的血浆，能够对皮肤具有祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑以及抗氧化等美容作用，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得 的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法，首先获取腹部皮下正常脂肪组织750mg，用PBS冲洗5次，去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，PBS充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至2.5mm大小，用质量体积比0.1％I型胶原酶37℃消化55分钟；
其次，消化后1000转离心9分钟，吸弃上层脂肪后，加入1.5*PBS混匀，用220目细胞筛过滤；加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，间隔48小时用新鲜培养液进行换液1次，可见细胞从组织块中生长，此为原代细胞；
再次，当原代细胞达到62％融合度时，去除培养液，用1.2*PBS冲洗3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，消化后加入200μl人自体血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清收集脂肪干细胞，调整细胞密度为3×105/ml，加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，继续培养，此为二代细胞；待二代达到69％以上融合时，再次按原代细胞步骤消化传代；
最后从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40℃加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞
实施例2
一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法，首先获取腹部皮下正常脂肪组织880mg，用0.8*PBS冲洗4次，去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，PBS充分冲洗血液后，将脂肪组 织剪碎至3mm大小，用质量体积比0.1％I型胶原酶37℃消化60分钟；
其次，消化后1000转离心10分钟，吸弃上层脂肪后，加入PBS混匀，用200目细胞筛过滤；加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，间隔48小时用新鲜培养液进行换液2次，可见细胞从组织块中生长，此为原代细胞；
再次，当原代细胞达到61％融合度时，去除培养液，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.28％质量浓度的胰酶和0.08％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，消化后加入200μl人自体血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清收集脂肪干细胞，调整细胞密度为4×105/ml，加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，继续培养，此为二代细胞；待二代达到68％以上融合时，再次按原代细胞步骤消化传代；
最后从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至38℃加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞
实施例3
一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法，首先获取腹部皮下正常脂肪组织1000mg，用1.2*PBS冲洗5次，去除吸脂手术中所用药物、油及血细胞，用眼科剪剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，PBS充分冲洗血液后，将脂肪组织剪碎至1-3mm大小，用质量体积比0.2％I型胶原酶37℃消化70分钟；
其次，消化后1000转离心12分钟，吸弃上层脂肪后，加入PBS混匀，用200目细胞筛过滤；加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，在37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育，间隔48小时用新鲜培养液进行换液1次，可见细胞从组织块中生长，此为原代细胞；
再次，当原代细胞达到65％融合度时，去除培养液，用PBS缓冲液冲洗2-3次，加入0.25％质量浓度的胰酶和0.04％质量浓度的EDTA消化液，待细胞悬浮后，消化后加入200μl人自体血清终止消化，再加入5ml的生理盐水，将单细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清收集脂肪干细胞，调整细胞密度为4×105/ml，加入含体积分数15％人自体血清的α-MEM培养液培养，继续培养，此为二代细胞；待二代达到80％融合时，再次按原代细胞步骤消化传代；
最后从自体外周血中得到富含血小板的血浆；取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40℃加入富含血小板的血浆，混匀后加入自体脂肪干细胞
本发明采用获取自体脂肪组织来源的脂肪干细胞联合自体外周血来源的富含血小板的血浆制备成生物面容面膜，利用富含血小板的血浆中丰富的细胞因子和营养物质，保证脂肪干细胞在皮肤内增殖和分化能力，并有助于其分化为脂肪细胞和成纤维细胞，产生良好的皮肤修复的作用。同时还可以添加一些营养因子，进一步保证了脂肪干细胞皮肤内成活效率
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术 人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。