本发明属于生物技术领域，特别涉及一种实现植物基因组外源基因定点整合的方法。
背景技术：
基因定点突变与定点置换技术也称基因打靶技术，是在基因组的原位实现对基因的定点突变、定点整合、基因置换及基因修复等.在应用上，利用基因定点突变与定点置换技术培育植物新品种，可以避免现存转基因技术中基因插入的随机性导致的表达不确定性和对原基因组的损害。同时，在植物基因组原位进行修复或改造可以避免现有的GMO(genetic modifiedorganism)可能存在的应用风险，更容易为公众所接受。在传统的转基因技术中，外源基因(DNA片断)进入植物细胞后随机整合到植物基因组中。由于插入位点具有随机性，往往会产生许多不利结果，例如对植物内源基因造成破坏，出现外源基因沉默等现象，导致大量转化事件不能被应用。因此，对植物基因组进行定点整合外源片段一直是植物转基因技术的重要目标。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种植物基因组外源序列定点整合的方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种实现植物基因组外源基因定点整合的方法，包括如下步骤：
步骤一、构建能够在植株基因组的目的整合位点区域进行基因组编辑的打靶载体，该打靶载体包括整合靶位点序列和Cas9核酸酶表达元件；整合位点区域即靶位点区域。
步骤二、构建外源基因转化载体，并将该外源基因转化载体随机整合到植株的基因组中，得到转化有该外源基因的转基因株系，其中，所述外源基因转化载体包含整合位点序列和；和与所述目的整合位点两翼相同的同源臂序列，且该同源臂序列位于所述整合位点序列和所述外源基因之间；
步骤三、将步骤一中构建的所述打靶载体转化导入步骤二中得到的转基因株系内，筛选得到只含有定点整合到所述目的整合位点区域的株系。
优选的是，所述的实现植物基因组外源基因定点整合的方法中，步骤一和步骤二中的同源臂序列的长度为500～1000bp。
优选的是，所述的实现植物基因组外源基因定点整合的方法中，步骤一中，所述打靶载体的筛选标记基因为潮霉素基因。
优选的是，所述的实现植物基因组外源基因定点整合的方法中，步骤二中，所述外源基因转化载体的筛选标记基因为抗除草剂基因。
优选的是，所述的实现植物基因组外源基因定点整合的方法中，步骤三中，通过杂交进行定点整合到所述目的整合位点区域的株系的筛选。
优选的是，所述的实现植物基因组外源基因定点整合的方法中，所述植物基因组为水稻基因组。
本发明至少包括以下有益效果：
相比于传统的直接利用打靶载体和供体片段共转化进行定点整合的方法，本发明首先通过将外源基因转化载体将外源基因序列随机整合到植物基因组上，再通过第二次转化将打靶载体也导入含有外源基因转化载体的植株内，这样打靶载体同时对整合位点序列和外源片段两翼的靶位点序列进行切割编辑，随机整合位点为定点整合位点提供含有同源臂序列的外源基因的供体片段，然后利用植物本身的修复系统以及同源臂序列的存在，从而实现外源基因片段在目的整合位点的高效整合。并且，相比于两种载体共转化，本发明采用两次转化分别转化两个载体，因此，使得定点整合的成功率大大提高，实现了植物转基因技术上的重要突破。同时，本发明公开的实现植物基因组外源序列定点整合的方法，可以避免现存转基因技术中基因插入的随机性导致的表达不确定性和对原基因组的损害。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的外源基因转化载体的部分序列连接示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
如图1所示，本发明提供一种实现植物基因组外源基因定点整合的方法，包括如下步骤：
步骤一、构建能够在植株基因组的目的整合位点区域进行基因组编辑的打靶载体，该打靶载体包括整合靶位点序列和Cas9核酸酶表达元件；
步骤二、构建外源基因转化载体，并将该外源基因转化载体随机整合到植株的基因组中，得到转化有该外源基因的转基因株系，其中，所述外源基因转化载体包含整合位点序列和；和与所述目的整合位点两翼相同的同源臂序列，且该同源臂序列位于所述整合位点序列和所述外源基因之间；
步骤三、将步骤一中构建的所述打靶载体转化导入步骤二中得到的转基因株系内，筛选得到只含有定点整合到所述目的整合位点区域的株系。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤一和步骤二中的同源臂序列的长度为500～1000bp。
在上述方案中，步骤一中，所述打靶载体的筛选标记基因为潮霉素基因。
在上述方案中，步骤二中，所述外源基因转化载体的筛选标记基因为抗除草剂基因。
在上述方案中，作为优选，步骤三中，通过杂交进行定点整合到所述目的整合位点区域的株系的筛选。
在上述方案中，所述植物基因组为水稻基因组。
在本发明的其中一个实施例中，实现植物基因组外源序列定点整合的方法包括：
步骤1，在目的整合外源基因片段的区域，选择合适的靶位点，构建打靶载体并验证打靶载体可在该位点进行高效地基因组编辑。
步骤2，构建外源基因转化载体(抗性筛选标记基因可为抗除草剂基因)，将外源基因序列通过常规转基因方法随机整合到植物的染色体上。其中，外源基因转化载体构建要求该外源基因序列两翼增加了与整合位点两翼相同的同源臂序列，长度一般要求在500-1000bp，并在同源臂两端添加靶位点序列(如图1)；
步骤3，将步骤2中得到的阳性转基因株系作为受体进行第二次转化，转化载体为整合位点(靶位点)对应的打靶载体(抗性筛选标记基因为潮霉素基因)，打靶载体转化后，会同时对整合位点和外源片段两翼的靶位点进行切割编辑，随机整合位点为定点整合位点提供含有同源臂序列的外源基因供体片段，利用植物本身的修复系统以及同源臂序列的存在，从而实现外源基因片段在靶位点的定点整合，可通过后续的杂交实现随机整合和定点整合的分离，得到只含有定点整合的植株。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的植物基因组外源序列定点整合方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。