本发明属生物医药和基因工程领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒(hbv)慢性化小鼠模型的建立方法及其在抗hbv药物筛选和药物安全性评价等过程中的应用。
背景技术：
研究公开了由hbv感染引起的乙型肝炎以肝脏炎性病变为主，并可并发多器官损害。hbv感染慢性化为慢性乙型肝炎(chb)后，还可引发肝纤维化、肝硬化、原发性肝细胞癌(hcc)和肝衰竭，导致死亡。据报道，近年来，随着hbv疫苗的成熟和预防接种的推广，新发hbv感染率显著下降，但全球仍然有3.5亿左右hbv慢性携带者，每年约1百万患者死于hbv感染相关疾病(lavanchy2004)；中国属hbv感染高发区，约有1.2亿慢性携带者和3000万慢性乙型肝炎患者(liu，sietal.2002)。
研究显示，乙型肝炎病毒(hbv)易感宿主仅限于人及黑猩猩。由于动物伦理、经济成本等条件的限制，目前尚无常规实验动物模型能够有效模拟hbv感染、致病等过程。yangpl等的工作(yangpletal.2002)表明，将具有启动病毒转录复制能力的乙肝病毒1.3倍基因组(1.3mer)插入质粒载体后，利用尾静脉高压水动力注射方法注射入免疫健全小鼠体内可建立乙肝病毒急性复制表达小鼠模型，研究实践显示，上述模型由于小鼠血清中病毒抗原在注射后10天左右全部转阴，难以用于研究慢性乙型肝炎的形成机制，病毒快速清除也使得该模型不适合进行抗hbv药物的研发。使用免疫缺陷的小鼠(yangpletal.2002)或在质粒载体中引入腺相关病毒序列(huanglretal.2012)，能够实现hbv在小鼠肝脏的持续性转录复制，然而由于对宿主免疫缺陷或hbv以外病毒序列的严格依赖，该种hbv持续模型同样不适合用于研究慢性乙型肝炎的形成机制或抗hbv药物的研发。
现有技术的现状是，hbv基础和应用研究均需要不依赖于宿主动物免疫缺陷或其它病毒序列即能实现病毒长期转录复制的小鼠模型。基于此，本申请的发明人拟提供一种乙肝小鼠模型的建立方法制得乙型肝炎病毒(hbv)慢性化小鼠模型，进一步用于抗hbv药物筛选和药物安全性评价等。
技术实现要素：
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种乙肝小鼠模型的建立方法制得乙型肝炎病毒(hbv)慢性化小鼠模型，进一步用于抗hbv药物筛选和药物安全性评价等。
本发明方法建立的乙型肝炎病毒(hbv)慢性化小鼠模型，包括基于balb/c和c57bl/6两个不同品系的小鼠模型。
本发明方法中通过尾静脉高压水动力注射法将bps质粒置于balb/c或c57bl/6小鼠后，获得hbv慢性化小鼠模型。
本发明方法中，提供了一种能够建立基于balb/c和c57bl/6两个小鼠品系慢性化模型的乙型肝炎病毒株及其表达质粒bps，该bps包含有特定hbv临床株(genbankno.af100309.1)1.3倍基因组。
具体的，本发明的目的通过以下技术方案实现：
采用能够在小鼠体内产生hbv持续性表达复制的hbv表达质粒bps，其包含1.3拷贝(核苷酸,nucleotide，nt955-3215/1-1950)的临床病毒株af100309.1和质粒载体puc18；
所述的hbv表达质粒bps，通过基因工程方法可将其中1.3倍hbv基因组改造成其它可启动病毒转录复制的形式，例如1.1或1.2倍hbv基因组；
所述的表达质粒bps，通过基因工程方法可将其中1.3倍(或1.1、1.2倍)hbv基因组克隆至puc18以外的其它质粒中；
所述的hbv表达质粒bps或上述类似构建物，可通过尾静脉高压水动力方法置入小鼠以外的动物中，用于建立hbv慢性化模型；
所述的hbv慢性化小鼠模型使用的小鼠品系为balb/c和c57bl/6，但不限于这两个品系；
本发明方法中，所述hbv慢性化模型通过尾静脉高压水动力方法向小鼠体内置入bps质粒实现，但不限于这一导入途径，例如可将bps或上述类似构建物中的hbv基因组序列插入重组病毒载体后、以重组病毒的形式导入实验动物、感染肝细胞；
所述bps质粒的置入量为1-10μg，优选为10μg；其中，将所述bps质粒1-10μg溶解于2mlpbs缓冲液中后，再进行所述的尾静脉高压水动力注射；
所述hbv慢性化小鼠模型血清中乙肝病毒表面抗原(hbsag)、乙肝病毒e抗原(hbeag)和乙肝病毒核酸(hbvdna)等3个指标持续阳性超过33周；
目前公开文献中虽然有关于hbv急性和慢性化小鼠模型的报道，但这些已公开模型中hbv血清指标或者持续时间较短，或者仅在免疫缺陷小鼠中长期持续，或者仅在质粒载体同时携带有hbv以外的其它病毒序列时能够长期持续，与hbv在人体内的慢性化存在较为显著的差异。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明提供的bps质粒通过尾静脉高压水动力置入后能获得hbv慢性化小鼠，操作简单，成功率高(超过50％)。
2、本发明提供的bps质粒诱导的hbv慢性化不依赖于hbv以外的其它病毒序列。
3、本发明提供的hbv慢性化小鼠模型包括balb/c和c57bl/6两个小鼠品系，不依赖于宿主免疫缺陷或特定的遗传学背景。
4、本发明提供的hbv慢性化小鼠模型中乙肝病毒三个重要血清指标hbsag、hbeag和hbvdna持续时间较长，均超过33周。
5、本发明建立的乙型肝炎病毒(hbv)慢性化小鼠模型可进一步用于抗hbv药物筛选和药物安全性评价等，如，在研究hbv慢性感染中的应用，在hbv药物研发的应用，以及所述的hbv基因组质粒bps在研究balb/c和c57bl/6小鼠以外的其它动物模型中导致慢性化的应用和hbv基因组质粒bps在balb/c和c57bl/6小鼠以外的其它动物模型中进行hbv药物研发的应用。
附图说明
图1显示hbv表达质粒bps的结构，其中，1.3拷贝hbv基因组克隆于puc18的hindiii和ecori限制性酶切位点之间，图上数字表示hbv的核苷酸序列位置；hbvorf以空心白框表示，顺式原件以黑色箭头表示，*，pres2起始密码atg天然突变为gtg。
图2显示bps在balb/c小鼠中形成慢性化，其中，10μgbps尾静脉注射6-8周雄性balb/c小鼠，在注射后系列时间点眼眶采血，检测血清中hbsag(a)、hbeag(b)和hbvdna拷贝数(c)；elisa检测hbsag和hbeag的阈值为od450＝0.1，taq-man探针法检测血清中hbvdna检测下限为500拷贝/ml，上述检测指标下限以虚线表示，组内抗原和hbvdna阳性率显示于a-c右栏。
图3显示bps在c57bl/6小鼠中形成慢性化，其中，10μgbps尾静脉注射6-8周雄性c57bl/6，在注射后多个时间点检测血清中hbsag(a&c)，hbeag(b&c)；elisa检测hbsag和hbeag的阈值为od450＝0.1，检测指标下限以虚线表示。组内抗原阳性率显示于a&b右栏。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、微生物学和重组dna等常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《dna克隆》第i和ii卷(d.n.glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(m.j.gait编辑，1984)；以及《实验免疫学手册》i-iv卷(d.c.weir和c.c.blackwell编辑，1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1：携带1.3倍hbv基因组质粒bps的构建
首先将hbv毒株(genbankno.af100309.1)基因组通过pcr扩增带有限制性酶切位点的两个片段，分别为带有限制性位点hindⅲ和xbai的片段fa(nt955-3215/1-256,2517bp)，带有限制性酶切位点xbai和ecori的片段fb(nt251-1950,1700bp)，先将片段fa通过限制性位点hindiii和xbai插入到载体质粒puc18中，构建成puc18-fa。再通过限制性位点xbai和ecori将片段fb插入到质粒puc18-fa中，构建成1.3倍(核苷酸起止位点为nt955-3215/1-1950)hbv基因组表达质粒bps(图1)。
实施例2：hbv慢性化balb/c小鼠模型的构建
将10μgbps溶于2mlpbs缓冲液中，同过尾静脉高压水动力法分别注射到6只雄性6-8周balb/c小鼠中。分别在注射后1天、4天、7天、10天、2-22周和33周(1周1次)共26个时间点通过眼眶采血0.2ml。全血用抗凝剂处理，分离的血清分别用于hbsag、hbeag和hbvdna检测，结果如图2所示，小鼠血清中hbeag在第4天达到峰值，随后含量逐渐下降(如图2a所示)；小鼠血清中hbsag在第一天达到峰值，随后含量逐渐下降(图2b)，在12-33周50％的小鼠血清中还能检测到hbsag和hbeag(如图2a和2b右栏所示)，bps注射后的小鼠血清hbvdna在33周内维持在0.5×104拷贝/ml以上(如图2c所示)且阳性率为50％(如图2c右栏所示)。
实施例3：hbv慢性化c57bl/6小鼠模型的构建
将10μgbps溶于2mlpbs缓冲液中，通过尾静脉高压水动力法分别注射到8只雄性6-8周c57bl/6小鼠中。分别在注射后1天和7天、2-16周(2周1次)共10个时间点通过眼眶采血0.2ml。全血用抗凝剂处理，分离出来的血清分别用于hbsag、hbeag和hbvdna，结果如图2所示，bps注射的小鼠血清中hbsag和hbeag在2周达到峰值，随后含量逐渐下降，在16周约50％的小鼠血清中还能检测到hbsag和hbeag(如图3a和图3b所示)，在33周约有37％小鼠血清中可检测到hbsag和hbeag(如图3c所示)。
本发明提供了构建慢性化小鼠模型的方法和hbv病毒株并制得hbv慢性化小鼠模型，包括balb/c和c57bl/6两个小鼠品系。该模型小鼠血清中能够高比例(可达50％)、持续性(可超过33周)检测到hbv3个主要指标：hbsag、hbeag和hbvdna。该模型不需要宿主小鼠存在免疫缺陷，也不需要在质粒载体中携带hbv以外的其它病毒序列，因此，与之前已公开的hbv慢性化模型相比较，该模型能够较好反映hbv在人体内的持续性感染，从而在hbv慢性化机制研究以及相应的药物筛选、药效评估等研发领域具有广泛的应用价值。