本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种kras基因突变检测标准品的制备方法和定值方法。
背景技术：
：kras(k-ras，p21)基因长度约为35kb，位于12号染色体，编码21kd的ras蛋白。正常的kras基因参与细胞内信号传递，当kras基因发生突变时，不能产生正常的ras蛋白，会导致细胞内信号传递紊乱，从而导致细胞持续生长不能自我凋亡而引发癌变。在肿瘤患者中检测出的最常见的突变是位于kras基因的12、13号密码子的突变。在胰腺癌患者中约有65％～100％的患者是在kras基因中携带这些位点的突变，在结直肠癌中携带这些突变的患者约占30％～50％。kras基因突变通常会发生在胰腺癌和结直肠癌肿瘤形成的早期。因此，检测体液、胰液或粪便dna中kras基因突变有助于对胰腺癌和结直肠癌患者做出早期诊断。此外，研究表明抗表皮生长因子受体靶向药物(cetuximab和panitumumab)对含有kras基因突变的结直肠癌患者无治疗效果。因此，kras基因还可以作为一个筛选抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的标志物。目前，检测kras基因突变的方法主要有基于测序技术的sanger测序法和高通量测序法(nextgenerationsequencing,ngs)，和基于pcr技术的arms-pcr(amplification-refractorymutationsystem，arms)、突变富集pcr和cold-pcr。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。如一代测序方法(sanger测序)在应用于测定等位基因突变时所能测定的灵敏度20％左右；而高通量测序方法的灵敏度则在2-6％左右。arms-pcr方法的分析灵敏度在1％，而突变富集pcr和cold-pcr的灵敏度更高，可以达到0.1％。由于不同方法的分析灵敏度不同，会导致检测结果的不一致和不可比。因此，急需具有准确突变比例的kras定量标准品，来检验各种分析方法的灵敏度和特异性，以及各种方法之间的可比性。目前国内尚无针对人kras基因检测的定量标准品。技术实现要素：本发明的目的是提供一种kras基因突变定量标准品及其制备方法和定值方法，该方法获得的kras基因突变定量标准品准确度高，相对扩展不确定度3％。本发明首次建立了kras基因突变定量标准品的制备方法，达到了上述发明目的。本发明的技术方案是：(1)提取含有kras基因突变型(g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d)的细胞系基因组dna作为模板，采用普通pcr扩增得到含有目标突变位点的基因片段，通过sanger测序pcr产物的突变位点的纯度。(2)提取野生型人基因组dna，进行片断化。将7种突变型的pcr产物与片断化的野生型人基因组dna按照一定比例混匀。使用野生型人基因组dna的目的是模拟正常人的游离dna，一般肿瘤病人中大量的是正常的cfdna，只有一小部分为突变的ctdna。(3)添加酵母总rna至pcr产物与片断化的野生型人基因组dna混合溶液中。其具体方法为：在按照一定比例混合之前，先将7种突变型的pcr产物与片断化的野生型人基因组dna稀释到相同的拷贝数浓度。将7种突变型的pcr产物与超声破处理片断化的野生型人基因组dna按照一定比例混合，可以采用天平称量法进行混合。所述的片断化是指采用超声波处理使其片断化，优选的实验条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：6min，上样量为100μl，dna浓度：10-50ng/μl，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃。现有技术中，通常采用微球菌核酸酶(mnase)对基因组进行片断化，但采用该方法后，片段化后的酶无法完全失活，即使已经使用一般的灭活条件(65度，10min)对酶进行了失活，但酶没有完全失活的情况下会导致片段化的dna含量不稳定。此外，酶切处理后需对片段化的dna进行纯化，此过程还会大量损失片段化的dna，因此在实际操作中使用这种方法需要大量的dna样品。而本发明使用声波聚焦超声波片段化基因组dna，无需加入酶或其他试剂，处理后也无需纯化，可以直接应用，操作既简单又节省样品。在一些实施方案中，pcr产物和片段化的野生型基因组dna在混合前分别被稀释至16000±480copies/μl。本发明的定量标准品中每一突变位点的突变频率值计算公式如下：其中mi为含某一突变位点的pcr产物的质量值，ci为某一突变位点的pcr产物的拷贝数浓度，mwt为野生型基因组dna的质量值，cwt为野生型基因组dna的拷贝数浓度。在进一步优选的实施方案中，由含有g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d这7个突变的pcr产物与片段化的基因组dna按照混合比例为x1：x2：x3：x4：x5：x6：x7：y；其中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7为0.1～50，y为50～99.3，且x1+x2+x3+x4+x5+x6+x7+y＝100的比例(质量比)混匀。在进一步优选的实施方案中酵母总rna浓度为300～400ng/μl。本发明的kras基因突变检测定量标准品采用重量法进行定值，无需外标，定量结果可溯源至国际基本单位(质量)，从而保证标准品量值的可靠和可溯源。本发明的人kras基因突变标准品可以作为定量的标准。本发明的人kras标准品包含7种常见的kras突变位点，可用于kras基因突变检测方法可靠性和定量准确性的评估和质量控制，提高了效率并降低检测质控成本。具体的，本发明进行了如下研究工作：1.对超声波处理野生型人基因dna的条件进行了优化采用声波聚焦样本处理仪，对处理强度(intensity)、处理时间等进行了优化。优化结果见图9，其中sample1、sample2、sample3、sample4和sample5处理强度均为5，时间分别为3min、4min、5min、6min和8min；sample6、sample7、sample8、sample9处理强度均为4，处理时间分别为4min、6min、8min和16min。由图可知，处理时间6min，处理强度为5时，所得到基因组dna片段分布范围为50～320bp，主峰在165bp，与cfdna片断长度相近。因此最终确定的处理条件为强度：5；时间6min；上样量100μl；dutycycle：10％，cycleperburst：200，温度：4℃。dna浓度范围：10-50ng/μl。2.对突变型pcr产物和野生型基因组dna纯度进行了确认采用sanger测序方法同时对pcr扩增产物的kras突变位点的纯合度进行了确认，结果发现7种细胞系的pcr产物经过测定均为纯合突变(见表1)。对pcr产物和野生型基因组dna的纯度进行了测定，结果见表2-9。表1采用sanger测序法对pcr产物突变型的验证结果细胞系序列g12a如图1所示g12d如图2所示g12r如图3所示g12c如图4所示g12s如图5所示g12v如图6所示g13d如图7所示野生型如图8所示表2.g12apcr产物的纯度和浓度表3.g12dpcr产物的纯度和浓度表4.g12rpcr产物的纯度和浓度表5.g12cpcr产物的纯度和浓度表6.g12spcr产物的纯度和浓度表7.g12vpcr产物的纯度和浓度表8.g13dpcr产物的纯度和浓度表9.野生型基因组dna的纯度和浓度3.验证了重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性将g12a的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用数字pcr方法测定六个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为19.84％、9.87％、4.94％、0.98％、0.19％和0.10％，经过ddpcr测定后得到s1至s6的突变丰度分别为20.81％、10.57％、5.32％、1.05％、0.21％和0.10％。6个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为0.951，见图10。因此证明基于重量法配置的g12a不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表10.g12a不同突变丰度的配置与数字pcr方法验证结果将g12d的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用ddpcr测定五个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s5的突变丰度的分别为21.29％、10.75％、5.41％、1.06％、0.10％，经过数字pcr测定后得到s1至s5的突变丰度分别为20.91％、10.40％、5.19％、1.07％和0.11％。5个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为1.019，见图11。因此证明基于重量法配置的g12d不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表11.g12d不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果将g12r的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用ddpcr测定六个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为22.02％、11.55％、6.03％、1.18％、0.27％和0.14％，经过ddpcr测定后得到s1至s6的突变丰度分别为21.53％、11.09％、5.63％、1.11％、0.30和0.14％。6个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为1.024，见图12，因此证明基于重量法配置的g12r不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表12.g12r不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果将g12c的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用ddpcr测定七个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为49.76％、20.17％、10.01％、5.19％、0.97％、0.11％和0.06％，经过ddpcr测定后得到s1至s7的突变丰度分别为52.81％、20.93％、10.02％、5.046％、1.01％、0.12％和0.06％。7个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为0.941，见图13。因此证明基于重量法配置的g12c不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表13.g12c不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果将g12s的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用ddpcr测定六个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为49.92％、19.97％、9.93％、5.02％、1.11％和0.09％，经过ddpcr测定后得到s1至s6的突变丰度分别为50.39％、20.42％、9.48％、5.16％、1.19％和0.10％。6个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为0.989，见图14。因此证明基于重量法配置的g12s不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表14.g12s不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果将g12v的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。采用ddpcr测定六个不同突变梯度。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为59.96％、27.27％、14.22％、7.23％、1.53％和0.17％，经过ddpcr测定后得到s1至s6的突变丰度分别为58.36％、25.06％、13.25％、7.00％、1.46％和0.18％。6个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为1.03，见图15。因此证明基于重量法配置的g12v不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表15.g12v不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果将g13d的pcr产物与片段化的野生型基因组dna按照一定量进行混合如下表。由重量法配置的s1至s6的突变丰度的分别为59.96％、27.27％、14.22％、7.23％、1.53％和0.17％，经过ddpcr测定后得到s1至s6的突变丰度分别为58.36％、25.06％、13.25％、7.00％、1.46％和0.18％。6个不同梯度的样品经过测定后，ddpcr与重量法配比结果之间的一致性为1.00，见图16。因此证明基于重量法配置的g13d不同突变频率的量值可以得到数字pcr方法的复现。表16.g13d不同突变丰度的配置与ddpcr方法验证结果4.优化了rna作为保护剂的添加浓度本发明研究过程中发现dna尤其是片段化的dna浓度越低，可稳定保存的时间越短。因此本发明中为片段化的dna定量标准品添加了保护剂。根据本发明中的对象人基因组dna，初步确定了玉米基因组dna和酵母总rna作为保护剂，通过对pcr扩增影响的分析，最终确定了酵母总rna作为dna定量标准品的保护剂。而对于保护剂的浓度选择，则分别设计了200ng/μl、300ng/μl、400ng/μl、500ng/ng/μl、600ng/μl的浓度，然后进行pcr扩增，分析不同保护剂浓度下kras基因pcr扩增阳性微滴数目。结果发现rna浓度在400ng/μl以下时，阳性微滴数量没有显著变化，而添加浓度达到500ng/μl及以上时，阳性微滴数减少了，这表明对pcr有抑制作用。而根据保护剂的添加浓度越高，越利于目标dna的稳定保存，因此本发明最终确定了添加rna保护剂的添加浓度为300-400ng/μl。本发明同现有技术相比，其创新点和优点是：1、本发明首次采用重量法对kras基因突变标准品进行精确定量，同时采用数字pcr方法对量值进行了验证，证明了其适用性。2、开创了kras基因突变定量标准品的制备方法，找到了合适的超声波片断化基因组dna的条件。3、重量法定值精密度好：不确定度优于3％。4、方法准确度高：采用天平称量进行定量，不依赖于dna标准品，因此测量结果可溯源至国际基本单位，从而保证测量结果的可靠和可溯源。5、采用本方法制备的kras基因突变定量标准品，其中片断化的野生型基因组dna模拟人血液中的游离dna，而含有目标突变的pcr产物代表循环肿瘤dna，因此本发明的标准品更好的模拟了临床上检测的循环肿瘤dna样本。6、比现有技术方法成本低。下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的kras基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法作进一步说明。附图说明图1为sanger测序法对g12a的验证结果。图2为sanger测序法对g12d的验证结果。图3为sanger测序法对g12r的验证结果。图4为sanger测序法对g12c的验证结果。图5为sanger测序法对g12s的验证结果。图6为sanger测序法对g12v的验证结果。图7为sanger测序法对g13d的验证结果。图8为sanger测序法对野生型的验证结果。图9为超声波处理后的野生型基因组dna条件优化图。图10为g12a突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图11为g12d突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图12为g12r突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图13为g12c突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图14为g12s突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图15为g12v突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图16为g13d突变重量法配制与数字pcr方法测定结果的一致性。图17为超声波处理后的野生型基因组dna结果图。图18为数字pcr测定kras基因拷贝数结果。图19为重量法与数字pcr方法一致性比较。具体实施方式实施例1kras基因7种突变定量标准品的制备及定值一、材料与方法：1.细胞系和培养基rpmi-8226、sun-c2b、nci-h157、sw1573、a549、sw620、hct-116、pglcl8，前7株细胞系购自atcc，所需的培养基及培养条件均参照atcc说明书进行。第八株细胞系为复旦大学提供，培养基为1640+10％fbs，5％co2，37度培养。2.dna提取及pcr扩增采用康为世纪公司的基因组纯化试剂盒提取8株细胞系的基因组dna，以7种含目标突变的细胞系基因组dna为模板进行pcr扩增，获得含有7个目标突变的pcr产物。pcr扩增体系20μl，包含浓度为5um的上下游引物2μl，dna模版2μl，2×的pcr预混液10μl，无菌水6μl。扩增条件为：95度，10min，40个循环包括95度15s，55度，30s，72度1min。3.pcr产物和野生型基因组纯度检查采用nanodrop2000微量紫外分光光度计测定pcr产物和野生型基因组在260nm、280nm和230nm处的吸光值，用te作为空白进行blank，然后取1μl样品进行测定。4.超声波处理采用声波聚焦超声波破碎仪(covariss2)，处理条件为强度：5；时间6min；上样量100μl；dutycycle：10％，cycleperburst：200，温度：4℃。dna浓度范围：30-40ng/μl。5.数字pcr方法测定kras基因拷贝数浓度采用数字pcr方法测定7种pcr产物和野生型基因组dna中kras基因的拷贝数浓度，扩增体系如表17。首先将配制好的含有dna模板的pcr反应液20μl加入到微滴发生卡标记“sample”的孔内，再向标记“oil”的孔内加入60μl微滴生成油，然后放入微滴发生器内生成微滴。微滴生成后转移至96孔板内，用加热仪将96孔板的封板膜封好，放置在普通pcr仪上进行扩增。扩增条件为：95度，10min；40个循环包括95度15s，60度，30s；98度10min。pcr扩增结束后进行微滴的读取和数据分析。采用quantasoft软件进行数据的分析处理。表17.kras基因数字pcr扩增体系6.重量法配置7种不同突变型的定量标准品采用经过校准的高精度的6位分析天平(xp56)按照表18的质量值配制两个突变频率的定量标准品。表18.配制表7.数字pcr方法验证重量法配制值将重量法配制好的不同突变水平的定量标准品稀释至5000cp/μl左右，按照数字pcr方法的操作步骤测定定量标准品中的每个突变型的突变频率，二、实验结果1.超声波处理野生型基因组dna的结果野生型基因组dna经过超声波处理后的结果见图17。可见，经过超声波处理后，所有的基因组dna都破碎成了以主峰为165bp的长度范围为50～320bp左右的小片段，与cfdna片段长度相当。2.pcr扩增及纯度鉴定结果7种不同突变型的pcr产物基因型纯度鉴定结果见表1及图1-8。由表1结果可知，每个pcr产物中对应突变型均为纯合突变，野生型dna不含有任何突变。这对定量标准品的配制非常重要。此外dna纯度鉴定结果见表2-8。根据测定结果7个pcr产物和野生型基因组的od260/od280在1.7～1.9之间，od260/od230大于2.0，因此基因型和dna纯度均满足要求。3.数字pcr测定kras基因拷贝数浓度根据数字pcr测定结果(见图17)，计算得到每种pcr产物和野生型基因组dna中kras基因的拷贝数如表19。由表中数据可知，7种pcr产物含的每种突变型的拷贝数浓度非常相近。.表19.pcr产物和基因组dna中kras基因的拷贝数浓度4.重量法定值根据称量的质量和数字pcr测定的拷贝数浓度，对配制的定量标准品进行定值，定值结果见表20。5％水平的定量标准品中，g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d每种突变型对应的突变频率约为5.02％、5.02％、5.02％、5.05％、5.00％、5.00％、4.99％。1％水平的定量标准品中，g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d每种突变型对应的突变频率约为1.03％、1.02％、1.01％、1.01％、1.00％、1.00％、1.01％。表20.重量法配制突变频率值5.dpcr测定突变频率为了验证重量法配制值是否可以采用一般检测方法复现，对2个水平的定量标准品采用数字pcr方法测定每种突变型的突变频率，计算方法为每个突变型进行3个重复，测定结果如下表。表21.数字pcr测定结果对数字pcr测定结果与重量法配制结果直接的一致性进行分析，如图18。其中圆点表示重量法配制值，三角形表示数字pcr结果。两种方法测定结果一致性在其不确定度范围内很好，但重量法的精密度要优于数字pcr方法，表明本发明中建立的采用重量法定值人kras基因突变标准品，量值准确，适用性好。可用于数字pcr或其他方法的验证和性能评估。实施例2kras基因突变定量标准品适用性验证一、材料与方法：1.材料与试剂选择国内市场上三种不同厂家的人kras基因7种突变检测试剂盒，随机编号为a、b、c。人kras基因7种突变水平为1％的定量标准品(编号k)和5％的定量标准品(编号p)，阴性对照品(nc1～nc11)，定量标准品和对照品均由中国计量科学研究院制备。2.仪器与设备荧光定量pcr仪(rochelc480、rochelc480ⅱ、ab7500)、离心机。3.验证指标利用实时荧光定量pcr方法对试剂盒的以下指标进行验证：1)准确度：对10份5％的定量标准品进行测定，5％的定量标准品的突变频率高于试剂盒的检测限。2)特异性：对10份阴性样品进行测定，测定结果应为阴性。3)检出限：对20份1％的定量标准品进行测定，1％的定量标准品的突变频率与试剂盒提供的检出限一致，测定结果为阳性的样品数量应≧19。4)重复性：由同一操作人员，利用同一试剂盒对有证标准物质重复检测10次，以测量结果的相对标准偏差(rsd,％)表示。根据公式(1)计算相对标准偏差。相对标准偏差应≤5％。二、结果分析1.准确度三种试剂盒均采用荧光定量pcr技术，通过特异性探针水解释放荧光，实时监测pcr反应的进行。以各位点检测的ct值进行定性分析，评判样品中基因突变情况。但三种试剂盒的对突变基因型的判读标准不同，b厂家直接以ct值进行判断，a厂家和c厂家除了ct值要满足要求外，还重点关注△ct值，即突变ct值(ctm)和外控ct值(ctw)的差值。对于b厂家，ct值≤35，判定突变结果为阳性，ct值>38，判定突变结果为阴性，35<ct值≤38,若重复实验后，ct值仍在此范围内，判定为疑似阳性。但由于样本数量限制，不能重复实验，故以37为ct值的临界值，ct值<37判断为阳性，ct值≥37判断为阴性。对于a厂家，g12c，g12r，g12d，g12a，g12s五个位点，需同时满足ct值<38且△ct<8，才能判读为阳性；而g13d和g12v两个位点，需同时满足ct值<38且△ct<8，才能确定为阳性，其余情况均为阴性。对于c厂家，如果△ct<8，且同时满足外控ct值<30，即可确定样本为突变型。对三种试剂盒的7个突变型，10份5％定量标准品测定结果均为阳性，判断全部正确，准确度为100％。检测结果见表22。表22.三种试剂盒准确度检测结果试剂盒12c12s12r12v12d12a13da100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％b100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％c100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％100.00％2.检出限三个厂家的试剂盒均声称检出限为1％突变水平，而实际验证结果表明有些位点的检出限与厂家宣称的检出限并不一致，结果见表23。对于a厂家试剂盒，仅对g12a位点的阳性检出率达到了100％，表明g12a位点的检出限与厂家宣称的检出限一致，而并其余6个位点的检出限并不是1％。对于b厂家试剂盒，g12c、g12s、g12r、g12a这4个位点，对1％的定量标准品的20次检测的结果为：阳性检出率100％，表明这4个位点的检出限符合厂家宣称的值。但对g12v、g12d、g13d的阳性检出率分别为35％、60％和90％，这3个点的检出限并不是1％，不符合厂家宣称的值。对于c厂家试剂盒，对g12c、g12s和g12r位点，1％的定量标准品的20次检测的结果为：阳性检出率100％，对g13d位点的阳性检出率为95％，表明g12c、g12s、g12r、g13d这四个位点的检出限为1％，符合厂家宣称的值。但对g12v、g12d、g12a位点的20次检测结果全部为假阴性，表明这三个位点的检出限与厂家宣称的值不一致。表23.三种试剂盒检出限检测结果试剂盒12c12s12r12v12d12a13da厂家95.00％100.00％100.00％80.00％95.00％100.00％100.00％b厂家100.00％100.00％100.00％35.00％60.00％100.00％90.00％c厂家100.00％100.00％100.00％0.00％0.00％0.00％95.00％3.特异性对同一试剂盒不同位点的特异性的检测结果不同，结果见表24。对于a厂家试剂盒，对10份阴性样品进行检测，7个个位点的检测结果均为阴性。对于b厂家试剂盒，对10份阴性样品进行检测，g12v和g12a两个位点判断出现10％的假阳性，g12d、g12c、g12s、g12r、g13d五个位点均为100％阴性。对于c厂家试剂盒，7个个位点的检测结果均为100％阴性。表24.三种试剂盒特异性检测结果4.重复性采用5％突变水平的定量标准品进行试剂盒重复性评价，结果发现对于任意一种试剂盒，对于任一位点，三家实验室测得的重复性均小于2％，表明高水平突变的重复性较好。采用1％突变水平的定量标准品进行重复性评价，结果发现对于任意一种试剂盒，对于任一位点，三家实验室测得的重复性均小于3％。表25.三种试剂盒重复性检测结果(％)经过实验验证，三个厂家的试剂盒在准确度和重复性指标均满足厂家所宣称的指标，而对于特异性指标，只有两个厂家的试剂盒的符合要求；对于检出限，三个厂家的试剂盒都不能满足7个位点同时符合要求，这表明试剂盒厂家在确定检出限时所采用的质量控制标准量值不够准确。因此证明采用本专利所获得的定量标准品，可以满足kras基因检测方法验证和质量控制的要求。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页12