本发明涉及发酵工程和生物工程
技术领域：
，具体涉及一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法。
背景技术：
：葡萄糖酸盐作为蓬松剂、凝固剂、鳌合剂、酸味剂而广泛应用于食品、医药、化工、水处理、建筑等行业；如在食品行业具体可作为食品添加剂和营养增补剂。葡萄糖酸盐的生产方法主要有微生物发酵法、电解法和催化氧化法等。微生物发酵法由于条件温和，节能明显而被广泛采用。但现有技术中在葡萄糖酸及其盐进行发酵生产时，主要控制的pH、温度、发酵罐转速、溶解氧浓度(DO)、残糖浓度等。如Boutroux利用微生物的氧化作用能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，葡萄糖酸及其盐类发酵工艺有了明显的进步；Currie等利用青霉或曲霉建立了现代通气搅拌液体发酵技术，使葡萄糖的转化率达90％；Blom等发明了添加NaOH、维持pH值6.5以下的方法生产葡萄糖酸钠，葡萄糖转化率达95％以上；我国黄道震等以葡萄糖含量为30％的发酵培养基接种10％的黑曲霉种子液，通过流加氢氧化钠溶液控制pH值在6.0～6.5使残糖可降至1g/L以下。现有报道表明了pH值、温度、发酵罐转速、底物葡萄糖浓度对葡萄糖转化率影响很大。刘仲汇等针对工业大罐发酵而设计了专用pH温度智能控制系统，获得了较好的发酵水平；2002年Anastassiadis等采用短梗霉(Aureobasidiumpullulans)建立了静息细胞和固定化细胞的连续葡萄糖酸生产技术，浓度可达26％，最高生成速率为19g/L/h。但上述方法均为单批次发酵或单罐连续发酵的研究结果参数，上述方法的发酵过程难以控制、发酵速率慢，且连续发酵时间短。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法。本发明提供的葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法连续、稳定、收率高、能耗低。本发明提供了一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：以15～25％的接种量在一级发酵培养基中进行接种，再加入发酵培养基进行一级发酵，所述葡萄糖液的浓度为340～360g/L；当所述一级发酵得到的葡萄糖浓度为300～320g/L时，将发酵液进行二级发酵；当所述二级发酵得到的葡萄糖浓度为240～260g/L时，将发酵液进行三级发酵；当所述三级发酵得到的葡萄糖浓度为120～150g/L时，将发酵液进行四级发酵；当所述四级发酵得到的葡萄糖浓度为15～30g/L时，将发酵液进行缓冲发酵；当所述缓冲发酵得到的葡萄糖浓度为2～5g/L时，得到葡萄糖酸钠。优选的是，所述发酵采用的菌种为黑曲霉。优选的是，所述发酵培养基包含以下重量份的组分：6～10份的葡萄糖、0.001～0.005份的硫酸镁、0.001～0.002份的尿素、0.0015～0.005份的消泡剂和22～25份的水。优选的是，各级发酵的发酵液的体积占各工作容积的70～80％。优选的是，进行下一级发酵的发酵液的体积为上一级发酵液总体积的5～10％。优选的是，一级发酵转出发酵液的同时补加补料培养基，所述补料培养基补加的体积为转出的发酵液的体积的40～60％。优选的是，一、二、三、四级和缓冲发酵转出发酵液的同时流加氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液流加的总体积为转出发酵液体积的40～60％。优选的是，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的质量百分比为30～50％。优选的是，在连续发酵过程中，所述一级发酵的干菌浓度保持在20～30g/L。优选的是，发酵总时长为340～400h。本发明提供一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法。通过一次性接种，和多级发酵的结合，本申请大大节约了培养原料和时间，实现了发酵的连续生产，发酵收率高达97.3％。本发明提供的葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法发酵时间长，单位产能高，操作简单，容易控制，是连续、稳定、收率高、能耗低的连续发酵生产方法。附图说明图1为本发明实施例1和2中的发酵装置连接关系图。具体实施方式本发明提供了一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法，包括以下步骤：以15～25％的接种量在一级发酵培养基中进行接种，再加入发酵培养基进行一级发酵，所述葡萄糖液的浓度为340～360g/L；当所述一级发酵得到的葡萄糖浓度为300～320g/L时，将发酵液进行二级发酵；当所述二级发酵得到的葡萄糖浓度为240～260g/L时，将发酵液进行三级发酵；当所述三级发酵得到的葡萄糖浓度为120～150g/L时，将发酵液进行四级发酵；当所述四级发酵得到的葡萄糖浓度为15～30g/L时，将发酵液进行缓冲发酵；当所述缓冲发酵得到的葡萄糖浓度为2～5g/L时，得到葡萄糖酸钠。本发明中，在进行接种步骤前，优选进行种子培养，种子培养温度为36℃，种子培养时间为18～24h。本发明中，种子培养基包含以下重量份的组分：20～35份的葡萄糖、0.2～0.8份的玉米浆、0.03～0.08份的磷酸二氢钾、0.01～0.04份的尿素、0.01～0.04份的消泡剂和80～100份的水。本发明中，所述种子培养基的原料优选包含重量份为20～35份的葡萄糖，更优选包含24份的葡萄糖；所述种子培养基的原料优选包含重量份为0.2～0.8份的玉米浆，更优选包含0.45份的玉米浆；所述种子培养基的原料优选包含重量份为0.03～0.08份的磷酸二氢钾，更优选包含0.04份的磷酸二氢钾；所述种子培养基的原料优选包含重量份为0.01～0.04份的尿素，更优选包含0.02份的尿素；所述种子培养基的原料优选包含重量份为0.01～0.04份的消泡剂，更优选包含0.02份的消泡剂；本申请对所述消泡剂的种类没有特殊的限定，采用常规的市售消泡剂产品即可。所述种子培养基的原料优选包含重量份为80～100份的水，更优选包含85～95份，最优选为90份的水。得到种子液后，本发明优选以20％的接种量在一级发酵培养基中进行接种，加入发酵培养基进行一级发酵，所述发酵培养基中的葡萄糖浓度优选为350g/L。在本发明中，发酵培养基包含以下重量份数的组分：6～10份的葡萄糖、0.001～0.005份的硫酸镁、0.001～0.002份的尿素、0.0015～0.005份的消泡剂和22～25份的水。本发明中，所述发酵培养基的原料优选包含重量份为6～10份的葡萄糖，更优选包含8.5份的葡萄糖；所述发酵培养基的原料优选包含重量份为0.001～0.005份的硫酸镁，更优选包含0.0028份的硫酸镁；所述发酵培养基的原料优选包含重量份为0.001～0.002份的尿素，更优选包含0.0014份的尿素；所述发酵培养基的原料优选包含重量份为0.0015～0.005份的消泡剂，更优选包含0.002份的消泡剂；所述发酵培养基的原料优选包含重量份为22～25份的水，更优选包含24份的水。所述一级发酵的pH值优选为5.5，优选采用NaOH进行调节。当所述一级发酵得到的葡萄糖浓度为300～320g/L，更优选为310g/L时，将发酵液进行二级发酵；当所述二级发酵得到的葡萄糖浓度为240～260g/L，更优选为240g/L时，将发酵液进行三级发酵；当所述三级发酵得到的葡萄糖浓度为120～150g/L，更优选为140g/L时，将发酵液进行四级发酵；当所述四级发酵得到的葡萄糖浓度为15～30g/L，更优选为20g/L时，将发酵液进行缓冲发酵；当所述缓冲发酵得到的葡萄糖浓度为2～5g/L，更优选为3g/L时，得到葡萄糖酸钠。所述一级发酵的发酵温度为35～38℃，pH值为5.2～5.8，培养压力为0.1MPa。所述二级发酵、三级发酵、四级发酵和缓冲发酵的发酵温度、pH值和压力取值范围和一级发酵一致。本发明所述一至四级发酵和缓冲发酵实现了发酵过程的连续进料和出料。本发明在得到葡萄糖酸钠后，优选取所得产品进行第一过滤、脱色、第二过滤、浓缩、结晶和干燥。所述第一过滤的目的是除去菌丝体，本发明对第一过滤的方法没有特殊的限制，采用常规的工业过滤方法即可，如板框过滤。所述脱色优选采用活性炭脱色法。所述第二过滤的目的是除去杂质，本发明对第二过滤的方法没有特殊的限制，采用常规的工业过滤方法即可，如板框过滤。所述浓缩优选在105-115℃条件下，将葡萄糖酸钠浓缩至质量百分比为70％，随后进行冷却结晶，所述冷却的温度为70～75℃。在本发明中，各级发酵和缓冲发酵所用装置按发酵顺序连接。在本发明中，所述一级发酵过程中，葡萄糖浓度范围为300～350g/L；所述二级发酵过程中，葡萄糖浓度范围为240～300g/L；所述三级发酵过程中，葡萄糖浓度范围为120～240g/L；所述四级发酵过程中，葡萄糖浓度范围为15～120g/L；所述缓冲发酵过程中，葡萄糖浓度范围为2～20g/L。在本发明中，所述发酵采用的菌种为黑曲霉，本发明对所述黑曲霉的来源没有特殊的限制，采用常规的黑曲霉的市售产品即可。在本发明中，各级发酵的发酵液的体积占各工作容积的70～80％，更优选为75％。在本发明中，进行下一级发酵的发酵液的体积为上一级发酵液总体积的5～10％，更优选为8％。在本发明中，一级发酵转出发酵液的同时补加补料培养基，所述补料培养基补加的体积为转出的发酵液的体积的40～60％。所述补料培养基包含重量份数为45～60份的葡萄糖、0.05～0.3份的玉米浆、0.01～0.03份的硫酸镁、0.005～0.01份的尿素、0.02～0.04份的磷酸二氢钾、0.002～0.01份的消泡剂和85～100份的水。所述补料培养基的原料优选包含重量份为45～60份的葡萄糖，更优选为52.5份的葡萄糖；所述补料培养基的原料优选包含重量份为0.05～0.3份的玉米浆，更优选包含0.1份的玉米浆；所述补料培养基的原料优选包含重量份为0.01～0.03份的硫酸镁，更优选包含0.014份的硫酸镁；所述补料培养基的原料优选包含重量份为0.005～0.01份的尿素，更优选包含0.07份的尿素；所述补料培养基的原料优选包含重量份为0.02～0.04份的磷酸二氢钾，更优选包含0.028份的磷酸二氢钾；所述补料培养基的原料优选包含重量份为0.002～0.01份的消泡剂，更优选包含0.004份的消泡剂；所述补料培养基的原料优选包含重量份为85～100份的水，更优选包含95份的水。本发明中，一、二、三、四级和缓冲发酵转出发酵液的同时流加氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠流加的总体积为转出发酵液体积的40～60％，更优选为50％，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的质量百分比为30～50％，更优选为32％。在本发明中，在连续发酵过程中，所述一级发酵的干菌浓度保持在20～30g/L，更优选保持在25g/L。在本发明中，发酵总时长为340～400h，更优选为360h。下面结合具体实施例对本发明所述的葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1：第一步、种子培养：15L培养罐中加入纯葡萄糖3.2kg、玉米浆60g、磷酸二氢钾5.2g,尿素2g,消泡剂2ml，定容至10L，115℃灭菌15分钟，然后降至35℃，加入250ml茄子瓶菌悬液，控制溶解氧(DO)≥30，培养20小时。第二步、发酵：50L发酵罐中(一级发酵罐)加入纯葡萄糖8.5千克、硫酸镁2.8g、尿素1.4g、消泡剂2ml,定容至24L，115℃灭菌15分钟，然后降至38℃，接入种子液，接种量为22％，用350g/L的NaOH调节控制PH5.5，开始发酵。二、三、四级发酵罐(50L罐)和缓冲罐(50L罐)蒸汽121℃灭菌20分钟，降温保压待用。第三步、连续发酵：⑴配料：200L补料罐中加入葡萄糖液52.5千克，玉米浆100g、硫酸镁14g，尿素7g,磷酸二氢钾28g,消泡剂4ml,定容至150L，115℃灭菌30分钟，然后降至38℃，备用，补料罐准备两个交替使用。⑵连续发酵控制方法：发酵过程中发酵装置的连接关系如图1所示。前述第二步工序一级发酵罐发酵液葡萄糖浓度下降到310g/L的时候发酵液泵送到二级发酵罐，同时一级发酵罐自动补加补料培养基，使一级发酵罐维持菌浓20g/L(干重)左右，二级罐葡萄糖浓度下降至240g/L时泵送至三级罐，三级罐葡萄糖浓度下降至140g/L时泵送至四级罐，四级罐葡萄糖浓度下降至20g/L时泵送至缓冲罐，缓冲罐中葡萄糖浓度降低至3g/L以下排出过滤，整个连续发酵过程中通过在线的葡萄糖检测仪监测葡萄糖含量使一级发酵罐葡萄糖浓度维持在350g/L至310g/L，二级发酵罐葡萄糖浓度维持在310g/L至240g/L，三级发酵罐葡萄糖浓度维持在240g/L至140g/L，四级发酵罐葡萄糖浓度维持在140g/L至20g/L，并通过在线进出料流量计、自动控阀门和发酵罐液位计控制各级发酵液的体积，实现不停补料和不停出料的连续发酵，发酵时常348小时，发酵收率96.8％(理论最大100％)。第四步、过滤：板框过滤除菌丝体。第五步、脱色：活性炭脱色。第六步、过滤：板框过滤除杂质。第七步、浓缩、结晶：105-115℃浓缩至70％以上含量，冷却至75℃结晶。第八步、分离、干燥：分离机将晶体与液体分离，然后流化床干燥，得葡萄糖酸钠成品。第九步、包装。实施例2：第一步、种子培养：15L培养罐中加入纯葡萄糖3.5kg、玉米浆55g、磷酸二氢钾6g,尿素3g,消泡剂3ml，定容至9L，115℃灭菌15分钟，然后降至35℃，加入250ml茄子瓶菌悬液，控制溶解氧(DO)≥30，培养20小时。第二步、发酵：50L发酵罐中(一级发酵罐)加入纯葡萄糖9千克、硫酸镁2.8g、尿素1.5g、消泡剂4ml,定容至25L，115℃灭菌15分钟，然后降至38℃，接入种子液，接种量为20％，用350g/L的NaOH调节控制PH5.5，开始发酵。二、三、四级发酵罐(50L罐)和缓冲罐(50L罐)蒸汽121℃灭菌20分钟，降温保压待用。第三步、连续发酵：⑴配料：200L补料罐中加入葡萄糖液59千克，玉米浆120g、硫酸镁18g，尿素9g,磷酸二氢钾32g,消泡剂4ml,定容至150L，115℃灭菌30分钟，然后降至38℃，备用，补料罐准备两个交替使用。⑵连续发酵控制方法：发酵过程中发酵装置的连接关系如图1所示。前述第二步工序一级发酵罐发酵液葡萄糖浓度下降到320g/L的时候发酵液泵送到二级发酵罐，同时一级发酵罐自动补加补料培养基，使一级发酵罐维持菌浓30g/L(干重)左右，二级罐葡萄糖浓度下降至250g/L时泵送至三级罐，三级罐葡萄糖浓度下降至130g/L时泵送至四级罐，四级罐葡萄糖浓度下降至25g/L时泵送至缓冲罐，缓冲罐中葡萄糖浓度降低至4g/L以下排出过滤，整个连续发酵过程中通过在线的葡萄糖检测仪监测葡萄糖含量使一级发酵罐葡萄糖浓度维持在360g/L至320g/L，二级发酵罐葡萄糖浓度维持在320g/L至250g/L，三级发酵罐葡萄糖浓度维持在250g/L至130g/L，四级发酵罐葡萄糖浓度维持在130g/L至25g/L，并通过在线进出料流量计、自动控阀门和发酵罐液位计控制各级发酵液的体积，实现不停补料和不停出料的连续发酵，发酵时常370小时，发酵收率97.3％(理论最大100％)。第四步、过滤：板框过滤除菌丝体。第五步、脱色：活性炭脱色。第六步、过滤：板框过滤除杂质。第七步、浓缩、结晶：105-115℃浓缩至70％以上含量，冷却至70℃结晶。第八步、分离、干燥：分离机将晶体与液体分离，然后流化床干燥，得葡萄糖酸钠成品。第九步、包装。实施例3单罐连续发酵多级连续发酵发酵连续时间190h360h每吨产品消耗电量195kw/h170kw/h每吨产品消耗蒸汽量0.2m20.1m2单位产能4.8m3/h6.5m3/h单位产葡萄糖酸钠速率16g/L/h18g/L/h葡萄糖酸钠收率95.7％96.4％葡萄糖酸钠平均白度96.5％97％菌体稳定性时间150h300h上述生产指标是发酵工段的数据，单罐连续与本发明多级连续相比，多级连续单位产能高，耗能低。本发明的多级连续发酵方法中，每级发酵的葡萄糖浓度都不同，本发明的方法既能维持高发酵速率又能维持较高的菌体活性。而单罐连续发酵发酵速率低和菌体活性差。本发明与单罐连续发酵相比：①菌体稳定性好，稳定性时间能多维持一倍②产酸钠速率要高于单罐连续发酵。③单位产能高。④多级连续能维持更长的发酵时间，节约菌种生长时间，每批蒸汽空罐灭菌等，每吨葡萄糖酸钠产品消耗更少的电量和蒸汽量。⑤葡萄糖酸钠收率优于单罐发酵。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3