GmGAPC1基因片段作为秦艽在不同生长时期稳定表达的内参基因的应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及GmGAPC1基因片段作为中药秦艽在不同生长时期稳定表达的内参基因的应用。

背景技术：

中药秦艽是我国传统名贵中药材，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、和血舒筋、利尿等功效。随着社会发展，市场需求的逐年增大，以及乱采乱挖等原因，致使野生的秦艽资源遭到极大破坏。自1987年起，秦艽就被我国列为三级重点保护野生药材。秦艽的有效成分主要是以龙胆苦苷(gentiopicroside)为代表的裂环环烯醚萜苷类(Secoiridiod glycosides)，还包括獐牙菜苦苷(swertiamarin)、獐牙菜苷(sweroside)等。这些次生代谢产物有着广泛的生物药理性活性，例如健胃、利胆、抗炎、抗真菌、抗组胺等。在分子生物学领域了解秦艽龙胆苦苷等裂环环烯醚萜苷类的代谢途径，认识其关键酶基因的表达情况是重要的研究方向之一。目前，秦艽转录组数据库的建立，为挖掘该种中药材的基因研究提供了大量的基因数据资源。研究基因的表达有多种方法，而荧光实时定量PCR(RT-qPCR)因为其快速和可靠地定量分析基因表达研究而被广泛应用。但是，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对目标基因的表达数据进行校正和标准化。所谓内参基因(Endogenous references gene)即内部参照，主要作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物，相当于衡量基因表达的一个“标尺”。常用的内参基因应该在生物体各类细胞中均有表达，它们是在维持细胞基本生命活动中时刻表达的基因，自身表达相对稳定，不会随着实验材料不同而有较大差异，这样作为一个“标尺”才可靠。然而越来越多的实验研究发现，一些常用的内参基因并不是在所有的情况下均稳定表达，在特定的实验条件下，内参基因的表达会发生变化。因此，在选择使用某一个内参基因时，应首先验证其在特定的条件下是否能够持续稳定的表达。

技术实现要素：

本发明的目的是提供GmGAPC1基因片段作为秦艽在不同生长时期稳定表达的内参基因的应用，所述GmGAPC1基因片段的核苷酸序列为TGGTGAGAAGCCTGTCAGAGTATTCGGGAACAGGAACCCAGAAGAGATCCCATGGGGTGAAACTGGAGCCGAGTTCGTTGTAGAGTCCACTGGAGTTTTCACTGACAAGGACAAAGCTGCTGCTCACTTAAAGGGTGGTGCAAAGAAGGTAATCATTTCTGCTCCC。

采用上述GmGAPC1基因片段作为秦艽在不同生长时期稳定表达的内参基因时，使用的特异性引物为：

GmGAPC1-F：5′-TGGTGAGAAGCCTGTCAG-3′；和

GmGAPC1-R：5′-GGGAGCAGAAATGATTACC-3′。

上述GmGAPC1基因片段由下述方法克隆得到：

(1)从秦艽中提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

(2)根据转录组数据库中GmGAPC1基因的核苷酸序列：

TACATACTACCTCTCTTATCTCTCTAATTTTCCTCTAAACCCTTTGTTAGAAGCAGCAGGAGCAATGGTTTCTGACAAGAAAATCAAGATTGGGATCAACGGTTTTGGAAGGATCGGGCGTTTGGTTGCTAGAGTTATTCAGCAACGGGATGATGTTGAACTTGTTGCTGTAAATGATCCATTCATCACCACTGATTACATGACATATATGTTCAAGTATGACAGTGTACATGGACCATGGAAACATCATGAGGTTTCTGTCAAGGATGAAAAGACACTTCTTTTTGGTGAGAAGCCTGTCAGAGTATTCGGGAACAGGAACCCAGAAGAGATCCCATGGGGTGAAACTGGAGCCGAGTTCGTTGTAGAGTCCACTGGAGTTTTCACTGACAAGGACAAAGCTGCTGCTCACTTAAAGGGTGGTGCAAAGAAGGTAATCATTTCTGCTCCCAGCAAGGACGCACCAATGTTTGTGGTTGGTGTCAATGAGAAAGAATACAAGCCTGAGTTGGACATTGTCTCCAATGCCAGTTGCACAACAAACTGTTTAGCTCCATTGGCCAAGGTCATTCATGATAGGTTTGGCATTGTTGAGGGCCTTATGACAACTGTGCACTCTATGACTGCTACTCAGAAGACTGTTGATGGTCCTTCAAGCAAGGACTGGAGAGGTGGAAGAGCTGCTTCATTCAACATTATTCCAAGTAGCACTGGAGCTGCAAAGGCCGTTGGCAAGGTGCTTCCAGCCCTTAATGGCAAACTGACTGGAATGTCTTTCCGAGTTCCAACTGTGGATGTGTCGGTAGTGGACTTGACTGTGCGACTAGAGAAAGAGACTACCTATGACGAGATCAAAGCCGCTATTAAGGAGGAGTCAGAGGGTGCTCTCAAGGGAATCTTGGGCTATACTGAAGACGATGTCGTGTCCACAGACTTTGTCGGTGACAACAGGTCAAGCATCTTTGACGCGAAGGCTGGAATTGCCTTGAGTAAGACTTTTGTAAAGCTTGTTTCCTGGTATGACAATGAATGGGGATACAGTACTCGTGTCGTTGATTTGATTGTCCATATGGCATCTGTTTAGAAGAGGGCATGAAGGCGGTTTTTAACAACATGAAGGCGGTTCTAGGGGGACTGGCTGAGCTTTTTTGTTTTTCATGTCTTTTTCTTTTAGTTTTTGGTTGTGTGCTTTGACTTGAATAAAGTAGCAGTTGTTTGAATGTTAATGTCAGCTTTTCCCCTTTTTTCTCTATCAGTATTCCGCTTCCTTGTCTCGGAATAGTGTGTAATAATGAAGTATGTTGTTGAAATTCAAATGTTTATTACCCCTCTGTTCTGTTTATAAGGATAAACATATTTTCAGGTTGGTTAAAAAACATTTGAATTTCAACAACATA

设计合成特异性引物：

GmGAPC1-F：5′-TGGTGAGAAGCCTGTCAG-3′；和

GmGAPC1-R：5′-GGGAGCAGAAATGATTACC-3′；

(3)以cDNA为模板，利用步骤(2)中的特异性引物，PCR扩增GmGAPC1基因片段，所述PCR扩增的反应条件为：98℃10s、57℃3s、72℃1min，30个循环，72℃延长10min；

(4)电泳检测步骤(3)所得PCR扩增产物，回收并纯化目的片段，进行测序；

(5)测序所得的序列分别通过NCBI上BLAST比对和BioEdit本地转录组数据库中分析比较，进而确定所得核苷酸序列为上述GmGAPC1基因片段。

本发明采用GmGAPC1基因片段作为秦艽在不同生长时期的内参基因，以荧光定量PCR技术，通过绝对定量和相对定量分析方法检测目的基因GmWRKY在秦艽2叶期、4叶期、6叶期以及一年生植株的根、茎、叶等不同生长时期的结果趋势一致表明，GmGAPC1基因片段可以作为秦艽在不同生长时期稳定表达的内参基因使用，为研究秦艽功能基因的表达奠定了基础。

附图说明

图1是GmGAPC1基因片段的溶解曲线。

图2是GmWRKY基因片段的溶解曲线。

图3是Ct随GmWRKY基因片段的浓度对数变化的标准曲线。

图4是以GmGAPC1基因片段为内参基因分析GmWRKY基因在秦艽不同生长时期的相对表达量柱状图。

图5是GmWRKY基因在秦艽不同生长时期的绝对表达量柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

以GmGAPC1基因片段作为秦艽在不同生长时期的内参基因，GmWRKY基因片段(核苷酸序列为：CAGATTCGGAAGCATGTGAATTATGATTATTTCCTATGATTCTTGCACCGAAGTAGTTTGATCCAGAAGTTGCAGGAGACATCAAAGAAGGACATGGATTTCCTCCAAAATCATTTTCCATTACCATAGAAGAAGATCCTCCAAATATTGGAAAACTTCCAAAATCACCACTTGC)作为目标检测基因，具体检测方法如下：

1、提取秦艽总RNA

取新鲜秦艽一年生根、茎、叶，以及2叶期、4叶期和6叶期样本分别放入1.5mL的离心管，迅速放入液氮中速冻，然后将其置于提前去除RNA酶的研钵中，并在研钵中加入足量的液氮，将样本研成粉末；采用百泰克生物公司多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒并按照说明书提取样本的总RNA。

2、合成秦艽cDNA

所得总RNA经电泳检测、测OD值，选质量好的总RNA为模板，按照TaKaRa Prime ScriptTM RT reagentKit反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，将合成的cDNA稀释5倍，于-20℃冻存，待用。

3、合成内参基因的特异性引物

上游引物GmGAPC1-F：5′-TGGTGAGAAGCCTGT CAG-3′；和

下游引物GmGAPC1-R：5′-GGGAGCAGAAATGATTACC-3′；

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4、合成目标检测基因的特异性引物

上游引物GmWRKY-F：5′-CAGATTCGGAAGCATGTGA-3′和

下游引物GmWRKY-R：5′-GCAAGTGGTGATTTTGGAAG-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

5、PCR扩增反应

以秦艽一年生叶的cDNA为模板进行普通PCR扩增。PCR均采用以下25μL反应体系：超纯水17μL、10×EX Taq PCR buffer 2.5μL、dNTPs 2μL(2.5mM)、上游引物0.25μL(5μM)、下游引物0.25μL(5μM)、ExTaq 0.5μL、cDNA 2.5μL。PCR扩增反应条件为：98℃变性10s、57℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。用OMEGA胶回收试剂盒纯化所得PCR扩增产物，回收目的片段，进行测序，测序所得的序列分别通过在NCBI的BLAST比对和BioEdit的本地转录组数据库中分析比较，进而确定所得核苷酸序列为上述GmGAPC1基因片段和GmWRKY基因片段。

6、荧光实时定量PCR扩增反应

以不同生长时期的秦艽cDNA为模板，使用Roche 96系统，根据Takera公司的 Premix Ex Taq^TMII试剂盒说明书，反应体系为20μL，其中2×SuperReal PreMix Plus SYBR Premix Ex Taq II(2×)(Tli RNaseH Plus)10μL，上、下游引物各0.8μL(10μmol/L)，cDNA 2μL(10ng/μL)，用超纯水定容至20μL。荧光实时定量PCR扩增采用两步法，即在95℃预变性30s后，运行40个循环：95℃10s、60℃30s，再运行溶解曲线(95℃1min，60℃1min，60℃-95℃，每30s升高0.5℃收集一次荧光)，得到GmGAPC1基因片段和GmWRKY基因片段的溶解曲线及阈值循环数(Ct)。由图1～2可见，溶解曲线为单一峰，说明GmGAPC1基因片段和GmWRKY基因片段的上、下游引物均具有特异性。

7、制作标准曲线

将步骤5所得GmWRKY基因片段进行10倍梯度稀释，稀释成5个浓度梯度，然后分别作为模板，采用GmWRKY基因片段的上、下游引物按照步骤6的方法进行荧光实时定量PCR扩增反应，得到Ct随GmWRKY基因片段的浓度对数变化的标准曲线(见图3)，标准曲线的拟合方程为y＝-3.5933X+39.25(相关系数R²＝1.000)，通过标准曲线的斜率(slope)即可得到GmWRKY基因片段的扩增效率E＝(10^(-1/slope)–1)×100％＝90％，说明引物的扩增效率高。

8、GmWRKY基因的相对表达量

根据公式：相对表达量＝2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)，计算GmWRKY基因片段的相对表达量。结果见图4。

9、GmWRKY基因的绝对表达量

根据步骤7得到的Ct随GmWRKY基因片段的浓度对数变化的标准曲线，通过荧光实时定量PCR扩增反应获得秦艽不同生长时期GmWRKY基因片段的Ct，依据步骤7中标准曲线的拟合方程y＝-3.5933X+39.25，计算GmWRKY基因片段在秦艽不同生长时期准确的基因拷贝数，即GmWRKY基因的绝对表达量，结果见图5。

对比图4和图5的实验结果可见，在引入GmGAPC1作为内参基因，GmWRKY基因的绝对定量结果和相对定量结果表现趋势基本一致，说明本发明GmGAPC1基因片段可以作为研究秦艽2叶期、4叶期、6叶期以及一年生植株的根、茎、叶等不同生长时期功能基因引入的内参基因。