一种用于11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒的制作方法

本发明提供一种用于11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒，用于11种不同种类的兔艾美尔球虫感染的检测，本发明还公开了上述11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒的制备方法，属于分子生物学检测
技术领域：
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背景技术：
：家兔由于体积小，繁殖力强等特点常作为实验动物用于兽医学及人类医学的研究。其养殖最为常见疾病之一就是球虫病，其中尤以艾美尔球虫感染最为常见。国际上，兔艾美尔球虫的种类有11种之多，且很容易产生新的耐药性株，因此这也是兔球虫病难以治疗和预防，发病不易于控制的主要原因。同其他球虫的生活史一样，兔球虫分为未孢子化卵囊和孢子化卵囊。兔球虫病的检测方法有多种，如镜检法、ELISA（包括直接ELISA和间接ELISA）、常规PCR检测等。但是以上方法要么观测困难、不便于批量实验（如镜检法），要么对操作人员的素质要求较高、直观性不强（如ELISA），要么检测的灵敏性、特异性不高（常规PCR）。粪样基因组是最容易采集的样品之一，且基因组DNA稳定性强，聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是目前灵敏度高且易于操作的DNA检测技术。由于粪便样本成分复杂，其中含有大量细菌，使用普通PCR方法进行检测时经常会有非特异性条带或假阳性结果出现。尤其一般的粪便基因组提取试剂盒，对于样品的处理球虫孢子囊内的DNA提取不够彻底。技术实现要素：本发明的目的是公开一种用于11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒，以兔艾美尔球虫18SrRNA基因ITS-1（internaltranscribedspace-1）序列为目标序列，设计一对属特异性nestedPCR引物，再针对每一种虫体设计11对种特异性nestedPCR引物，建立nestedPCR检测方法，用于临床粪样中11种兔艾美尔球虫的检测。首先对于球虫基因组由于其卵囊的存在，普通的基因组试剂盒提取情况往往不够理想。因此在针对其特点，对实验操作进行改进，即在粪便样品中加入0.4-0.6mm的玻璃珠，并在加入溶解液后对样品利用液氮进行反复冻融4-6次。本发明公开的11种兔艾美尔球虫巢氏PCR检测试剂盒，可以用于工业化生产。本发明11种兔艾美尔球虫试剂盒主要由以下几种材料及试剂组成：（1）直径0.4-0.6mm玻璃珠；（2）PCR反应液：2.5mMdNTPs，终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物，10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶，DNA模板和ddH2O。除DNA模板外，其他试剂可配制为Mix液冻存于-20℃长期存放；（3）11种兔艾美尔球虫特异性引物：第一轮PCR引物：ITS-1F:GGGAAGTTGCG；ITS-1R:CTGCGTCCTTCATCGAT；第二轮PCR引物如下：表2(4)对照：阳性对照为斯氏艾美尔球虫虫种，阴性为对照为ddH2O，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。本发明的11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒还可以含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和rTaq酶，其浓度优选为溴化乙锭10μg/μl；溴酚蓝点样缓冲液。也还可以含有PCR反应管。本发明所述的11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)基因组提取，除了正常应用粪便基因组试剂盒外，还应对每份样品加入200mg玻璃珠以便于对球虫孢子囊进行破碎，以及在加入GSL(DNA裂解液)液后使样品在液氮和沸水的反复冻融5次以上。2）PCR扩增：（1）准备待检样品数+2的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液（DNA模板分别为待检样品、阴性对照和阳性对照），涡旋混匀后瞬时离心，待用。（2）第一轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性1min、44℃退火30s、72℃延伸1min,共33个循环，后72℃延伸8min。（3）以第一轮PCR产物可作为所有第二轮PCR的反应模板，第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性1min、对应退火温度（见表一）退火30s、72℃延伸1min,共35个循环，后72℃延伸10min。（表一）虫种条带大小（bp）退火温度(℃)E.sti21754E.fla19653E.med15450E.coe25653E.int24154E.irr22639E.mag21846E.per15744E.vej16649E.piri28942E.exi280393）PCR产物观察：配制2%琼脂糖凝胶，加样后100V-120V电压下电泳20-30min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，如果样品存在对应大小的扩增条带就证明该样品感染了相应的兔艾美尔球虫（得到的虫种见附图1～图11）。本发明的积极效果在于：首先在基因组提取上，由于玻璃珠的使用和反复冻融的应用，对球虫基因组的提取效率大大的提高。另外提供的11种兔艾美尔球虫ITS-1基因诊断序列，根据该序列设计引物，通过优化扩增条件来提高其敏感性，电泳分析直接观察扩增结果。本发明11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性高，特异性强，而且便于批量化操作，能鉴定兔艾美尔球虫具体种类的感染，结果判定准确客观。附图说明图1～图11：分别为检测出的11种艾美尔球虫第二轮PCR产物的特异性条带；图12：斯氏艾美尔球虫特异性验证；图13：斯氏艾美尔球虫灵敏度验证。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例1兔艾美尔球虫特异基因选择兔艾美尔球虫虫种特异诊断序列：选择具有高度保守性的18SrRNA的ITS-1基因序列，NCBI中比对其为艾美尔球虫所特有，且各种球虫在该段内具有差异性，符合种特异检测研究标准。实施例2.nestPCR特异性测试：实验的目的其一在于区分兔艾美尔球虫与其他病原感染的差异，其二在于能够分别检测出不同的11种艾美尔球虫。因此选取常见寄生虫DNA样品（贾第虫，新孢子虫，以及弓形虫）作为对照进行特异性检测。以斯氏艾美尔球虫为例，结果如下：方法能够准确检测出兔艾美尔球虫，且为斯氏艾美尔球虫，其他虫种（贾第虫G，新孢子虫N，等孢球虫I，弓形虫速殖子G.t，弓形虫缓殖子G.b）利用该检测方法不能显示特定条带。实施例3.nestPCR灵敏度测试：通过麦氏计数法计算出每μl所得球虫个数，最终结果如下图，即在每μl至少含有100个球虫情况下能够成功检测到兔艾美尔球虫的存在。实例4.PCR反应条件的优化第一轮设置引物的退火温度分别为：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃，实验发现44℃退火温度最佳。E.sti第二轮设置引物退火温度分别为：50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，实验发现54℃（≈（Tm上游+Tm下下游）/2-5℃）退火温度最佳。第二轮引物的退火温度根据第一轮推算，按照上下游引物Tm值平均值-5℃分别设置其他种类艾美尔球虫的第二轮PCR退火温度。实例5.样品检测采集长春地区154份家兔的粪便样品进行检测。用饱和盐水漂浮法进行抽样检测，在镜检的20份样品中发现11份典型的球虫结构。采用巢式PCR方法检测全部样品，除去5份提取失败的样品，剩余149份样品发现了85份阳性样品。试验例1试剂盒的组成常规粪样基因组提取试剂，玻璃珠；PCR反应液10管（20μl体系），其中各自dNTPs的浓度为250μM、上游引物，下游引物，内侧上游引物，内侧下游引物的终浓度各为10pmol/μl，Mg2+终浓度为1.5mM；4g琼脂糖；50μl溴化乙锭（20μg/μl）；0.5%溴酚蓝点样缓冲液50μl；10μlTaq酶（5U/μl）；1份兔艾美尔球虫基因组DNA阳性对照。试验2试剂盒特异性试验取斯氏艾美尔球虫（Eimeriastidia），蓝氏贾第虫（Giardialamblia）、新孢子虫（Neosporacaninum）、等孢球虫（Isospora）、弓形虫（Toxoplasmagondii）速殖子（tachyzoite）和缓殖子（bradyzoite），用建立的扩增体系分别对其进行扩增。将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、44℃退火30s、72℃延伸30s,共30个循环，后72℃延伸10min；第二轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、按照表格中退火温度设定相应的30s、72℃延伸30s,共30个循环，后72℃延伸10min.扩增产物用2%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。结果显示（见附图12）：仅有斯氏艾美尔球虫可以呈现出相应条带，其它样本均无扩增，符合特异检测标准。试验3试剂盒敏感性试验使用麦氏计数法收集斯氏艾美尔球虫5.75×106/mL。提取1ml球虫全部DNA，并用57.5μL的TE收集。分别将浓度稀释到第一个反应体系中的含量为1.6×104、8000、4000、2000、1000、100、10、1。反应条件同特异性检测实施例，同时设阴性对照。产物用2%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。结果表明阈值为100，符合敏感性检测标准（见附图13）。试验例4试剂盒的稳定性和重复性试验阳性模板，PCR反应液，rTaq酶在-20℃条件下贮存，裂解液、溴酚蓝等其它物品4℃保存即可。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，用已知PCR阳性的样品检测11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒稳定性。另外，10份PCR阳性样本用11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次，扩增条件如前所述。结果表明在以上各时段取出的组分在已知PCR阳性样品和15份PCR阳性样本均得到了单一明亮特异的目的条带，而空白对照的阴性样品均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重复性良好。试施例5试剂盒的保质期试验将分别在4℃和-20℃贮存1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月的11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒取出并对已知阳性样品进行检测。扩增及检查方法同前，结果表明在4℃和-20℃条件下保存达10月之久的11种兔艾美尔球虫巢式PCR检测试剂盒依然能扩增出清晰的目的条带，无杂带。序列表1<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>217<212>DNA<213>斯氏艾美尔球虫(E.stiedai)<400>11GTGGGTTTTCTGTGCCCTCCCCCACCATGGGTCGGTTCGGTCACCTCTGCATTTTCCAAC61CTTTGAATCTTTTCTCACTCACTCTACAACGGATTTCTTGTAAGGCGGCTATTTTTTATG121TGGTCTGTCTTTCTTTCTGCATTGTTTTTGTTCCAGTAAATTGGAACGAAAGTGAGGAGG181CGGATGGACGTGCTGAATGAAGCAAAGCAGCAGCCTT序列表2<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>196<212>DNA<213>黄艾美尔球虫（E.flavescens）<400>11GAATATTGTTGCAGTTTACCACCAATGGGGTTACTTTGTCACCTTTCTCAACTCTAGAATC61TGTTTTTTTCTTTTCTCCAACGACGCTTTTTCTTTTTCTCATTGAAGTTTTTTTTTTCCTC121TTCCAACCGCATAAACTTTTTTTTGTTCCATCATTCCGATGGAATAAGGGGAAGATTATGA181AGAACGGTTGTTGAGG序列表3<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>154<212>DNA<213>中型艾美尔球虫（E.media）<400>11GATTTTTTTCCACTGCGTCCCTGTTTTTCAGTATAGTGGGAAAGAGGTGAGGCAGTTGG61GTGTGTAAAAGCATCTTTCGCCCATAGGTCACCACCACCTGTTGGTGGTGATACTTGGG121TGATAGAAGCTTTTTTTACCTTTTCTGTTATGAA序列表4<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>256<212>DNA<213>盲肠艾美尔球虫（E.coecicola）<400>11AGCTTGGTGGGTTCTTATTATTGTACTCTATCTATCCCACCACTACTACTACGGTTCATC61ATATTCACCTCCTGCTCTCCATTTTCCAACTTTTGAATCTCTCTTTTCACTTCACAACGA121TTTTTTTATAGAAGAAGCCTTGTTATTTGGTTTCTTTCTTCTACTTTTATGTCTGCATTC181TTTTCTTTCCAATAAATTATTGGGATGAAATTGAGGCAGATATGGTATGATGATATGGAT241TTGTTGAAGCAACTAG序列表5<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>241<212>DNA<213>肠艾美尔球虫（E.intestinalis）<400>11TGTTTGTACCACCGAGGGAATAACCTTTGCATTTTCGAACTCTTGAATCTTTTTTTCACT61CTACAACGATTTTCGAAAGTATGCTATTTGATCTAATTTCTCCTTCTGCACACTTTTTTT121TTCCAGTAAAATGGAATAATGGAAGTGTGGCAGGTGGATGTATTGAGAAGCGACAGACTC181GCCCGGGAATAACCAGCGTCAAAATGCTGGTTTTGCTGGATGAGGAGGGTAGCTTAATGT241T序列表6<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>226<212>DNA<213>无残艾美尔球虫（E.irresidua）<400>11TTTGGTGGGAAAAGATGATTCTACTACACTTAAAAGGCCAAAAGTTCCTTCTACTTTTGG61AGCTGTGGTAGGGTCGTCAGAGTACCGCCGGTGAGATCACCTCGATATCACTTCCAACTC121TTGAATCCTTTCTCCAACCTCCTCAACGTGTTCTCTTTTACTTTAATTAATATTAAGGTA181TTCATTTACCTTGATGCCATTTTGAATGGGTTAAAAATAATGCAAA序列表7<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>218<212>DNA<213>大型艾美尔球虫（E.magna）<400>11TTTACTTATCACCGAGGGTTGATCACCTATGCATTTTGCCACACTTTTGAATCTTTTTCC61ATTCCACAACGATTTTAAGGCCCACTGCATCCTTCTTTCCCTCAGTACACAGTGGAATAG121AAGTGAGGTAGCTGGGTGTGTAAAAGCATCTTTTGCCCGCAAGTAACCGCCTGTTGGCGG181TGAAAGGTGGGTGGCGGTGGTAAGCTTTACCTTTCTCG序列表8<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>157<212>DNA<213>穿孔艾美尔球虫（E.perforans）<400>11TTTTATTTCATTCCCATTTGCATCCCTTTTTTTCAGTATATTGATTGGAAAAGAGGTGAG61GCAGTTGGGTGTGTGAAAGCATCTCTCACCCAAAGGTGACCTCCTGTCGGTGGTGACAGT121TGGGTGACAGAAGCTTGACCTTTTCTGTTATGAAAAG序列表9<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>166<212>DNA<213>维氏艾美尔球虫（E.vejdovskyi）<400>11GTGCTGCCACAAAAGTCACCGCTGAATTTTCCAACTTTTGAATGTTTTTTCACCCTACAA61CGATTTTCTAAGCTCTGCTATTTGATTGGTTTTCTGTTCTACCTGTGTCCTCTTTTTTTT121CCAGTAACTTGGAATGAAAGGTGAGGCGGGCGGAATGAATTGTAGC序列表10<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>289<212>DNA<213>梨形艾美尔球虫（E.piriformis）<400>11ACGAATACATCCCTCTGCCTTACCCTTTAATTGGCTGAAAGCAGCTTCTATTTTGAGGTG61TGGCTTTCTGGGGCCGGTTGGGGTATGGGTGGGATTGTTGCAGTGTACCACCTCTATGGG121GTTACTTTGTCACCTTTCTCAACACTAGAATCTGTTTTCTTTTTCTCTCCATCGACGCGT181TTTCTTTTTCTCAATGAAGTTTTTTTTTTTCTCTTCAAACCGCATAAACTTTTGTCTTCC241ATTACTCCGATGGAATAAGTGGAAGAATGGTTGTGCAGGGGGAGACAAT序列表11<110>吉林大学<120><140><160>1<210>1<211>280<212>DNA<213>小型艾美尔球虫（E.exigua）<400>11GAATAAGTTCTGCCTAAAGAGAGCCTTCTAATTGGACGAAAGTTCTACACTAGTTGGTGT61GGGTCTTTTGGGGCTGATTGGGGCTTTGGGGCTGGGGCTTGTTCGACGATCACCCTATCA121CAATTCTCAACTTTTGAATCGTTTTTTCTTTTCTCCATCGACGTATTTTTCTTTGATTTT181AGCGATAATTTTCCTTTTTTCTCTTGGAACCGTTAAAGATCTTTTCGCCCAAGTCAAAAT241ACCAACTGGTTTTTGAGGTGGGTTGGGGATGGTCTATATA。当前第1页1 2 3