筛选基因编辑产物的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法与应用。

背景技术：

近年来，利用ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、Cpf1、Ago等基因编辑系统，在多个物种中成功实现了基因组的定点编辑。这些系统可对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定位置敲除或者插入基因。利用这些系统进行基因组编辑会产生大量的突变体，因此鉴定这些突变体的工作量巨大。而目前对基因编辑突变体的筛选主要有以下几种方法：PCR酶切(PCR/RE)检测法，T7EI酶切法，高分辨率溶解曲线分析法等。这些方法在实际应用中存在一定缺陷：PCR/RE检测法只适用于编辑位点处存在限制性内切酶切点的靶序列，这个条件限制了靶序列的选择；T7EI酶切法适合鉴定杂合突变体，但对纯合突变体的鉴定相对繁琐，不利于实际应用；利用高分辨率溶解曲线分析法需要昂贵的仪器。这些鉴定方法限制了大规模高通量地筛选基因编辑后产生的突变体。与此同时，目前鉴定通过基因编辑的方法得到的混合细胞系主要用的PCR/RE和T7EI酶切法，并不能精确定量细胞系中的突变效率。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物(突变体)的方法，采用本发明的方法能简单、快捷、廉价、高通量地鉴定基因编辑产物(突变体)。在此基础上结合实时荧光定量PCR技术，还可以精确定量细胞系中的突变效率。

本发明利用PCR反应程序中，退火温度决定引物与模板结合效率的特点，根据野生型序列，在突变位点附近设计特异正向引物及退火温度略高于正向引物的反向引物，在严格的退火温度范围内，通过常规PCR反应来鉴定基因编辑突变体。其中，由于特异的正向引物与突变体模板不能完全匹配，在严格的退火温度下不能进行有效扩增，因此不能扩增得到PCR产物的样品即为突变序列。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法，包括如下步骤：

1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA，以获得PCR模板；

备注说明：待测样品是以野生型为背景材料，基因编辑后得到的待鉴定材料；

2)、引物设计：

以目标基因的基因组序列为参照，设计ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游(位于正向引物下游)，设计反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；设计策略如图1所示。

3)、利用步骤2)的引物对FA/RA以野生型基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；

能够扩增出目的条带所对应的最高温度为临界退火温度T_am；

模型如图2所示，其中第8点样孔所对应的T_m即为临界退火温度T_am，作为后续的ACT-PCR退火温度。

利用步骤2)的引物对FA/RA以已知突变体基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；

能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最小临界退火温度T_lm；

模型如图3所示，其中第4点样孔所对应的T_m即为最小临界退火温度T_lm，后续的ACT-PCR退火温度必须大于此温度。

4)、利用步骤2)的引物对FA/RA以步骤1)所提取的基因组DNA为模板、设定退火温为T_lm<Tm≤T_am之间，建议选择T_am，进行PCR扩增(为普通PCR扩增)；

5)、将步骤4)所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；结果如图4所示。其中能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型(基因型为AA)或者杂合突变体(基因型为Aa)，不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体(基因型为aa)，如示意图4所示，其中#3，#5，#6，#8，#10所对应的样品即为突变体。

6)、结合实时荧光定量PCR检测细胞系中基因编辑效率；提取未编辑(对照)及经编辑的细胞系DNA为模板，设定退火温度为T_am，进行实时荧光定量PCR检测；设定Ct^A1为未编辑细胞系样本目标基因Ct值，Ct^B1为它的内参基因Ct值；设定Ct^A2为经编辑细胞系样本目标基因Ct值，Ct^B2为它的内参基因Ct值，根据公式计算得到ΔΔCt＝(Ct^A2–Ct^B2)-(Ct^A1–Ct^B1)，则经编辑细胞系中目标基因的检测水平是未经编辑细胞系的2^-ΔΔCt倍，即在经编辑细胞系中，有(1-2^-ΔΔCt)×100％的目标基因发生了编辑。

作为本发明的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的改进：

所述步骤2)中：正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点为1～6bp(较佳为2～6bp)。

作为本发明的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：

所述步骤2)中：

正向引物FA的引物序列为N_1-20，长度为20bp；

对于目标基因正向引物对应的基因组序列为N₁NNNNNNNNNNNNNNN↓NNNN₂₀，↓表示基因编辑拟切割突变位点，所对应的正向引物FA为N_1-20。

作为本发明的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：

所述步骤2)中：

正向引物FA：N₁NNNNNNNNNNNNNNNNNNN₂₀。

作为本发明的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：

所述步骤4)中：

PCR扩增体系和程序如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，T_am退火30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。

综上所述，本发明提供一种新的PCR技术，即ACT-PCR，提供了ACT-PCR引物设计原则和退火温度设定方法，并提供了利用ACT-PCR筛选基因编辑突变体及计算细胞系突变效率的方法。

本发明提供了利用ACT-PCR筛选基因编辑突变体的应用。

在本发明PCR引物设计时，需要跨过拟切割突变位点。ACT-PCR扩增的退火温度是通过温度梯度PCR确定的，是以野生型DNA为模板，温度梯度PCR中能扩增出条带的最高温度为退火温度，但不限于仅此温度，包括所有可以区分野生型和突变体的退火温度。

本发明具有如下优点：

1、不受靶序列没有酶切位点的限制。

2、无须对PCR产物进行特殊处理。

3、不依赖于特殊的检测仪器。

4、只需通过简单的PCR和琼脂糖凝胶电泳过程，即可完成对基因编辑突变体的大量筛选，极大简化了筛选过程，节约了筛选成本。

5、结合实时荧光定量PCR技术，还可以精确定量细胞系中的突变效率。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为ACT-PCR引物设计示意图。

图2为临界退火温度T_am示意图；M代表DNA maker，1～12代表以野生型DNA为模板，以FA/RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图，用于确定临界退火温度T_am。

图3为最小临界退火温度T_lm示意图；M代表DNA maker，1～12代表以突变体DNA为模板，以FA/RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图，用于确定临界退火温度T_lm。

图4为ACT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图；M代表DNA maker，1～12代表以转基因系的不同个体的DNA为模板，以FA/RA为引物，T_am为退火温度，扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图。

图5为OsPDS突变位点临界退火温度T_am琼脂糖凝胶电泳图；M代表DNA maker(DL2000)，1～12代表以野生型(水稻日本晴)为模板，以PDS-FA和PDS-RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中7号样品所对应的温度64.8℃即为鉴定OsPDS突变体的临界退火温度T_am。

图6为ACT-PCR筛选OsPDS突变体的结果图；M代表DNA maker(DL2000)，1～23代表以PDS-FA/RA为引物，在64.8℃退火温度条件下，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中1～22是以编辑OsPDS基因的转基因个体的DNA为模板，23是以野生型(日本晴)DNA为模板。

图7为ACT-PCR筛选Os02g23823突变体的结果图；M代表DNA maker(DL2000)，1～23代表以Os02g23823-FA/RA为引物，在63.0℃退火温度条件下，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中1～22是以编辑Os02g23823基因的转基因个体的DNA为模板，23是以日本晴DNA为模板。

图8为OsLG1突变位点临界退火温度T_am及最小临界退火温度T_lm琼脂糖凝胶电泳图；M代表DNA maker(DL2000)；图8的上图中，1～12代表以野生型(水稻日本晴)为模板，以LG1-FA和LG1-RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中8号样品所对应的温度66.7℃即为临界退火温度T_am；图8的下图中，1～12代表以OsLG1突变体(转基因T₀代)为模板，以LG1-FA和LG1-RA为引物，温度梯度PCR扩 增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中4号样品所对应的温度58.7℃即为最小临界退火温度T_lm；

图9不同退火温度筛选转基因T₁代LG1突变体的结果图；1～25代表以LG1-FA/RA为引物，分别在58.7℃，60.8℃，66.7℃和68.8℃退火温度条件下，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中1是以日本晴DNA为模板，2～25是以编辑LG1基因的T₁代个体的DNA为模板。

图10不同退火温度筛选转基因T₁代GL1-1突变体的结果图；1～25代表以GL1-1-FA/RA为引物，分别在57.0℃，60.8℃，66.7℃和68.8℃退火温度条件下，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中1是以日本晴DNA为模板，2～25是以编辑LG1基因的T₁代个体的DNA为模板。

图11正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点分别为0,1,2,6bp时，筛选OsPDS突变体的结果图；M代表DNA maker(DL2000)；在64.8℃退火温度条件下，从上至下分别以FA0/RA，FA1/RA，FA2/RA，FA6/RA为引物PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中1～22是以编辑OsPDS基因的转基因个体的DNA为模板，23是以野生型(日本晴)DNA为模板。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本实施例中的基因编辑突变体是由CRISPR-Cas9系统编辑得到的。

实施例1-1、设计筛选OsPDS突变体的ACT-PCR引物

按照ACT-PCR引物设计原则(如图1所示)，设计OsPDS特异的ACT-PCR引物序列FA和RA。

PDS-FA:5’-TTGGTCTTTGCTCCTGCAGA-3’

PDS-RA:5’-CTCCACTACAGACTGAGCACAAAGCTTC-3’

OsPDS突变体来源见发表文献：

Wang C,Shen L,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice.J Genet Genomics,2015,42(12):703-706。

实施例1-2、通过温度梯度PCR扩增确定ACT-PCR的临界退火温度T_am

以实施例1-1中设计的引物对PDS-FA和PDS-RA为ACT-PCR扩增引物，以水稻日本晴基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，温度梯度55℃-72℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。

PCR产物电泳结果见图5。根据图5，我们得知：最大临界退火温度T_am为64.8℃。

因此，在以下的实施例1-3中选择退火温度为64.8℃。

实施例1-3、利用ACT-PCR筛选OsPDS突变体

提取待测样品的基因组DNA，按照常规CTAB法进行。

以实施例1-1中设计的引物为ACT-PCR扩增引物，以OsPDS转基因T₀代1-22个株系基因组DNA为模板，以实施例1-2中的临界温度64.8℃为退火温度，进行PCR扩增。反应体系如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，64.8℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。

PCR产物电泳结果见附图6。通过ACT-PCR扩增，鉴定出OsPDS转基因T₀代1-22个株系中的突变体为：#1，#2，#3，#7，#8，#9，#10，#11，#12，#13，#14，#15，#16，#17。

运用ACT-PCR方法所筛选到的OsPDS转基因T₀代突变体与Sanger测序分析鉴定到的突变体(见文献Wang C,Shen L,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice.J Genet Genomics,2015,42(12):703-706.)完全一致，由此证明ACT-PCR方法是一个准确方便、简单省时的筛选基因编辑突变体的方法。

备注说明：OsPDS转基因T₀代是指用基因编辑方法编辑OsPDS基因获得的转基因当代植株。

实施例2、相对于实施例1-1～实施例1-3而言，作如下改动：

目的基因由“OsPDS”改成“Os02g23823”，对应的具体引物对如表1所示。所确定的退火温度为63.0℃；

Os02g23823突变体来源见发表文献：Wang C,Shen L,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9system for multiplex genome editing in rice.J Genet Genomics,2015,42(12):703-706。

其余内容等同于实施例1-1～实施例1-3。

Os02g23823转基因T₀代22个株系进行检测，共10个株系不能扩增出目的条带(如图7所示)，该不能扩增出目的条带所对应的样品，与Sanger测序分析鉴定到的突变体完全一致(基因型为aa)。

实施例3、相对于实施例1-1～实施例1-3而言，作如下改动：

目的基因由“OsPDS”改成“OsLG1”，对应的具体引物对如表1所示。

OsLG1突变体来源见发表文献：Hu X,Wang C,Fu Y,et al.Expanding the Range of CRISPR/Cas9Genome Editing in Rice.Molecular plant,2016,9(6):943-945。

OsLG1转基因T₀代是指用基因编辑方法编辑OsLG1基因获得的转基因植株当代植株。

OsLG1转基因T₁代是指用基因编辑方法编辑OsLG1基因获得的转基因植株子一代植株。

实施例3-1～实施例3-3内容等同于实施例1-1～实施例1-3。

根据图8，我们得知：最大临界退火温度T_am为66.7℃。

OsLG1转基因T₁代25个株系进行检测，共5个株系不能扩增出目的条带(如图9所示)，该不能扩增出目的条带所对应的样品，与Sanger测序分析鉴定到的突变体完全一致(基因型为aa)。

实施例3-4、通过温度梯度PCR扩增确定ACT-PCR的最低临界退火温度T_lm

以表1中设计的引物对LG1-FA和LG1-RA为ACT-PCR扩增引物，以已鉴定存在突变的T₀代突变体基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，温度梯度55℃-72℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。

PCR产物电泳结果见附图8，根据附图8，我们得知：最小临界退火温度T_lm为58.7℃。

实施例3-5、以LG1-FA/LG1-RA为ACT-PCR扩增引物，以OsLG1转基因T₁代1-25个株系基因组DNA为模板，以实施例3-4中的最小临界退火温度(T_lm)58.7℃，介于T_am和T_lm间的60.8℃，及高于T_am的68.8℃为退火温度，分别进行PCR扩增。反应体系如下：

反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，退火(58.7℃，60.8℃或68.8℃)30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。

PCR产物电泳结果见附图9。

结果为：用退火温度58.7℃进行检测，25个株系都能扩增出目的条带，无法达到鉴定突变体的目的；用退火温度60.8℃进行检测，所得的结果与实施例3-3一致，均可正确鉴定出突变体；用退火温度68.8℃进行检测，25个株系都不能扩增出目的条带。因此，此例中可用的退火温度为58.7<T_m≤66.7℃；

实施例4、相对于实施例3-1～实施例3-5而言，作如下改动：

目的基因由“OsLG1”改成“OsGL1-1”，对应的具体引物对如表1所示。所确定的临界退火温度为57℃<T_m≤66.7℃；

OsGL1-1突变体来源见发表文献：Hu X,Wang C,Fu Y,et al.Expanding the Range of CRISPR/Cas9Genome Editing in Rice.Molecular plant,2016,9(6):943-945。

其余内容等同于实施例3-1～实施例3-5。

结果为：在上述退火温度范围值内(57℃<T_m≤66.7℃)，所得的结果一致，均为：

OsGL1-1转基因T₁代24个株系进行检测，共3个株系不能扩增出目的条带(如图10所示)，该不能扩增出目的条带所对应的样品，经Sanger测序分析鉴定均为纯合突变体(基因型为aa)。

而不在上述退火温度范围值内的PCR检测，无法鉴定出突变体。

根据实施例3-5和实施例4-5可知，由于退火温度过低(≤T_lm)或过高(>T_am)，使得特异的正向引物与野生型和突变体模板间的结合效率无差别，无法得出正确的检测结果。而当 退火温度介于T_lm<Tm≤T_am之间，使得特异的正向引物在野生型和突变体模板间结合效率存在差异，依然可以鉴定出突变体。通过上述案例说明，退火温度最好选择T_am，退火温度处于一定的临界温度范围内都可以鉴定，并不限于T_am。

表1

实施例5、改变特异的正向引物，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点分别为0、1、2、6bp。将实施例1-1中的引物由FA、RA分别对应的改成如下表2所述，将退火温度(℃)相应的改成如下表2所述(仅选用最大临界退火温度T_am作为退火温度)；其余内容等同于实施例1-1～实施例1-3。

表2

结果如图11所示为：

实施例5-1：对22个株系进行检测，仅1个株系不能扩增出条带，共21个株系都能扩增出目的条带，该能扩增出目的条带所对应的样品，经Sanger测序分析鉴定出其中有13个是纯合突变体；

实施例5-2：对22个株系进行检测，共12个株系不能扩增出目的条带，10个株系能扩增出目的条带，该能扩增出目的条带所对应的样品，经Sanger测序分析鉴定出其中有2个是纯合突变体；

实施例5-3：对22个株系进行检测，共14个株系不能扩增出目的条带，8个株系能扩增出目的条带，结果与实施例1-3结果相同；

实施例5-4、对22个株系进行检测，共14个株系不能扩增出目的条带，8个株系能扩增出目的条带，结果与实施例1-3结果相同。

根据以上系列案例可知，由于正向引物3’端没有跨过拟切割突变位点(实施例5-1)，使得鉴定到的纯合突变体与实际的突变体数目严重不符，因此无法得出正确的检测结果。当跨过的距离短(1bp，实施例5-2)，使得鉴定到的纯合突变体少于实际的突变体数目，说明正向引物3’端跨过拟切割突变位点过短会导致较高的漏检率。而当正向引物3’端跨过拟切割突变位点2bp时(实施例5-3)，鉴定到的纯合突变体与实际的突变体数目相符。当正向引物3’端跨过拟切割突变位点较大时(实施例5-4，为6bp)，鉴定到的纯合突变体与实际的突变体数目相符；但是当正向引物3’端跨过拟切割突变位点过大时，会存在与野生型和突变体结合效率区别变小的不利因素。通过上述案例说明，在本发明PCR引物设计时，为了增加正向引物的特异性，设计3’端跨过拟切割突变位点越长，错误概率越低，本案例推荐采用为2-6bp，但不限于2-6bp。

实施例6-1通过质粒转化水稻原生质体，获得OsPDS基因编辑细胞系

按照发表文献(Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.,and Gao,C.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system.Nat Protoc(2014).9:2395-2410)方法获得OsPDS基因编辑水稻原生质体细胞系，按照常规CTAB法提取此细胞系样品的基因组DNA。未经基因编辑的原生质体细胞系DNA作为对照。

实施例6-2通过实时荧光定量PCR精确定量细胞系中的突变效率

以实施例1-1中设计的引物对PDS-FA和PDS-RA为ACT-PCR扩增引物，分别以未经编 辑和OsPDS基因编辑水稻原生质体细胞系DNA为模板，以实施例1-2中确定的临界退火温度Tam进行实时荧光定PCR扩增。以引物ACTIN-F和ACTIN-R作为内参对照。每个样品进行3个复孔重复。反应体系如下：

内参对照体系：

引物序列：

Actin-F TGCTATGTACGTCGCCATCCA

Actin-R AATGAGTAACCACGCTCCGTC

使用仪器：Bio-Rad，CFX96 Touch real-time system

反应程序：1. 95.0℃for 5:00

2. 95.0℃for 0:10

3. 64.8℃for 0:20

4. 72.0℃for 0:30

+Plate Read

5.Goto 2,39more times

6.Melt Curve 60.0to 95.0℃,increment 0.5℃,

For 0:05+Plate Read

End

设定Ct^A1为未经编辑的水稻原生质体样本PDS基因Ct值，Ct^B1为它的内参ACTIN基因Ct值；设定Ct^A2为OsPDS基因编辑水稻原生质体样本OsPDS基因Ct值，Ct^B2为它的内参ACTIN基因Ct值。可以根据结果计算得到：

ΔΔCt＝(Ct^A2–Ct^B2)-(Ct^A1–Ct^B1)＝-0.27,经基因编辑原生质体内PDS基因的检测水平是未经编辑原生质体的2^-ΔΔCt＝0.83倍，即在OsPDS基因编辑水稻原生质体细胞系中，有(1-0.83)×100％＝17％的OsPDS基因发生了编辑。我们用ACT-PCR结合实时荧光定量PCR精确鉴定了此细胞系中特定基因的编辑效率为17％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，适用于任何物种中通过基因编辑技术产生突变的鉴定。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。