本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种从油橄榄叶中提取分离齐墩果酸的方法。
背景技术：
油橄榄(Olea europare L.)是世界著名的木本油料树种，有4000多年的栽培历史。油橄榄叶的煎剂或浸剂在地中海国家常作为糖尿病的民间用药，有一定的疗效。油橄榄叶提取物在美洲和欧洲用作膳食补充剂以增强免疫功能。现代资料表明，油橄榄叶中含有黄酮类、三萜类、糖类、列环烯醚萜类等有效成分。三萜类化合物主要是由6个异戊二烯结构单元构成，大部分为含30个碳原子的萜类化合物。油橄榄叶中三萜类成分主要包括齐墩果酸、山楂酸和熊果酸，而这三种物质结构相似，通常采用柱色谱技术将其进行分离，但反复硅胶柱色谱分离和重结晶导致最终得到的样品量很少。又由于柱色谱技术普遍存在处理周期长，连续操作性不强，不易作为分离介质用于生物活性物质的工业生产进程。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供一种从油橄榄叶中提取齐墩果酸的方法，该方法简单，周期短，得到的齐墩果酸纯度高，收率大。
本发明提供的技术方案是从油橄榄叶中提取齐墩果酸的方法，包括以下步骤：
1)将油橄榄叶粉碎后，用体积浓度为70～90％的乙醇溶液提取，将提取液过滤，取滤液减压回收乙醇，得到粗提物；
2)将粗提物加入体积浓度为50～65％乙醇溶液重新溶解，得到混合溶液；
3)将混合溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，然后采用40～50℃、0.1～0.15mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，再用68～72℃、1～1.5mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，收集第三次洗脱液，调节pH至3～5，过滤，取滤渣干燥，即得。
在步骤1)中，采用体积浓度为70～90％的乙醇溶液提取油橄榄叶，可充分提取油橄榄叶中的齐墩果酸、山楂酸以及熊果酸。油橄榄叶与乙醇溶液的料液比为1g：10～20ml。所述提取为加热回流提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～3h。
步骤2)中，采用体积浓度为50～65％的乙醇溶液溶解粗提物，可去除粗提物中极性较小的杂质，起到初步纯化的效果。加入乙醇溶液至粗提物浓度为0.06～0.10g/ml，此时上柱的吸附效果最佳。
步骤3)中，AB-8型号的大孔树脂为弱极性，平均孔径为13～14nm，比表面积为480～520m2/g。由于齐墩果酸、山楂酸、熊果酸均为弱极性物质，且具有一定的疏水性，生成氢键的能力较弱，因而易被非极性及弱极性树脂所吸附。其次，大孔吸附树脂吸附物质时，被吸附组分是通过树脂的孔径扩散到树脂孔内表面而被吸附，当树脂孔径小于吸附的有效成分分子时，有效成分分子不能进入树脂内部，只能吸附在树脂外表面，当树脂孔径大于有效成分分子时，有效成分既能吸附在树脂外表面也可吸附在内表面，对山楂酸、齐墩果酸以及熊果酸来说，其分子量分别为472、456和456，因此采用AB-8大孔树脂的吸附效果较好。树脂柱的径高比为1:3～6为宜，以1:4最佳。
齐墩果酸、山楂酸和熊果酸结构极为相似，其中熊果酸和齐墩果酸更是同分异构体，普通的柱色谱很难将其分离开来，但是本发明采用40～50℃、0.1～0.15mol/L的碳酸氢钠溶液可以与树脂中极性较大的山楂酸反应生成可溶性钠盐，进而洗脱下来，而极性偏小的齐墩果酸和熊果酸的羧基和水分子的极化能力较差，不能电离出H+，无法与碳酸氢钠进行反应生成钠盐，则留在树脂柱中。碳酸氢钠溶液的洗脱速度为1～1.5BV/h，其用量为1～1.5BV时，洗脱效果较好。
采用68～72℃、1～1.5mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，此时可以洗脱齐墩果酸，而熊果酸不被洗脱，由于齐墩果酸和熊果酸结构为同分异构体，因此，采用较快的洗脱速度2～2.5BV/h，较小的洗脱剂量为0.5～1BV，可最大程度洗脱齐墩果酸，而熊果酸不被洗脱。
本发明的方法简单、周期短，提取的齐墩果酸纯度高，收率大。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)将油橄榄叶粉碎至100目，与体积浓度为70％的乙醇溶液按料液比为1g：10ml的比例混合，加热回流提取3h，将提取液过滤，取滤液减压回收乙醇，得到粗提物；
2)将粗提物加入体积浓度为50％乙醇溶液至粗提物浓度为0.06g/ml，搅匀，得到混合溶液；
3)将混合溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1:3，先用水洗脱至无色，然后加入40℃、0.1mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，碳酸氢钠溶液的洗脱速度为1BV/h，其用量为1BV，再用68℃、1mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，洗脱速度为2BV/h，其用量为0.5BV，收集第三次洗脱液(即1mol/L的碳酸氢钠洗脱液)，调节pH至3，过滤，取滤渣干燥，即得。
根据高效液相色谱法进行测定，其纯度为99.1％，收率为93.3％。
实施例2
1)将油橄榄叶粉碎至180目，与体积浓度为90％的乙醇溶液按料液比为1g：20ml的比例混合，加热回流提取3次，每次提取时间为3h，将提取液过滤，取滤液减压回收乙醇，得到粗提物；
2)将粗提物加入体积浓度为65％乙醇溶液至粗提物浓度为0.10g/ml，搅匀，得到混合溶液；
3)将混合溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1:6，先用水洗脱至无色，然后加入50℃、0.15mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，碳酸氢钠溶液的洗脱速度为1.5BV/h，其用量为1.5BV，再用72℃、1.5mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，洗脱速度为2.5BV/h，其用量为1BV，收集第三次洗脱液(即1.5mol/L的碳酸氢钠洗脱液)，调节pH至5，过滤，取滤渣干燥，即得。
根据高效液相色谱法进行测定，其纯度为99.0％，收率为93.0％。
实施例3
1)将油橄榄叶粉碎至150目，与体积浓度为90％的乙醇溶液按料液比为1g：20ml的比例混合，加热回流提取2次，每次提取时间为2h，将提取液过滤，取滤液减压回收乙醇，得到粗提物；
2)将粗提物加入体积浓度为55％乙醇溶液至粗提物浓度为0.08g/ml，搅匀，得到混合溶液；
3)将混合溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1:4，先用水洗脱至无色，然后加入45℃、0.12mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，碳酸氢钠溶液的洗脱速度为1.2BV/h，其用量为1.2BV，再用70℃、1.35mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，洗脱速度为2.5BV/h，其用量为0.5BV，收集第三次洗脱液(1.35mol/L的碳酸氢钠洗脱液)，调节pH至4，过滤，取滤渣干燥，即得。
根据高效液相色谱法进行测定，其纯度为99.5％，收率为94.5％。
实施例4
1)将油橄榄叶粉碎至200目，与体积浓度为70％的乙醇溶液按料液比为1g：20ml的比例混合，加热回流提取3次，每次提取时间为1h，将提取液过滤，取滤液减压回收乙醇，得到粗提物；
2)将粗提物加入体积浓度为65％乙醇溶液至粗提物浓度为0.06g/ml，搅匀，得到混合溶液；
3)将混合溶液上AB-8大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1:3，先用水洗脱至无色，然后加入50℃、0.1mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，碳酸氢钠溶液的洗脱速度为1.5BV/h，其用量为1BV，再用68℃、1.5mol/L的碳酸氢钠溶液进行洗脱，洗脱速度为2BV/h，其用量为1BV，收集第三次洗脱液(即1.5mol/L的碳酸氢钠洗脱液)，调节pH至3～5，过滤，取滤渣干燥，即得。
根据高效液相色谱法进行测定，其纯度为99.0％，收率为92.8％。