本发明涉及一株链霉菌及用它制备硫化物氧化酶制剂的方法，属于生物技术与生物工程领域。
背景技术：
我国人口密度大，工业发展速度迅速，对环境治理和保护的措施与快速的工农业化和城市化发展不相协调，硫化物造成的恶臭污染十分突出。在环境中，来源于工业生产环节和生物物质的分解转化的恶臭污染成分进入大气形成严重的嗅觉污染，损伤人和动物神经、削弱食欲、加速健忘、阻滞血液循环，严重威胁生命；若存在于油、气中则造成设备和管道的严重腐蚀；有些还会随废水废物进入水体，使水质变成恶臭，直接影响了水生生物的生存，破坏了生态循环。恶臭物质广泛地存在于禽畜养殖场和水产养殖场、污水处理厂、化工厂、垃圾转运站、公共厕所及生活污水等中，恶臭在城市环境中形成了典型的社会公害。
硫化物氧化酶(Sulfide oxidase)制剂，俗称除臭酶制剂，是由特种微生物菌种在适合的条件下通过现代发酵工程制备的微生物酶制剂，这是一类具有通过氧化还原反应对恶臭硫化物进行降解的生物活性大分子。该类制品为无毒、无害，安全、高效，使用无环境二次污染及具有生物可降解性的现代生物技术产品。采用生物技术与方法治理恶臭能耗低；经生物氧化后的恶臭物质能被植物和微生物同化构成有机体的组成成分，不产生污染；生物处理条件温和，反应效率高，运行费用低；鉴于其特点生物脱臭已成为许多国家研究的热点，形成了恶臭物质治理的一个发展方向。2016年3月5号中华人民共和国国民经济和社会发展第十三个五年规划纲要提出在生态方面要发展绿色环保产业，扩大环保产品和服务供给；在产业方面要培育壮大新兴产业，改造提升传统产业，加快构建创新能力强、环境友好的现代产业新体系。鉴于硫化物氧化酶的生物属性，该产品为环境友好产品，其生产企业为绿色环保产业。
本发明专利申请的发明人栾兴社于2009年研发了一种发酵制备除臭酶制剂的方法(发明专利ZL200910015863.5)，该方法采用分离出的能产生除臭酶的兼性自养型链霉菌DS-021通过优化培养制备除臭酶制剂，获得了良好效果。对硫化物氧化酶制剂这一环境友好的环保生物制剂来说，在保持工艺科学合理和产品应用高效的前提下，在现有技术基础上进一步提高技术内涵，提高产品产量、相应降低生产与使用成本是技术产业化和产品推广应用必须攻克的技术难题和提供的技术保证。
技术实现要素：
本发明的目的是对现有菌株及现有发酵方法进行改进，本发明在现有菌株DS021的基础上，利用紫外线与硫酸二乙脂复合诱变的方法获得一株链霉菌突变体菌株。相比现有菌株，该突变体菌株具有生长速度快和产酶能力强的优势。本发明以它为生产菌株采用高密度发酵方法制备硫化物氧化酶制剂，相比现有的发酵方法，具有产酶能力强、产率高、发酵周期短、生产和使用成本低等优势。将本发明制备的硫化物氧化酶制剂应用于硫化物污水除臭处理，硫化物降解率达98.05％，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。
本发明所提供的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)DS021-Z5D2，它是由链霉菌(Streptomyces sp.)DS021为出发菌株，利用紫外线与硫酸二乙脂复合诱变的方法进行菌种诱变而获得的硫化物氧化酶高产突变体。该菌株已于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.12808。该菌株在察氏琼脂培养基上培养7d菌落直径为7.5mm(出发菌株DS021为4mm)；在伊莫松琼脂上培养7d菌落直径达9.5mm(DS021为5mm)。在淀粉酶活性平板上点种，经5d培养，透明圈直径/菌落直径达＝3.1(DS021为2.2)。因此本发明的菌株相比现有的菌株DS021具有生长速度快，产酶能力强的优势。
该菌株的普通保存采用的培养基为：高氏合成1号琼脂，具体配方为：可溶性淀粉2％，KNO3 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂粉1.5％，pH7.2-7.4。
本发明采用上述菌株制备硫化物氧化酶制剂的方法，其特征是，
(1)液体菌种培养
将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在25-40℃、150-180r/min条件下震荡培养30-46h，得液体菌种备用；
(2)高密度发酵培养
本发明的高密度发酵效果是跟据细胞生长情况、发酵底物状态等特点，通过特征性补料分批发酵得以实现的。
将液体菌种按3-6％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，进行分批发酵15-19h；然后进行补料发酵，将发酵液中的淀粉质量浓度控制在1.5-2.0％进行流加培养。
控制的发酵条件为：发酵温度28-38℃，通气比为0.25-0.8VVM，搅拌转速为200-600r/min，发酵培养时间共45-58h(包含分批发酵的15-19h)。
发酵液经测定，菌丝体干重为≥1.63g/100mL(以菌丝体干重作为菌种生长的衡量指标)，硫化物氧化酶酶活性为≥2300U/mL。
(3)将发酵液除菌体，加入其质量3％-8％的保护剂糊精，即制成液体硫化物氧化酶制剂。
液体菌种培养基的组分及用量为(g/L)：淀粉10-15，KNO3 1.5-3.0，K2HPO4 0.8-1.5，MgSO4 0.4-0.9，NaCl 0.3-0.8，CaCl2 0.5-1.0，FeSO4 0.01-0.04，玉米浆1.0-4.0，麸皮18-38。
发酵培养基的组分及用量为(g/L)：淀粉20-40，KNO3 2-5，K2HPO4 1-3，MgSO4 0.2-0.7，NaCl 0.2-0.8，CaCl2 0.5-1.0，FeSO4 0.01-0.04，MnSO4 0.02-0.07，玉米浆2-6，麸皮20-40。
发酵补料的补料液：淀粉与硝酸钾(二者的质量比为15-18：1)的水溶液。配制方法：将淀粉与硝酸钾溶于水中，在搅拌的条件下，用蒸汽加热糊化并同时灭菌，灭菌条件为0.1Mpa，25min，然后冷却至30℃备用，固形物含量一般为6％±1％。
该硫化物氧化酶的使用方法为：以液体状态直接混入含恶臭硫化物的污水或污物中。
本发明的技术效果是：本发明经过UV与DES复合诱变获得了链霉菌DS021-Z5D2优良突变株，该菌株具有生长速度快和产酶能力强等优势。采用该菌株进行高密度发酵法发酵，能够高产量生产微生物硫化物氧化酶，具有培养基质廉价易得，产酶能力强(酶活性≥2300U/mL)，发酵周期短(≤58h)，生产和使用成本低等优点。产品无毒无害、安全、高效，使用对环境友好及具有生物可降解性。将本发明制备的微生物硫化物氧化酶应用于硫化物污水除臭处理，硫化物降解率达98.05％，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的链霉菌菌株的筛选及硫化物氧化酶制剂的制备方法和使用效果进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
酶活力单位规定：在35℃、170r/min、以0.1mg/mL S-2溶液为底物、1小时氧化1μg S-2所需的酶量定义为1个酶活力单位，以U/mL(U/g)表示。S-2测定用亚甲蓝法。
实施例1
(1)菌株诱变选育
①培养基及制作
斜面培养基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，NaCl 0.5，FeSO40.01，琼脂粉15，pH7.2-7.4。
Na2S抗性培养基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1.2，K2HPO4 1.5，MgSO4 0.7，NaCl 0.6，FeSO4 0.015，K2Cr2O7 0.015，Na2S·9H2O 8，琼脂粉15。
Na2S抗性梯度平板制作：取直径9mm平皿，将8mL溶化的斜面培养基倒入平皿做底层，斜摆，凝固后，加8mL溶化的Na2S抗性培养基倒入平皿做上层，平摆，凝固后制得Na2S抗性梯度平板。
②出发菌株单孢菌悬液制备将培养7d的斜面菌种→加10mL无菌水，洗下孢子→倒入50mL含有玻璃珠的三角瓶，充分摇匀，以打散菌团→然后用无菌定性滤纸过滤→制成单孢子悬液。
③紫外线(UV)照射取单孢子悬液5mL加入直径9cm平皿，在磁力搅拌器搅拌下，用30W紫外灯于30cm距离照射90s，得UV诱变孢子悬液。
④稀释涂平板红光下操作，将UV诱变孢子悬液进行系列稀释，用10-4到10-6稀释度取0.2mL涂布Na2S抗性梯度平板，于28℃避光培养2-5d。挑取Na2S抗性强、生长快的菌株编号保存于斜面，得UV诱变菌株。
⑤硫酸二乙脂(DES)诱变按上述方法将UV诱变菌株斜面加无菌水制成单孢悬液。取250mL三角瓶，加入磷酸缓冲液15mL和单孢子悬液5mL，加入0.5％的DES，于35℃、160r/min条件下震荡反应30min，加1mL25％的硫代硫酸钠终止反应。然后进行系列稀释，分别取10-4到10-6稀释度用0.2mL稀释液涂布Na2S抗性梯度平板，于28℃培养2-5d。挑取生长快的DES诱变菌落编号保存于斜面，得UV与DES复合诱变株DS021-Z5D2。
(2)菌株鉴定
该菌株的培养特征为：具有基内菌丝、气生菌丝，气生菌丝在生长后期形成直形或波曲形的孢子丝，孢子丝成熟后分化成大量孢子。基内菌丝分泌可溶性色素，生长的培养基不同分泌的色素颜色各不相同，如在高氏1号合成培养基上为杏黄色，在察氏培养基上为黄昏灰色，而在伊莫松琼脂上为鲜艳的橙皮黄颜色。气生菌丝及孢子丝的颜色在马玲薯浸汁琼脂上为鸥灰色，而在伊莫松琼脂上为茧白色。菌株生长速度快，在察氏琼脂培养基上培养7d菌落直径为7.5mm(出发菌株DS021为4mm)；在伊莫松琼脂上表现出最快的生长速度，培养7d菌落直径达9.5mm(DS021为5mm)。
该菌株的生理生化特征为：淀粉酶合成代谢旺盛，在淀粉酶活性平板上点种，经5d培养，透明圈直径/菌落直径达＝3.1(DS021为2.2)；对牛奶凝固与胨化能力强；能利用纤维素生长；不产生硫化氢。淀粉、阿拉伯糖与木糖为最佳利用碳源，酵母提取物为最佳利用有机氮，硝酸钾、碳酸氢铵为最佳利用无机氮。
该菌株16SrDNA序列测定结果如下(SEQ-1)：
ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGGGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAAGCCCTTCGGGGTGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGG。
该菌株已于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.12808。
实施例2
(1)液体菌种培养
将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在35℃、180r/min条件下震荡培养38h，得液体菌种备用；
液体菌种培养基的组分及用量为(g/L)：淀粉12，KNO3 2.5，K2HPO4 1.5，MgSO40.6，NaCl 0.5，CaCl2 0.7，FeSO4 0.015，玉米浆2.5，麸皮28。
(2)高密度发酵培养
发酵培养基的组分及用量为(g/L)：淀粉37，KNO3 2.5，K2HPO4 1.6，MgSO4 0.6，NaCl0.4，CaCl2 0.6，FeSO4 0.01，MnSO4 0.025，玉米浆3，麸皮30。
发酵补料的补料液：将56.5g淀粉与3.5g硝酸钾溶于1000mL水中，在搅拌的条件下，用蒸汽加热糊化并同时灭菌，灭菌条件为0.1Mpa，25min，然后冷却至30℃备用。
将液体菌种按3.5％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，进行分批发酵18h。然后进行补料发酵，将淀粉质量浓度控制在1.5-2.0％进行流加培养。控制的发酵条件为：温度35℃、通气比为0.35VVM、搅拌转速为550r/min、发酵培养时间共52h。
发酵液经测定，菌丝体干重为1.69g/100mL，硫化物氧化酶酶活性为2385U/mL。
对照：以菌株DS021为菌种，采用ZL200910015863.5中实施例1的方法获得发酵液，菌丝体干重为0.87g/100mL，硫化物氧化酶酶活性为1250U/mL。
可见，本发明的菌丝体干重和产酶效率比原出发菌株DS021分别提高了94.3％和90.8％，效果改进明显。
(3)将发酵液除菌体，加入其质量5％的保护剂糊精，即制成液体硫化物氧化酶制剂。
实施例3：对含恶臭硫化物污水的处理
将制备的微生物硫化物氧化酶应用于吸收塔含恶臭硫化物原水(含硫化物966mg/L)进行处理，硫化物氧化酶的使用量为20000U/L原水，于35℃反应1h，酶氧化的结果是：每L原水硫化物降解负荷为947.2mg，硫化物降解率为98.05％。
实施例4
液体菌种培养基、发酵培养基及补料液同实施例2。
(1)液体菌种培养
将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在32℃、160r/min条件下震荡培养40h，得液体菌种备用；
(2)高密度发酵培养
将液体菌种按3.8％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，进行分批发酵19h。然后进行补料发酵，将淀粉质量浓度控制在1.5-2.0％进行流加培养。控制的发酵条件为：温度32℃、通气比为0.40VVM、搅拌转速为500r/min、发酵培养时间54h。
菌丝体干重为≥1.63g/100mL，硫化物氧化酶酶活性为≥2300U/mL。
(3)将发酵液除菌体，加入其质量4.5％的保护剂糊精，即制成液体硫化物氧化酶制剂。
实施例5
液体菌种培养基、发酵培养基及补料液同实施例2。
(1)液体菌种培养
将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在36℃、170r/min条件下震荡培养39h，得液体菌种备用；
(2)高密度发酵培养
将液体菌种按3.6％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，进行分批发酵18h。然后进行补料发酵，将淀粉质量浓度控制在1.5-2.0％进行流加培养。控制的发酵条件为：温度36℃、通气比为0.32VVM、搅拌转速为500r/min、发酵培养时间50h。
菌丝体干重为≥1.63g/100mL，硫化物氧化酶酶活性为≥2300U/mL。
(3)将发酵液除菌体，加入其质量4.8％的保护剂糊精，即制成液体硫化物氧化酶制剂。